来源：Biosynthesis of optically pure D-lactic acid from mixed sugars and undetoxified corn stover hydrolysate by metabolically engineered Escherichia coli consortium（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素生物质转化为高附加值生物产品是农业废弃物增值的可持续路径。光学纯D-乳酸（D-LA）因可用于可生物降解聚合物而备受关注，但碳分解代谢物阻遏（CCR）限制了混合糖的利用效率。本研究基于前期工作，将特异性利用木糖的工程大肠杆菌XL15与葡萄糖利用菌株GL10构建菌群。XL15在混合糖中不利用葡萄糖，木糖利用率达88.64%，是亲本菌株BL21(DE3)的5.43倍。摇瓶实验中D-LA滴度2.37 g/L，光学纯度100%。添加中和剂后，菌群实现100%葡萄糖利用、95.49%木糖利用和6.85 g/L D-LA产量。在非脱毒玉米秸秆水解液中产量达6.9 g/L，5 L生物反应器放大后滴度达72.95 g/L。
研究背景
在环境可持续背景下，农工业残渣作为生产生物燃料和化学品的原料日益受到关注。木质纤维素生物质可转化为多种产品，包括生物燃料和高价值化学品。乳酸（LA）包含L-乳酸和D-乳酸两种对映体形式，在食品饮料工业中用作防腐剂和pH调节剂。聚乳酸（PLA）在包装、纺织和生物医药领域有广泛应用。将聚L-乳酸（PLLA）和聚D-乳酸（PDLA）混合形成的立体复合物具有更高的结晶度和熔点，是高性能PLA材料的重要研究方向。D-乳酸的掺入比例和立体复合物组装方式直接调控立体复合物的降解周期，为PLA材料在包装、医疗和高端工程领域的性能定制提供核心支撑，但这要求对映体具有极高的光学纯度。因此，生产高纯度D-LA是高价值PLA制造的关键前提。目前乳酸合成途径可分为化学合成和生物合成两类，其中化学合成依赖……
研究方法
2.1 培养基
Luria-Bertani（LB）培养基用于菌株培养和种子液制备，每升含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L氯化钠。LB固体培养基（补充15 g/L琼脂）中加入抗生素（硫酸卡那霉素终浓度50 μg/mL和盐酸壮观霉素终浓度100 μg/mL）作为选择培养基。M9培养基用于摇瓶实验和发酵研究，其组分为6.8 g/L磷酸氢二钠、3.4 g/L磷酸二氢钾、1 g/L氯化铵和0.5 g/L氯化钠，并补充硫酸镁（终浓度2 mM）、氯化钙（0.1 mM）和0.1%微量元素母液（2.4 g/L FeCl₃·6H₂O、0.15 g/L CuCl₂·2H₂O、0.075 g/L H₃BO₃、0.3 g/L ZnCl₂、0.3 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.495 g/L MnCl₂·4H₂O、0.3 g/L CoCl₂·6H₂O）。微量元素母液通过0.22 μM滤膜过滤除菌，分装至无菌EP管中，−20℃保存。在生物反应器进行的发酵实验中，培养基配制为葡萄糖和木糖初始浓度各60 g/L，并补充20 g/L酵母提取物。LB和M9培养基在121℃灭菌，葡萄糖和木糖在108℃灭菌，时间均为30 min。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；M9（6.8 g/L Na₂HPO₄、3.4 g/L KH₂PO₄、1 g/L NH₄Cl、0.5 g/L NaCl）；抗生素：卡那霉素50 μg/mL、壮观霉素100 μg/mL；灭菌温度：LB/M9为121℃、糖为108℃；灭菌时间：30 min；生物反应器培养基：葡萄糖60 g/L、木糖60 g/L、酵母提取物20 g/L
2.2 菌株与质粒构建
