来源：Brevetoxin biosynthesis in Karenia brevis in relation to light, growth phase, and across the cell cycle（Harmful Algae）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
短凯伦藻（Karenia brevis）是佛罗里达沿岸有害藻华的主要肇事者，每细胞可合成皮克级短裸甲藻毒素（brevetoxin, PbTx）。毒素合成如何与细胞生长、分裂耦联，此前尚不清楚。本研究以实验室培养为体系，通过两个互补实验——27小时昼夜周期实验与多周光照/生长阶段实验——追踪了细胞体积、DNA含量、叶绿素a、光合效率、毒素配额及rbcL转录本的变化。结果显示，细胞分裂集中在“黎明”前4.5小时内同步完成，毒素配额在白天后期S期前后小幅上升、夜间分裂前达到峰值，分裂后回落至G1水平；毒素配额仅受生长阶段影响，不受光照水平影响，且与rbcL表达呈正相关。
研究背景
短凯伦藻藻华几乎每年在西佛罗里达沿岸发生，常造成区域生态与经济影响。大型藻华有时持续数年（如2017–2019年藻华），通过藻体腐烂导致的缺氧或通过短裸甲藻毒素暴露，造成多营养级生物大量死亡。短裸甲藻毒素是一类作用于电压门控钠通道的强效神经毒素，由短凯伦藻产生。因此，该物种既因其频繁形成大规模藻华而具有生态意义，也因其产毒能力而备受关注。过去70年积累了关于短凯伦藻生物学与生态学的海量研究，涵盖细胞生物学、营养生理生态、行为生态等多个方向。生物种群的生长需要反复的细胞生物合成与细胞周期运转，但短裸甲藻毒素的分子生物合成如何与细胞生物合成及细胞周期相耦联，至今未知。本研究通过两个互补实验，探索短裸甲藻毒素生物合成与细胞生物合成（以细胞生物体积、生长速率、DNA和叶绿素a为代理指标）之间的联系。
研究方法
2.1 藻株与培养条件
昼夜实验使用短凯伦藻FWC1010，该非无菌藻株于2016年从美国佛罗里达州Bayboro Harbor（27.7598 N, −82.6313 W）分离获得。生长阶段/光照水平实验同样使用FWC1010，并额外使用非无菌藻株FWC126，后者于2006年从美国佛罗里达州Stump Pass以西约5海里处（26.8871 N, −82.4406 W）分离获得。为简洁起见，下文将这两株培养物简称为FWC1010和FWC126。保种培养物维持于组织培养处理的聚苯乙烯培养瓶（Corning, USA）中，温度22.5°C，静态12:12光暗周期，由冷白光LED（XP-G2, CREE Inc., Durham, NC, USA）提供60–70 µmol photons m−2 s−1的标量PAR辐照度，LED由恒流驱动器供电。培养基由0.45 µm过滤（Polycap HD, Whatman PLC, Maidstone, UK）并高压灭菌的亚热带近岸海水组成，高压灭菌前用去离子水调节盐度至35，高压灭菌后加入GSe/2营养盐，包括土壤提取物（Blackburn et al., 2001）。
【数据】藻株：K. brevis FWC1010、FWC126；温度：22.5°C；光暗周期：12:12；PAR辐照度：60–70 µmol photons m−2 s−1；盐度：35；过滤孔径：0.45 µm
2.2 昼夜实验
