来源：Identification and characterization of a novel α-L-fucosidase from Desertivirga arenae for efficient L-fucose biosynthesis in metabolically engineered Escherichia coli（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-岩藻糖是一种具有重要生理功能的单糖，广泛存在于多种生物质资源中。代谢工程微生物系统因产量高、可工业放大而备受关注。本研究从沙漠微生物 Desertivirga arenae 中鉴定了一种新型α-L-岩藻糖苷酶（GenBank: WP_207534398.1），该酶在pH 7.0、30 °C下活性最佳，基因尺寸仅1314 bp。将其导入产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌底盘MGC064后，摇瓶培养L-岩藻糖产量达5.58 g/L，为可持续L-岩藻糖生产提供了有潜力的候选酶。
研究背景
L-岩藻糖在自然界中很少以游离形式存在，但它是糖蛋白、糖脂和多糖的重要组成成分。岩藻糖基化过程将GDP-L-岩藻糖上的L-岩藻糖转移至各种底物，是生命各域中的关键修饰。L-岩藻糖的商业与健康价值显著：它构成褐藻多糖（如岩藻聚糖）的骨架，也是人乳寡糖（HMOs）的关键构建单元。近年来，游离L-岩藻糖本身因其直接生理效应而受到关注——塑造健康肠道菌群、减轻炎症、调节脂质代谢，并在缺血/再灌注损伤和先天性疾病治疗中展现潜力。其安全性已获认可，不仅作为化妆品抗衰老成分获批，还向制药和功能食品领域拓展。
目前L-岩藻糖主要从褐藻中提取，但多步工艺产量较低；以葡萄糖等廉价糖为原料的化学合成因复杂度高、效率低和环境污染而难以放大。因此，代谢工程微生物系统成为有吸引力的替代方案。在生物合成途径中，α-L-岩藻糖苷酶催化L-岩藻糖形成的末端步骤。本研究报道了一种来自 Desertivirga arenae 的新型α-L-岩藻糖苷酶的鉴定与表征。
研究方法
2.1 基因表达
编码 D. arenae α-L-岩藻糖苷酶的DNA序列与C端6×His标签框内融合，由上海Generay Biotech公司定制合成，并亚克隆至pET−22b(+)载体的NdeI和XhoI位点之间。所得表达质粒通过转化导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。挑取单个转化菌落，在37 °C（200 rpm振荡）下于4 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养。随后将种子培养液以1%（v/v）比例转接至200 mL新鲜含氨苄青霉素的LB培养基中，在相同条件下培养至菌液密度（OD₆₀₀）达到0.6–0.8。通过添加1 mM IPTG诱导目标蛋白表达，培养物在16 °C下继续生长12 h。
【数据】菌株：E. coli BL21(DE3)；载体：pET−22b(+)；标签：C端6×His；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素；诱导剂：1 mM IPTG；诱导温度：16°C；诱导时间：12h；种子培养温度：37°C；转速：200 rpm；OD₆₀₀：0.6–0.8；转接比例：1%（v/v）
2.2 重组 D. arenae α-L-岩藻糖苷酶的纯化
蛋白纯化全程在4 °C下进行。将200 mL细菌培养液离心（8000 × g，10 min，4 °C）后收集菌体沉淀，重悬于15 mL裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）中。通过超声破碎实现细胞裂解（30 min，2 s脉冲，3 s间隔，4 °C）。离心（12,000 × g，20 min，4 °C）去除不溶性碎片后，将澄清裂解液通过预先用结合缓冲液（50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）平衡的Ni-NTA柱。用含50 mM咪唑的缓冲液（组成同结合缓冲液）洗涤去除未结合物质，随后用补充500 mM咪唑的缓冲液洗脱His标签酶。洗脱液依次透析——先对50 mM Tris-HCl（pH 7.5）加10 mM EDTA透析，再对不含EDTA的相同缓冲液透析——以去除咪唑和金属离子。蛋白定量采用Bradford法，以BSA为参照，纯化结果通过SDS-PAGE监测。