本实验使用的初始菌株为大肠杆菌BL21(DE3)、前期构建的利用葡萄糖的代谢工程大肠杆菌GL10和利用木糖的代谢工程大肠杆菌XL12（Tan et al., 2026）。本研究基于XL12，利用CRISPR-Cas9（Jiang et al., 2015）敲除三个基因（ptsG、mglB和galP），构建了新的利用木糖的菌株XL15。工程菌株中的基因敲除信息见表1。被敲除基因的功能和作用见表S1。基因敲除过程中使用的所有sgRNA序列均从ChopChop网站（https://chopchop.cbu.uib.no）获取。基因敲除方法遵循我们前期的研究（Tan et al., 2026）。简言之，使用引物ptsG-F1和ptsG-R1通过PCR获得含有靶向20 bp sgRNA序列的DNA片段pTarget-ptsG。线性化质粒与靶DNA片段连接后转化至DH5α中扩增，获得重组质粒pTarget-ptsG。靶向基因对应的具体sgRNA序列见表S2。供体DNA片段首先使用引物ptsG-F2、ptsG-R2、ptsG-F3和ptsG-R3获得ptsG基因的上下游同源臂，然后通过重叠延伸PCR生成。将质粒和供体DNA电转化后，使用引物ptsG-yz和ptsG-R3进行菌落PCR和测序，以确认靶基因是否成功敲除。PCR所用引物见表S3。mglB和galP基因的敲除方法与上述相同。
【数据】菌株：BL21(DE3)、GL10、XL12、XL15；敲除基因：ptsG、mglB、galP；方法：CRISPR-Cas9；sgRNA来源：ChopChop网站；感受态细胞：DH5α；原文未详述电转化参数
2.3 摇瓶发酵
#### 2.3.1 菌株XL15的摇瓶发酵
将菌株BL21(DE3)和XL15接种至LB液体培养基中，37℃、200 rpm振荡培养8 h。随后将种子液转移至50 mL无菌离心管中，6000 rpm离心5 min收集菌体。去除上清后，用无菌去离子水洗涤菌体三次并重悬制备接种液。将种子液接种至补充葡萄糖和木糖各5 g/L的M9培养基中，工作体积150 mL。菌株初始OD₆₀₀调整为0.1。在37℃、150 rpm微需氧环境下于培养箱中培养。每12 h取样一次，使用分光光度计测定600 nm处光密度（OD₆₀₀）。糖浓度和D-LA滴度通过高效液相色谱（HPLC）测定。D-乳酸产率使用公式（1）计算，糖酸转化率使用公式（2）计算，生产强度使用公式（3）计算。所有实验均设三个平行。
(1) 产率(g/g) = D-乳酸浓度 / 消耗糖浓度
(2) 糖酸转化率(%) = D-乳酸滴度 / 消耗糖浓度 × 100%
(3) 生产强度(g/L/h) = D-乳酸滴度 / 发酵时间
【数据】接种量：初始OD₆₀₀=0.1；培养温度：37℃；摇床转速：200 rpm（种子）、150 rpm（发酵）；种子培养时间：8 h；离心条件：6000 rpm、5 min；工作体积：150 mL；葡萄糖：5 g/L；木糖：5 g/L；取样间隔：12 h；平行数：3
#### 2.3.2 菌群的摇瓶发酵
将菌株BL21(DE3)、GL10和XL15的种子液接种至含葡萄糖和木糖各5 g/L的M9培养基中，工作体积150 mL。初始OD₆₀₀为0.2。GL10与XL15的生物量接种比例设为1:1。在37℃、150 rpm条件下培养。每12 h取样测定OD₆₀₀。糖浓度和D-LA滴度通过HPLC测定。
【数据】菌株：BL21(DE3)、GL10、XL15；初始OD₆₀₀：0.2；接种比例：GL10:XL15=1:1；温度：37℃；转速：150 rpm；葡萄糖：5 g/L；木糖：5 g/L；工作体积：150 mL；取样间隔：12 h
#### 2.3.3 GL10和XL15的D-乳酸耐受性测试
将工程菌株GL10和XL15分别接种至含葡萄糖和木糖混合碳源（各5 g/L）的M9培养基中，并分别添加0、2.5、5和10 g/L D-LA。初始OD₆₀₀调整为0.1，在37℃、150 rpm条件下培养。每12 h取样测定OD₆₀₀以监测细菌生长。所有实验均设三个平行。