#### 2.2.1 实验设置
实验在温控步入式培养室中进行，温度维持在22.9 ± 0.15 °C。光照由一组8盏LED灯（每盏含12个XP-G2 LED）提供，驱动电流1.3A，12:12光暗周期。光照期包括4小时渐升、4小时全辐照度和4小时渐降。标量辐照度用校准的LiCor PAR传感器测量，并通过Li-1400数据记录仪（LiCor, USA）连续记录24小时。培养瓶位置的辐照度水平约为400–600 µmol photons m−2 s−1（距光源约90 cm），该水平被选择为既能饱和生长又仅需最小PSII下调（Tilney et al., 2019），从而最大化分裂细胞比例（因而需要短裸甲藻毒素分配/合成），同时最小化高光胁迫对细胞的未知可能影响。实验开始前6天，用100 mL指数期培养物接种三个含700 mL GSe/2培养基的1 L培养瓶。这些培养瓶置于实验渐升辐照度下。通过光镜计数Lugol's固定样品监测细胞浓度。实验期开始前1天，每个保种瓶分成2等份，每份用150 mL新鲜GSe/2培养基稀释（总稀释度约27%），然后每个分装体积先单独匀质化，再通过在两瓶间轻柔交换体积将配对瓶混合。随后，将100 mL等分试样分配到75 cm²“处理”组织培养瓶（共30瓶）。采用独立重复而非重复测量方法，以避免反复取样对培养瓶内细胞的影响（Estrada and Berdalet, 1998）。30个独立培养瓶转回培养箱，在预定义光场中随机排列，静置约1天后开始实验取样。
【数据】温度：22.9 ± 0.15 °C；LED灯：8盏，每盏12个XP-G2 LED；驱动电流：1.3A；光暗周期：12:12；辐照度：400–600 µmol photons m−2 s−1；距光源：约90 cm；接种体积：100 mL；培养基体积：700 mL；稀释培养基：150 mL；总稀释度：约27%；分装体积：100 mL；培养瓶：75 cm²，共30个；预静置时间：约1天
#### 2.2.2 实验取样
初始取样于下午12:30开始，相当于光照期开始后4.5小时（授时时间，ZT4.5），即正午最大辐照度达到后半小时（正午辐照度出现在12:00至16:00之间）。此后每3小时取样一次，直到第二天下午5:00（ZT9），每次取三个新鲜培养瓶，分别用于细胞数量、细胞体积、细胞形态、细胞周期、叶绿素a、FV/FM和短裸甲藻毒素分析。用于光镜细胞计数和Coulter细胞体积的样品，取1 mL培养物用Lugol's碘液固定（终浓度约2%，中性pH），4 °C保存。取5 mL等分试样用Lugol's碘液固定，用于实验后FlowCam®分析。用于细胞周期分析的样品，取约10 mL用1%戊二醛固定，4 °C保存。用于叶绿素a分析的样品，取3 mL浓缩到GF/F滤膜（Whatman, Cytiva, USA）上，然后置于铝箔袋中冷冻。用于短裸甲藻毒素分析的样品，取5 mL浓缩到PVDF滤膜（HVLP 25mm, Millipore Sigma, USA）上，在2 mL聚丙烯冻存管中于−80 °C冷冻。仅对于Coulter计数器、FlowCam®和流式细胞术分析，每个培养瓶在初始取样后1.5小时再次取样，共产生20个时间点，以更深入地了解实验过程中短凯伦藻大小和丰度的变化。
【数据】初始取样时间：12:30 pm（ZT4.5）；取样间隔：每3小时；最终取样：第二天5:00 pm（ZT9）；光镜/Coulter固定：1 mL，Lugol's碘液约2%终浓度，4 °C；FlowCam®固定：5 mL Lugol's碘液；细胞周期固定：约10 mL，1%戊二醛，4 °C；叶绿素a：3 mL，GF/F滤膜；毒素分析：5 mL，PVDF滤膜，−80 °C；额外取样：初始取样后1.5小时；总时间点：20个