【数据】纯化温度：4°C；离心条件1：8000 × g，10 min，4°C；裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5；重悬体积：15 mL；超声条件：30 min，2 s脉冲/3 s间隔，4°C；离心条件2：12,000 × g，20 min，4°C；洗涤咪唑浓度：50 mM；洗脱咪唑浓度：500 mM；透析1：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）+ 10 mM EDTA；透析2：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）；定量方法：Bradford法，BSA参照
2.3 同源建模与结构验证
目标α-L-岩藻糖苷酶的同源建模使用SWISS-MODEL在线服务器完成。将目标蛋白的氨基酸序列提交至SWISS-MODEL进行模板搜索和自动模型构建。基于功能相关性、序列相似性、比对覆盖度和模板质量，选择来自 Bacteroides fragilis 的α-L-岩藻糖苷酶作为结构模板。生成的模型进一步使用SAVES v6.1评估，包括PROCHECK进行Ramachandran图分析、ERRAT评估非键合原子相互作用、VERIFY3D评估三维模型与氨基酸序列的兼容性。根据整体结构质量和验证分数选择最终模型，用于后续结构分析。
【数据】建模服务器：SWISS-MODEL；结构模板：Bacteroides fragilis α-L-岩藻糖苷酶；验证工具：SAVES v6.1（PROCHECK、ERRAT、VERIFY3D）；原文未详述其他参数
2.4 酶活测定与动力学分析
酶活测定在含有80 μL 10 mM对硝基苯基-α-L-吡喃岩藻糖苷（pNPα-L-Fuc）和20 μL稀释纯化α-L-岩藻糖苷酶的50 mM磷酸缓冲液（pH 7.0）反应体系中进行。反应在35 °C下进行10 min，通过加入100 μL 1 M碳酸钠溶液终止。释放的pNP量在OD405 nm下使用Tecan Infinite 200 Pro微孔板读数仪测定。一个酶活单位（U）定义为在指定条件下每分钟产生1 μmol pNP所需的酶量。动力学分析中，在优化反应条件下使用0.1至10 mM不同浓度的pNPα-L-Fuc测定初始反应速率。控制反应时间和酶浓度以确保所测速率代表初速度。Km和Vmax值通过将初速度数据拟合至Michaelis-Menten方程获得。kcat值基于Vmax值和纯化酶的摩尔浓度计算，催化效率以kcat/Km表示。
【数据】底物：pNPα-L-Fuc；底物体积：80 μL；底物浓度：10 mM；酶液体积：20 μL；缓冲液：50 mM磷酸缓冲液，pH 7.0；反应温度：35°C；反应时间：10 min；终止液：100 μL 1 M Na₂CO₃；检测波长：OD405 nm；仪器：Tecan Infinite 200 Pro；动力学底物浓度范围：0.1–10 mM；单位定义：1 U = 1 μmol pNP/min
2.5 pH、温度和金属离子的影响
酶活首先在固定温度30 °C下评估不同pH条件，覆盖3.0–9.0范围。使用三种缓冲液（各100 mM）：柠檬酸钠用于pH 3.0–6.0，磷酸钠用于pH 6.0–8.0，Tris-HCl用于pH 8.0–9.0。另外，在pH 7.0下研究20 °C至45 °C之间的温度最适值，每5 °C测量一次。两组实验中，最高记录活性设为100%，其余数据相应归一化。为测试金属离子和EDTA的影响，每种物质以1 mM单独补充至反应体系中。测试种类包括Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Na⁺、K⁺和Al³⁺。无任何补充时观察到的活性视为基线（100%），所有其他活性与之比较。
【数据】pH范围：3.0–9.0；pH缓冲液：100 mM柠檬酸钠（pH 3.0–6.0）、100 mM磷酸钠（pH 6.0–8.0）、100 mM Tris-HCl（pH 8.0–9.0）；pH测定温度：30°C；温度范围：20–45°C；温度间隔：5°C；温度测定pH：7.0；金属离子/EDTA浓度：1 mM；测试离子：Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Na⁺、K⁺、Al³⁺
2.6 热稳定性
为评估温度对 Desertivirga arenae α-L-岩藻糖苷酶稳定性的影响，将纯化酶在50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中分别于35 °C、40 °C和45 °C孵育长达1小时。定期取样并立即在冰上冷却10 min以停止进一步热效应。随后在标准测定条件下测量剩余催化活性。活性保留率通过将每个处理样品与未处理对照（定义为100%活性）比较计算。