【数据】菌株：GL10、XL15；D-LA添加浓度：0、2.5、5、10 g/L；葡萄糖：5 g/L；木糖：5 g/L；初始OD₆₀₀：0.1；温度：37℃；转速：150 rpm；取样间隔：12 h；平行数：3
#### 2.3.4 菌群pH调节发酵
将菌株GL10和XL15的种子液接种至初始葡萄糖和木糖浓度各5 g/L的M9培养基中。在37℃、150 rpm条件下培养。由于菌群积累的D-LA在12 h时将培养基pH降至4.6–4.8，在12 h时加入6 M KOH将培养基pH调节至大肠杆菌的最适生长条件。每12 h收集样品测定OD₆₀₀并进行HPLC分析。所有实验均设三个平行。
【数据】菌株：GL10、XL15；葡萄糖：5 g/L；木糖：5 g/L；温度：37℃；转速：150 rpm；pH降至：4.6–4.8（12 h）；中和剂：6 M KOH；取样间隔：12 h；平行数：3
#### 2.3.5 高木糖条件下菌群发酵
M9培养基中总糖浓度设为10 g/L，包括2.5 g/L葡萄糖和7.5 g/L木糖。将菌株GL10和XL15以1:1的生物量比例接种，使初始OD₆₀₀达到0.2。在37℃、150 rpm条件下培养。每12 h取样测定OD₆₀₀。糖浓度和D-LA滴度通过HPLC测定。
【数据】总糖：10 g/L；葡萄糖：2.5 g/L；木糖：7.5 g/L；接种比例：GL10:XL15=1:1；初始OD₆₀₀：0.2；温度：37℃；转速：150 rpm；取样间隔：12 h
#### 2.3.6 菌群利用非脱毒玉米秸秆水解液发酵
非脱毒玉米秸秆水解液由武汉新华扬生物股份有限公司赠送。预处理采用蒸汽爆破。操作温度和反应时间为保密数据。酶解通过向反应混合物中加入商业纤维素酶Cellic CTec3®（Novozymes，丹麦）进行。酶用量为40 FPU/g底物。反应在50℃、150 rpm条件下进行30 h。玉米秸秆水解液中葡萄糖和木糖组分通过HPLC分析（表S4）。水解液中总酚含量采用Folin-Ciocalteu法以没食子酸为参照测定。将玉米秸秆水解液加入M9培养基中，调节葡萄糖和木糖终浓度各约5 g/L。将菌株GL10和XL15以1:1的生物量比例接种至培养基中，初始OD₆₀₀为0.2。培养物在37℃、150 rpm条件下于摇瓶中培养。由于D-乳酸在发酵24 h内将培养基pH降至4.6–4.8，在24 h后加入6 M KOH至终浓度60 mM。每12 h收集样品，通过HPLC分析糖浓度和D-LA滴度。所有实验均设三个平行。
【数据】水解液来源：武汉新华扬生物股份有限公司；预处理：蒸汽爆破（温度和时间保密）；酶：Cellic CTec3®；酶用量：40 FPU/g底物；酶解条件：50℃、150 rpm、30 h；葡萄糖：约5 g/L；木糖：约5 g/L；接种比例：GL10:XL15=1:1；初始OD₆₀₀：0.2；温度：37℃；转速：150 rpm；中和剂：6 M KOH、终浓度60 mM（24 h后加入）；取样间隔：12 h；平行数：3
2.4 生物反应器放大发酵实验
采用菌群进行分批发酵……
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 重组大肠杆菌XL15的构建与表征
已有报道表明，敲除葡萄糖利用相关基因可增强木糖利用效率（Long et al., 2017; Wang et al., 2014）。为缓解葡萄糖存在下CCR导致的木糖利用不足问题，需要完全阻断葡萄糖转运系统。在我们前期研究中，尽管敲除了ptsI和glk，大肠杆菌XL12对木糖的利用不足仍然阻碍了混合糖中D-LA产量的提高（Tan et al., 2026）。本研究中，基于XL12的基因型，通过敲除磷酸转移酶系统（PTS）中的ptsG基因以及非PTS系统中的mglB和galP基因，成功构建了利用木糖的菌株XL15（图S1）。菌落PCR确认靶基因成功敲除（图S2和表S5）。