#### 2.2.3 光镜细胞计数
从所有取样时间点（n=10，间隔3小时），将1 mL Lugol's碘液固定样品通过上下吹打数次匀质化，然后转移100 µL至Nageotte血细胞计数板的4个独立计数室进行计数。细胞计数在四份平行子样品上进行，总体至少计数258个细胞（每个子样品计数15至50 µL，对应每室3、6或10行）。该策略使瓶内计数的平均变异系数为9.9%。本实验测定了两种光镜生长速率：一种为实验前期间（传代培养生长），一种为实验期间。实验前速率通过对细胞计数自然对数与时间（天）的斜率进行线性回归确定。由于从相位化种群（测量频率高于每24小时一次）计算每日生长速率时使用斜率存在问题（相位化分裂的时间安排会产生偏差），因此改用两点计算法，选择最能代表1天期间分裂前和分裂后时间点的两个点。
【数据】计数室：Nageotte血细胞计数板4室；每份体积：100 µL；子样品数：4；最低计数细胞数：258；每子样品计数体积：15–50 µL；每室行数：3、6或10；瓶内计数变异系数：9.9%；时间点数：10个，间隔3小时
#### 2.2.4 Coulter计数器
将500 µL或1 mL Lugol's固定样品稀释到9 mL 35 PSU过滤高压灭菌近岸海水中。将稀释样品的三个连续500 µL子样品通过Z2 Coulter计数器（Beckman Coulter, Indianapolis, USA）的100 µm孔径计量。所有每测量体积的事件用于估算中位细胞生物体积（µm³）。
【数据】样品体积：500 µL或1 mL；稀释液：9 mL 35 PSU过滤高压灭菌海水；子样品：3 × 500 µL；孔径：100 µm；仪器：Z2 Coulter Counter
#### 2.2.5 FlowCam
培养样品使用FlowCam® VS-lII C B3（Yokogawa Fluid Imaging Technologies, Scarborough, Maine, USA）分析。分析前，将5 mL Lugol's固定培养体积（存于15 mL离心管）通过上下吹打混合，然后手动上样至仪器。分析使用10×光学物镜，每个样品成像阈值设为2100个细胞/颗粒（20个时间点各3个独立培养瓶），流速0.15 mL min−1，颗粒捕获（到最近邻距离）8 µm，分割阈值（颗粒对背景的对比度）设为14，自动图像速率20帧/秒。每次运行之间用MilliQ水冲洗。使用VisualSpreadsheet®软件分选颗粒大小并创建分类器来分类细胞方向，即腹/背视图、侧面视图、顶/反顶视图，以及与胞质分裂相关的双联体出现。整个细胞周期中细胞体积变化的可视化和推断基于明确处于腹/背视图的颗粒，颗粒的细胞体积（V）基于椭球形状拟合，使用公式V= π/6 × a × b × c，其中“a”和“b”由FlowCam®的面积基直径给出，“c”假设为直径的一半，以考虑短凯伦藻细胞背腹压缩的事实。
【数据】仪器：FlowCam® VS-lII C B3；物镜：10×；成像阈值：2100细胞/颗粒；时间点：20个；每时间点培养瓶：3个；流速：0.15 mL min−1；颗粒捕获距离：8 µm；分割阈值：14；自动图像速率：20帧/秒；固定样品体积：5 mL；离心管：15 mL；公式：V= π/6 × a × b × c
#### 2.2.6 流式细胞术
戊二醛保存样品（终浓度1%）轻柔涡旋、倒置、弹击10次，用移液器混合3次，然后等分用于核酸染色。等分样品随后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI, Thermo-Fisher Scientific）染色至终浓度0.25 µg mL−1，室温暗处孵育一小时。细胞周期分析使用Attune NxT流式细胞仪（Thermo-Fisher）进行。
【数据】固定剂：1%戊二醛；DAPI终浓度：0.25 µg mL−1；孵育：室温、暗处、1小时；仪器：Attune NxT流式细胞仪
研究结果
3.1 昼夜实验