【数据】孵育温度：35°C、40°C、45°C；缓冲液：50 mM磷酸钠，pH 7.0；孵育时间：最长1h；冷却条件：冰上10 min；对照：未处理样品（100%）
2.7 代谢工程大肠杆菌生物合成L-岩藻糖
本研究采用先前建立的工程化大肠杆菌MG1655衍生菌株MGC064作为L-岩藻糖生产宿主。该菌株能够从甘油高效从头生物合成2′-FL。具体而言，该菌株携带多个基因组整合修饰：敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ以防止乳糖水解并重定向代谢流；将乳糖通透酶基因lacY、GDP-L-岩藻糖生物合成基因簇cpsG-cpsB和gmd-fcl的天然启动子替换为强组成型启动子PJ23119以增强乳糖摄取和GDP-L-岩藻糖供应；整合四拷贝α-1,2-岩藻糖基转移酶基因BKHT，每个由PJ23119启动子驱动；额外过表达多药外排转运蛋白基因mdfA以改善产物输出和菌株稳健性。负责L-岩藻糖分解的内源分解代谢操纵子（由编码L-岩藻糖异构酶的fucI和编码L-岩藻酮糖激酶的fucK组成）被基因敲除。pET−22b(+)载体内的T7启动子被替换为组成型启动子PJ23119。随后，编码不同α-L-岩藻糖苷酶的基因通过同源重组分别插入该修饰载体，产生多个重组质粒。这些质粒通过化学转化分别导入MGC064菌株以生成相应的L-岩藻糖生产菌株。挑取在琼脂平板上生长正常的菌落，接种至4 mL LB培养基中，37 °C过夜培养制备一级种子液。将2%（v/v）一级种子液转接至100 mL发酵培养基中。培养物在37 °C下生长至OD600约0.6，此时降温至25 °C继续培养72 h。发酵培养基由与先前描述相同的甘油限定配方组成[23]，补充20 g/L甘油和5 g/L酵母提取物。发酵培养基补充100 μg/mL氨苄青霉素以在整个培养过程中维持质粒稳定性。L-岩藻糖定量参照已报道方法进行。
【数据】宿主菌株：E. coli MG1655衍生菌株MGC064；敲除基因：lacZ、wcaJ、fucI、fucK；启动子替换：lacY、cpsG-cpsB、gmd-fcl → PJ23119；整合基因：4拷贝BKHT（PJ23119驱动）；过表达基因：mdfA；载体：pET−22b(+)（T7→PJ23119）；种子液体积：4 mL LB；种子培养温度：37°C；转接比例：2%（v/v）；发酵体积：100 mL；发酵温度：37°C→25°C；发酵时间：72h；甘油浓度：20 g/L；酵母提取物：5 g/L；氨苄青霉素：100 μg/mL；诱导OD600：约0.6
研究结果
3.1 多种已报道α-L-岩藻糖苷酶的同源分析
α-L-岩藻糖苷酶是糖苷水解酶，从寡糖和糖缀合物上移除末端α-L-岩藻糖基残基。在CAZy数据库中，它们主要属于GH29（EC 3.2.1.51）和GH95（EC 3.2.1.63等）家族，采用不同的催化机制。GH29 α-L-岩藻糖苷酶通过双置换反应使用保留机制，涉及共价糖基-酶中间体，能够水解各种类型的L-岩藻糖苷键。除水解外，它们还催化转糖基化，将切割的岩藻糖基残基转移至非水的含羟基受体。相反，GH95酶作为反转型糖苷酶，通过单置换（直接置换）机制进行水解，尤其以作用于α-(1,2)-连接岩藻糖基残基而闻名。GH29家族α-L-岩藻糖苷酶已从广泛微生物中鉴定，如 Paenibacillus thiaminolyticus（iso1 [24]和iso2 [25]两种同工酶）、Pedobacter sp. CAU209 [26]、Flavobacterium algicola 12076 [27]、Bifidobacterium castoris LMG30937 [28]、Truepera sp. [29]、Tannerella forsythia ATCC 43037 [30]、Bacteroides fragilis NCTC9343 [31]和 Thermotoga maritima [32]。相比之下，GH95 α-L-岩藻糖苷酶研究较少，已表征成员来自 Bifidobacterium bifidum JCM1254 [33]、Aspergillus oryzae [34]和 Arabidopsis thaliana [35]。本研究从 Desertivirga arenae 中鉴定了一种新型α-L-岩藻糖苷酶，GenBank登录号WP_207534398.1。所选α-L-岩藻糖苷酶的氨基酸序列相似性矩阵如图1所示。