XL15的副产物生成也受到显著抑制，包括琥珀酸、甲酸、乙酸和乙醇（图S3）。与亲本大肠杆菌BL21(DE3)相比，最大琥珀酸产量为0.25 g/L。XL15中甲酸、乙酸和乙醇的产量分别降低了100%、91.67%和100%。敲除ΔfrdA、ΔpflB、ΔpoxB、Δpta和ΔadhE可减少包括琥珀酸、甲酸、乙酸和乙醇在内的副产物生成（Zhou et al., 2011b）。琥珀酸形成未被完全抑制可能是由于XL15中木糖利用增强的磷酸戊糖途径通量导致NADP⁺增加，从而引起琥珀酸积累（Christodoulou et al., 2018; Yang and Zhou, 2024）。为表征XL15在混合糖中的木糖利用性能，测定了生长、糖利用和D-LA合成情况，结果如图1所示。随着葡萄糖摄取途径的阻断，XL15在葡萄糖和木糖混合存在下表现出生长延迟（图1A）。大肠杆菌BL21(DE3)在12 h进入稳定期，而XL15表现出延长的对数期，在60 h进入稳定期。有趣的是，48 h后XL15的生长优于亲本菌株。值得注意的是，XL15在混合糖中表现出与BL21明显不同的糖利用偏好。BL21(DE3)在12 h内快速消耗葡萄糖，但木糖利用很差（图1B和图1C）。葡萄糖耗尽后，72 h时共消耗13.78%的木糖。相反，XL15不利用葡萄糖，但在混合糖中表现出高效的木糖利用能力。发酵进行72 h时，残余木糖为0.62 g/L，木糖利用率达88.64%，是大肠杆菌BL21(DE3)菌株的5.43倍。与我们前期构建的菌株XL12相比，XL15的木糖利用率显著提高了32.07%（Tan et al., 2026）。对混合糖中D-LA生产进行了时间过程分析（图1D）。在混合糖中发酵12 h时，BL21(DE3)达到最大D-LA产量2.50 g/L，与葡萄糖几乎完全耗尽同时发生。此后D-LA滴度迅速下降，60 h后检测不到D-LA。XL15发酵36 h时，观察到D-LA产量可忽略不计。然而，36 h后随着混合糖中木糖的有效消耗，D-LA滴度迅速增加。XL15在发酵72 h时达到D-LA滴度2.37 g/L，产率0.54 g/g。菌株XL15产生的D-LA光学纯度为100%（表S6）。XL15中的木糖消耗与其生长密切相关。其在葡萄糖和木糖混合存在下的生长性能优于BL21(DE3)。由于XL15完全缺乏葡萄糖利用能力，只能通过木糖代谢维持活力。木糖通过磷酸戊糖途径（PPP）代谢，产生的中间体对核酸、氨基酸和辅酶的生物合成至关重要（Seregina et al., 2025）。相比之下，BL21(DE3)主要通过糖酵解利用葡萄糖。在糖酵解早期，一部分葡萄糖-6-磷酸（G6P）通过氧化磷酸戊糖途径（oxPPP）转化为核酮糖-5-磷酸（Ru5P）。Ru5P随后通过非氧化磷酸戊糖途径（non-oxPPP）产生细胞生长所需的关键代谢中间体（Rashida and Laxman, 2021）。相比之下，木糖通过PPP生成细胞生长相关中间体更为直接，这可能解释了XL15比BL21(DE3)更好的生长性能。这些结果表明，高效木糖利用可作为XL15生长和代谢的主要碳源和能源。先前研究报道，敲除葡萄糖转运相关基因可增强木糖利用效率。Zhang等（Zhang et al., 2024）提出敲除ptsG、galP和mglB会降低葡萄糖利用效率同时增强木糖利用效率，这与我们的发现一致。亲本菌株BL21(DE3)由于D-乳酸氧化酶的存在无法稳定积累D-LA（Zhou et al., 2011a）。敲除dld基因使XL15能够积累D-LA作为目标产物。总体而言，我们成功构建了一株在葡萄糖存在下专一利用木糖的工程菌株XL15。该菌株有望与我们前期开发的葡萄糖专一性菌株GL10组合，形成更高效的菌群。