昼夜实验所用接种物的比生长速率在实验前五天内为0.48 d−1。短凯伦藻细胞丰度在27小时实验期间显著增加（图1A，单因素方差分析，F9,20= 6.55，P < 0.05），在ZT19.5至ZT22.5（夜间）之间最为明显，但事后Tukey检验（含Bonferroni多重比较校正）表明，细胞数量的增加仅在达到第二天ZT1.5时间点后才显著。第一天前三个取样时间点（ZT4.5、ZT7.5和ZT10.5）之间未观察到细胞丰度的显著差异。为从Nageotte血细胞计数板光镜计数估算实验期间的日生长速率，我们以图1a为参考，选择前四个时间点（第一天ZT4.5、ZT7.5、ZT10.5、ZT16.5）和最后三个时间点（第二天ZT1.5、ZT4.5、ZT7.5）分别代表平均分裂前和分裂后种群；而使用FlowCam®的生长速率（补充图1）则选择前五个时间点（第一天ZT4.5、ZT7.5、ZT10.5、ZT13.5、ZT16.5）和最后三个时间点（第二天ZT1.5、ZT4.5、ZT7.5）分别代表平均分裂前和分裂后种群。27小时实验期间的比生长速率经Nageotte血细胞计数板计数估算为0.47 d−1，经FlowCam®计数估算为0.48 d−1。中位细胞生物体积用Coulter计数器测量。十个时间点中每个培养瓶的中位测量细胞数为1,481 ± 415（± S.D.，n=30）。中位细胞生物体积呈现明显的周期性日变化模式（图1B）。该模式包括白天体积翻倍、夜间有丝分裂时减半。具体而言，中位细胞生物体积在黄昏前（ZT10.5）达到最大值4,050 ± 52 µm³（S.D.，n=3），然后在夜间前半段保持稳定直至ZT19.5，此后中位细胞生物量在3小时内减半，在开灯时（ZT0）达到最小值1,974 ± 126 µm³（S.D.，n=3）。值得注意的是，第10和第90百分位数也显示同样的昼夜动态。
【数据】接种物比生长速率：0.48 d−1（实验前5天）；实验期间比生长速率：0.47 d−1（Nageotte计数）、0.48 d−1（FlowCam®）；ANOVA：F9,20= 6.55，P < 0.05；中位测量细胞数：1,481 ± 415（± S.D.，n=30）；最大中位生物体积：4,050 ± 52 µm³（S.D.，n=3），ZT10.5；最小中位生物体积：1,974 ± 126 µm³（S.D.，n=3），ZT0
所有测量PbTx同系物（PbTx-1、-2、-3、-7、氧化-PbTx-2）总和的平均细胞内配额在16.4 ± 1.9 pg cell−1至32.0 ± 6.1 pg cell−1之间变化（图1C）。昼夜周期中毒素谱无变化，PbTx-1和-2的平均比例分别为17 ± 1%和80 ± 1%（± S.D.），PbTx-3、-7和氧化-PbTx-2 ≤ 1%。细胞毒素配额的昼夜模式与细胞生物体积不同。在白天（ZT0–ZT12），总细胞内毒素配额在ZT10.5（天黑前1.5小时）开始显示一定增加，到ZT13.5大幅增加，在ZT19.5达到峰值（32.0 ± 6.1 pg cell−1），然后在ZT19.5至ZT22.5之间迅速下降至18.6 ± 1.1 pg cell−1，然后在第二天ZT1.5达到昼夜最低值（16.4 ± 1.9 pg cell−1）。使用时间点ZT1.5和ZT4.5估算分裂后基线短裸甲藻毒素配额（17.9 ± 1.7 pg PbTx cell−1），使用时间点ZT16.5和ZT19.5估算分裂前最大短裸甲藻毒素配额（31.7 ± 0.5 pg PbTx cell−1），估计78 ± 16%的种群在分裂前毒素配额翻倍（假设没有细胞产生超过两倍）。该比例相当于以短裸甲藻毒素为代理的细胞生长速率0.57 ± 0.09 d−1 S.D.。总叶绿素a cell−1在昼夜周期中遵循与总细胞内PbTx浓度相同的模式，即叶绿素a cell−1在分裂后不久（如ZT1.5）处于最低值，仅在白天后期（ZT7.5和ZT10.5）才开始积累。