基于序列相似性分析，这些α-L-岩藻糖苷酶主要可分为两组。D. arenae α-L-岩藻糖苷酶与其他所选GH29 α-L-岩藻糖苷酶通常共享20%以上同一性。值得注意的是，它与 Pedobacter sp. 的α-L-岩藻糖苷酶同一性最高（56.12%），其次与 Mycoplasmopsis mali（M. mali）、Elizabethkingia anophelis（E. anophelis）、Shinella endbachense（S. endbachense）、B. fragilis 和 P. melaninogenica 的同一性分别为54.23%、52.63%、51.96%、50.47%和50.23%。三种GH95 α-L-岩藻糖苷酶之间共享约30%同一性，但与所有GH29 α-L-岩藻糖苷酶同一性低于20%。有趣的是，P. thiaminolyticus α-L-岩藻糖苷酶iso2与所有GH95 α-L-岩藻糖苷酶及其他GH29成员同一性均低于20%。为进一步阐明 D. arenae α-L-岩藻糖苷酶在GH29家族中的进化关系，使用来自不同细菌来源的代表性GH29 α-L-岩藻糖苷酶（包括若干已生化表征的酶）进行了系统发育分析。D. arenae α-L-岩藻糖苷酶与来自 Pedobacter sp. 和 E. anophelis 的α-L-岩藻糖苷酶紧密聚类，表明这些酶可能共享相对较近的共同进化起源。该系统发育关系与成对序列比较一致，其中 D. arenae 酶在分析的GH29成员中与 Pedobacter sp. 和 E. anophelis 的酶氨基酸序列相似性最高。D. arenae α-L-岩藻糖苷酶与其他已报道α-L-岩藻糖苷酶的氨基酸序列比对如图2A所示。
二级结构元件基于 B. fragilis NCTC 9343 α-L-岩藻糖苷酶的晶体结构（PDB ID: 9EU1）指定。根据序列比对，D. arenae α-L-岩藻糖苷酶的关键催化残基完全保守：Asp204作为催化亲核试剂负责亲核攻击，Glu257作为通用酸/碱残基负责糖苷键的质子化和去质子化。此外，位于底物结合口袋中并与底物糖环形成氢键的所有关键氨基酸残基，包括Asn242、Trp202、Phe43、Tyr147、Trp288、His45、Glu56、Trp57、His104和His105，也完全保守（图2B）。这些保守残基对维持酶的整体折叠、底物特异性和催化活性至关重要。系统发育分析将 D. arenae 酶置于GH29家族内，与来自 Pedobacter sp. 和 E. anophelis 的α-L-岩藻糖苷酶聚类最近（图1）。GH29酶通常采用保守的双结构域折叠，包括催化(β/α)8-桶和C端β-三明治结构域[36]。虽然催化亲核试剂和底物结合残基完全保守，但GH29成员间酸/碱残基位置和表面环区的变异可能导致pH最适值、温度最适值和热稳定性的差异[36]。不同α-L-岩藻糖苷酶间催化中心和底物结合残基的高度保守性表明这些酶共享相似的催化机制和结构基础，与GH29的典型特征一致。
【数据】GenBank登录号：WP_207534398.1；最高同一性：56.12%（Pedobacter sp.）；其他同一性：54.23%（M. mali）、52.63%（E. anophelis）、51.96%（S. endbachense）、50.47%（B. fragilis）、50.23%（P. melaninogenica）；GH95间同一性：约30%；GH95与GH29间同一性：<20%；催化亲核试剂：Asp204；通用酸/碱：Glu257；底物结合残基：Asn242、Trp202、Phe43、Tyr147、Trp288、His45、Glu56、Trp57、His104、His105；结构模板PDB ID：9EU1
3.2 D. arenae α-L-岩藻糖苷酶的表达与纯化
Desertivirga arenae 的α-L-岩藻糖苷酶基因被克隆至pET−22b(+)并在大肠杆菌BL21(DE3)中由T7启动子控制表达，C端6×His标签使其可通过镍亲和色谱纯化。根据其氨基酸序列，该酶的理论分子量计算为50.6 kDa。SDS-PAGE上观察到的表观分子量略微增加可能归因于C端6×His标签，其增加约0.8 kDa。更重要的是，SDS-PAGE是估计方法而非精确分子量测定；蛋白质的电泳迁移率可受缓冲液组成、凝胶浓度、pH和温度等多种因素影响。鉴于观察到的条带落在预期范围内（45–60 kDa），这一微小差异不影响目标蛋白的鉴定或本研究的主要结论。成功的表达和纯化通过SDS-PAGE确认（图3）。