【数据】菌株：XL15；敲除基因：ptsG、mglB、galP；副产物最大琥珀酸：0.25 g/L；甲酸降低：100%；乙酸降低：91.67%；乙醇降低：100%；BL21(DE3)进入稳定期：12 h；XL15进入稳定期：60 h；BL21(DE3)木糖消耗：13.78%（72 h）；XL15残余木糖：0.62 g/L（72 h）；XL15木糖利用率：88.64%；较BL21(DE3)提高：5.43倍；较XL12提高：32.07%；BL21(DE3)最大D-LA：2.50 g/L（12 h）；XL15 D-LA滴度：2.37 g/L（72 h）；XL15产率：0.54 g/g；光学纯度：100%
3.2 GL10-XL15菌群混合糖发酵性能分析
基于菌株GL10和XL15的碳源偏好，成功构建了菌群。由于GL10的存在，菌群在发酵12 h后进入稳定期（图2A）。糖利用曲线表明（图2B和图2C），菌群在12 h几乎完全消耗5 g/L葡萄糖，而木糖利用在整个培养期间极低或检测不到。相比之下，对照菌株BL21(DE3)不仅耗尽5 g/L葡萄糖，还利用了18.44%的木糖。关于代谢产物生产（图2D），亲本菌株BL21(DE3)在12 h产生2.22 g/L D-LA。然而，产物随时间被持续消耗，48 h时几乎检测不到D-LA。菌群在12 h积累了4.2 g/L D-LA。与单一菌株XL15在混合糖培养基中培养相比，D-LA积累时间提前，滴度提高了77.22%。D-LA滴度直至发酵结束72 h几乎保持不变。结合上述结果，推测XL15在大肠杆菌菌群中未参与木糖代谢，因此未能表现出预期的木糖利用功能。关于菌株XL15在菌群中未能利用木糖的原因，除了CCR的潜在调控作用外，我们测定了12 h的培养基pH，发现培养基pH在4.6–4.8范围内。同时，最大D-LA积累出现在12 h，而木糖未被利用。文献报道，当环境pH降至5.0以下时，大肠杆菌的正常生长受到严重抑制（Li et al., 2020）。因此，D-LA的积累可能抑制了菌群的发酵性能。
【数据】菌群进入稳定期：12 h；葡萄糖消耗：5 g/L（12 h完全消耗）；BL21(DE3)木糖利用：18.44%；BL21(DE3) D-LA：2.22 g/L（12 h）；菌群D-LA：4.2 g/L（12 h）；较XL15提高：77.22%；培养基pH：4.6–4.8（12 h）；发酵时间：72 h
3.3 pH对大肠杆菌发酵过程的影响及其调控
#### 3.3.1 评估指定菌株的耐酸性
为阐明D-LA积累对菌株的抑制作用……
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功构建了工程大肠杆菌XL15菌株，能够在非脱毒玉米秸秆水解液的混合糖中特异性利用木糖，生产光学纯D-LA。D-LA的快速积累显著降低了菌群中XL15的活性。通过引入中和剂，含GL10和XL15的菌群性能得以恢复，实现了葡萄糖耗尽和木糖几乎完全利用，并生产高光学纯度D-LA。重要的是，该菌群能够在非脱毒玉米秸秆水解液中有效利用可发酵碳源生产D-LA，极大提高了直接利用粗木质纤维素水解液的技术可行性。在放大实验中，通过分批发酵实现了72.95 g/L的D-LA滴度、1.35 g/L/h的生产强度和0.84 g/g的产率。总体而言，本研究为木质纤维素生物质混合糖增值为高光学纯度D-LA建立了一条绿色高效的生物工艺。
编译者解读：该研究采用代谢分工策略——葡萄糖专一菌株GL10与木糖专一菌株XL15组成菌群，巧妙绕开了CCR对混合糖利用的束缚，这是合成生物学中"分工协作"理念的典型应用。菌群在非脱毒水解液中直接发酵的能力降低了预处理成本，具有工业化潜力。但菌群发酵对pH控制依赖较强，D-LA积累迅速抑制XL15活性，中和剂的引入虽解决了问题，却增加了工艺复杂度。此外，放大实验中接种比例、溶氧等关键参数的优化空间仍值得进一步探索。
参考来源
期刊：Industrial Crops and Products, 2026
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.123847
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.123847