与毒素类似，使用时间点ZT1.5和ZT4.5估算分裂后基线叶绿素a cell−1配额（8.8 ± 2.1 pg chlorophyll-a cell−1），使用时间点ZT16.5和ZT19.5估算分裂前最大叶绿素a cell−1配额（15.0 ± 2.6 pg chlorophyll-a cell−1），估计71 ± 15%的种群在分裂前叶绿素a配额翻倍（假设没有细胞产生超过两倍）。该比例相当于以叶绿素a为代理的细胞生长速率0.53 ± 0.09 d−1 S.D.。PSII最大量子产率（FV/FM）在白天中期（ZT4.5、ZT7.5）显示最低值约0.4，在黄昏后不久（ZT13.5）显示最高值约0.5（图1E）。整个夜间FV/FM有轻微下降趋势，其中在ZT22.5时FV/FM达到中间值约0.45。
【数据】总PbTx配额范围：16.4 ± 1.9至32.0 ± 6.1 pg cell−1；PbTx-1比例：17 ± 1%；PbTx-2比例：80 ± 1%；PbTx-3、-7、氧化-PbTx-2：≤ 1%；峰值时间：ZT19.5（32.0 ± 6.1 pg cell−1）；最低值：第二天ZT1.5（16.4 ± 1.9 pg cell−1）；分裂后基线PbTx：17.9 ± 1.7 pg PbTx cell−1；分裂前最大PbTx：31.7 ± 0.5 pg PbTx cell−1；翻倍种群比例：78 ± 16%；PbTx代理生长速率：0.57 ± 0.09 d−1；分裂后基线叶绿素a：8.8 ± 2.1 pg chlorophyll-a cell−1；分裂前最大叶绿素a：15.0 ± 2.6 pg chlorophyll-a cell−1；叶绿素a翻倍种群比例：71 ± 15%；叶绿素a代理生长速率：0.53 ± 0.09 d−1；FV/FM最低：约0.4（ZT4.5、ZT7.5）；FV/FM最高：约0.5（ZT13.5）；ZT22.5 FV/FM：约0.45
通过使用FlowCam®仪器对Lugol's固定细胞进行图像分析，进一步探索了细胞丰度、形态和体积的变化。细胞丰度遵循标准光镜观察到的模式（比较图1A与补充图1）。尽管每个时间点总共成像6300个细胞（每个重复2100个），但在过滤选择腹-背视图细胞后，每个时间点剩余700至1800个细胞（重复合计）用于支持理解细胞形态和细胞体积趋势（图2 A-E）。细胞体积显示出与基于Coulter计数器的体积在昼夜周期中相似的整体模式，即白天增加、夜间有丝分裂时减少（图1B、2）。具体而言，观察到最大细胞体积的时间点（中位数= 6,259 µm³）出现在白天结束时（ZT10.5），而最小值（中位数= 3,557 µm³）在黎明前后（ZT0）观察到。形态上，大多数细胞双联体在ZT16.5至ZT0之间观察到，以ZT21出现的最大值（约12%）为中心。与细胞生物合成和细胞周期相关的细胞大小和形态变化在ZT10.5、ZT18、ZT21和ZT0进一步示例于图2B-E。
【数据】每时间点成像细胞数：6300（每重复2100）；过滤后细胞数：700–1800；最大细胞体积中位数：6,259 µm³（ZT10.5）；最小细胞体积中位数：3,557 µm³（ZT0）；双联体最大比例：约12%（ZT21）；双联体观察时段：ZT16.5–ZT0