目标条带（约50 kDa）随IPTG诱导时间增强；在16 °C下12 h后，观察到与预期大小匹配的显著条带。经超声裂解、离心和一步镍亲和色谱后，重组酶纯化至均一，SDS-PAGE显示亚基质量约50 kDa。大多数GH29 α-L-岩藻糖苷酶由约440个残基组成，亚基分子量约50 kDa [24,26,27,29,36]。然而，P. thiaminolyticus α-L-岩藻糖苷酶iso2亚基质量为76.8 kDa，来自 Bifidobacterium castoris 的SUMO/His标签酶质量为70.36 kDa [28]。更大的例子是来自 Dichostereum sordulentum 的α-L-岩藻糖苷酶，质量为92.688 kDa [37]。在GH95家族酶中，B. bifidum α(1,2)-L-岩藻糖苷酶全长含1959个氨基酸，其活性结构域位于残基577至1474之间[33]。该结构域常作为特异性α(1,2)-L-岩藻糖苷酶在代谢工程菌株中从2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）生产L-岩藻糖[17]。此外，A. oryzae α(1,2)-L-岩藻糖苷酶含785个氨基酸，预测分子量78 kDa；然而在 Pichia pastoris X−33中表达时，由于广泛N-糖基化，重组酶显示约150 kDa的表观质量[34]。
【数据】载体：pET−22b(+)；表达菌株：E. coli BL21(DE3)；启动子：T7；标签：C端6×His；理论分子量：50.6 kDa；His标签增加：约0.8 kDa；SDS-PAGE表观分子量：约50 kDa；预期范围：45–60 kDa；诱导条件：16°C，12h；对比：P. thiaminolyticus iso2为76.8 kDa；B. castoris SUMO/His为70.36 kDa；D. sordulentum为92.688 kDa；B. bifidum GH95全长1959 aa（活性域577–1474）；A. oryzae含785 aa，预测78 kDa，P. pastoris中表观150 kDa
3.3 pH和温度对酶活的影响
pH对酶活的影响在30 °C下使用pNPα-L-Fuc作为底物评估。通过定量pNP释放监测水解，覆盖pH 3.0–9.0范围，使用三种不同的100 mM缓冲液：柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0–6.0）、磷酸钠缓冲液（pH 6.0–8.0）和Tris-HCl（pH 8.0–9.0）。如图4A所示，
（原文此处节选截断，后续结果内容未提供）
【数据】测定温度：30°C；底物：pNPα-L-Fuc；pH范围：3.0–9.0；缓冲液：100 mM柠檬酸钠（pH 3.0–6.0）、100 mM磷酸钠（pH 6.0–8.0）、100 mM Tris-HCl（pH 8.0–9.0）；原文此处节选截断，后续数据未详述
讨论与解读
本研究鉴定并表征了一种来自 D. arenae 的新型GH29 α-L-岩藻糖苷酶，具有优良的生化特性：最适pH 7.0、最适温度30 °C，基因尺寸仅1314 bp。在工程化大肠杆菌底盘MGC064中表达后，该酶能够从2′-FL生物合成L-岩藻糖，摇瓶培养产量达5.58 g/L。虽然该产量低于基准酶AfcA在类似条件下的最高报道值，但 D. arenae α-L-岩藻糖苷酶在本研究测试的五种新鉴定酶中表现出最佳综合性能。该酶热稳定性数据显示35 °C半衰期为29.51 min，40 °C为7.74 min，45 °C为5.60 min。其活性受Cu²⁺和Fe²⁺强烈抑制，而Mn²⁺、Ca²⁺和Mg²⁺仅产生可忽略的刺激效应。这些发现表明该酶是通过蛋白质工程、表达增强和更全面表征进一步开发和优化的潜在候选者，以充分评估其在可持续L-岩藻糖生产中的适用性。
编译者解读：该研究从沙漠微生物资源中挖掘新型α-L-岩藻糖苷酶，核心价值在于基因尺寸小（1314 bp）且生化性质清晰，便于在工程菌中表达调控。5.58 g/L的摇瓶产量虽不及AfcA基准，但考虑到未进行发酵优化和蛋白工程改造，提升空间可观。局限在于热稳定性偏弱（45 °C半衰期仅5.60 min）且对Cu²⁺/Fe²⁺敏感，工业发酵中需注意培养基金属离子控制。未来可针对酸/碱残基和表面环区进行定向进化以提升热稳定性。
参考来源
期刊：Enzyme and Microbial Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110949
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110949