流式细胞术用于测量DNA含量（以DAPI荧光检测的c值报告）、叶绿素a荧光和细胞形状/大小的变化，这些均可有助于表征种群中的细胞周期（图3）。在所有时间点均观察到DAPI荧光的双峰分布，差异约2倍，因此DAPI荧光量可用于解释细胞周期各阶段（图3A）。第一个峰对应G1期细胞，第二个峰对应G2+M期细胞，而这两个峰之间的中间状态代表S期细胞。实验开始时，在ZT4.5，大多数细胞（88.3% ± 0.9 S.D.）处于G1期。然后，在ZT4.5至ZT15-16.5之间（跨越10.5-12小时），种群中细胞通过S期，S期细胞峰值比例在ZT10.5达到26.8%（± 1.4 S.D.）。该总体估计表明，基于细胞在ZT4.5开始S期、随后在ZT9/ZT10.5检测到G2+M细胞，单个细胞的S期持续约4.5-6小时。细胞在ZT9/ZT10.5开始进入G2+M期，在ZT19.5达到峰值（50.4%细胞 ± 2.6 S.D.），到ZT0恢复到分裂后基线水平。因此，基于从ZT9/10.5开始、在ZT21分裂后检测到G1细胞首次增加，单个细胞的G2+M期合计估计持续约10.5–12小时。DAPI荧光面积与高度的双标图——分别指每个细胞的峰值DAPI荧光信号高度和从整个细胞测量的积分总荧光——使我们能够进一步区分M期与G2期，表现为荧光高度降低但总荧光面积维持（图3C）。解析G2+M内的该亚群使我们能够确定有丝分裂始于ZT18、止于ZT0，跨越6小时。对于单个细胞，有丝分裂估计发生在3小时窗口内。
【数据】G1期比例（ZT4.5）：88.3% ± 0.9 S.D.；S期峰值比例：26.8% ± 1.4 S.D.（ZT10.5）；S期持续时间：约4.5-6小时；G2+M峰值比例：50.4% ± 2.6 S.D.（ZT19.5）；G2+M持续时间：约10.5-12小时；有丝分裂时段：ZT18至ZT0，跨越6小时；单个细胞有丝分裂窗口：3小时
讨论与解读
短凯伦藻是佛罗里达大规模有害藻华的著名肇事者，也是已知仅有的两种每细胞产生皮克级短裸甲藻毒素的凯伦藻之一，另一种是K. cristata。藻华规模和毒素生物合成都是生态重要性状，通过共享的生理学以及细胞和藻华的生长与死亡相联系。本研究通过两个互补实验——一个在昼夜时间尺度、另一个在多周时间尺度——评估了细胞周期、细胞生物合成、光合作用与短裸甲藻毒素生物合成之间的关系，为该物种的短裸甲藻毒素合成提供了新见解，并使得与其他甲藻产生的毒素进行比较成为可能。第一个实验中昼夜毒素合成与细胞周期的模式为第二个实验奠定了基础，后者进一步解析了光照水平和生长阶段对毒素配额及RuBisCO基因（rbcL）表达的作用。总体而言，这些实验突出了不同藻株和时间尺度下细胞生物体积、生长速率和毒性的变异性，对理解环境中短凯伦藻的生长和毒性具有重要意义。在昼夜实验中，比生长速率在实验期间保持稳定（0.47–0.48 d−1），与接种物实验前速率（0.48 d−1）一致，表明实验条件支持稳健生长。约55–60%的种群在黎明前4.5小时内同步完成有丝分裂，细胞生物体积在白天增加、夜间分裂时减半。毒素配额的变化模式与生物体积不同——在白天后期S期前后小幅上升，夜间分裂前达到峰值，分裂后回落至G1水平。第二个实验表明，仅生长阶段而非光照水平影响细胞短裸甲藻毒素配额，说明降低的生长速率并不必然导致毒素配额增加。与昼夜细胞周期实验一致，这表明短裸甲藻毒素配额受与细胞周期进程相关联的过程调控。短裸甲藻毒素配额与rbcL表达之间的正相关关系暗示了蛋白核与毒素生产之间的联系。
编译者解读：该研究将毒素合成锚定到细胞周期时间轴上，为理解甲藻产毒的细胞生物学基础提供了新框架。方法上，独立培养瓶设计避免了重复取样干扰，FlowCam与流式细胞术联用实现了形态-周期-毒素的并行追踪。局限在于仅两株藻、实验室条件，且毒素调控的分子机制（如rbcL与毒素合成的因果链）尚未验证。对合成生物学而言，若能将毒素基因簇与细胞周期元件耦联表达，或可实现异源宿主中的周期化产毒，但甲藻基因组的复杂性仍是主要障碍。
参考来源
期刊：Harmful Algae, 2026
DOI: 10.1016/j.hal.2026.103175
DOI: 10.1016/j.hal.2026.103175