来源：A hybrid kinetic–machine learning framework for PHA biosynthesis prediction（Digital Chemical Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
塑料污染危机催生了对可降解替代品的迫切需求。聚羟基脂肪酸酯（PHA）作为微生物合成的生物聚酯，虽性能优异却受制于高昂生产成本。本研究构建了一个底物-菌株无关的混合预测框架，将基于质量平衡的动力学机理模型（DPM）与机器学习（ML）相结合，仅凭五个可实测的发酵状态变量即可精准预测细胞生物量和PHA浓度。人工神经网络（ANN）模型在未见实验数据上R²>0.95，并以开源软件形式发布，为菌株-底物筛选和数字孪生发酵提供了有力工具。
研究背景
全球每年生产超过4亿吨塑料，而有效回收率不足10%，这一危机推动了可降解替代品的研发热潮。PHA是由微生物合成的聚酯家族，在营养胁迫（通常为氮或磷限制）且碳源过剩的条件下，以胞内碳源和能量储存颗粒的形式积累。PHA的热塑性可与聚丙烯和聚乙烯媲美，却能在土壤、海洋和堆肥环境中完全生物降解。已有超过300种细菌被报道可积累PHA至细胞干重的90%，包括Cupriavidus necator、Pseudomonas putida、Azohydromonas australica、Burkholderia cepacia和Haloferax mediterranei等著名生产菌株。均聚物聚-3-羟基丁酸酯（PHB）研究最为广泛，而共聚物如PHBV则具有更优的机械柔韧性。
然而，PHA的商业化受制于高昂生产成本——估计为4–8美元/公斤，而传统聚烯烃不足1.5美元/公斤。微生物菌株和碳源底物的选择直接影响成本，但针对新菌株-底物组合的实验探索资源消耗巨大。本研究旨在开发一种底物-菌株无关的稳健混合框架，结合动态质量平衡动力学机理模型与机器学习，预测任意菌株-底物组合的发酵性能——即细胞生物量和PHA浓度。
研究方法
本预测建模研究的目标是开发新型底物-菌株无关的AI模型，具体为人工神经网络（ANN）和随机森林（RF），用于PHA系统。模型结合DPM生成的数据（嵌入机理理解）与LLM挖掘的文献数据（增强模型稳健性和泛化能力）。最终AI模型基于两个发酵输出——细胞生物量浓度和PHA浓度——的预测精度/稳健性进行筛选。模型输入为五个表征任意时间点发酵状态的特征：时间、起始底物浓度、起始氮浓度、当前底物浓度和当前氮浓度（所有浓度单位为g/L，时间单位为小时）。
材料与方法
PHA发酵遵循两阶段范式：营养平衡条件下的生长阶段，随后是营养限制下的PHA积累阶段。PHA积累由必需营养物（最常见为氮或磷）的限制触发，此时碳源仍过量，形成代谢瓶颈并将乙酰-CoA通量转向PHA合成而非细胞生长。
发酵罐中PHA生物合成的营养培养基由三种溶液加入维生素混合液组成。第一种溶液（培养基1）含50 ml蒸馏水、KH₂PO₄（2.3 g）和Na₂HPO₄·2H₂O（2.9 g）。第二种溶液（培养基2）含920 ml蒸馏水、NH₄Cl（1 g）、MgSO₄·7H₂O（0.5 g）、CaCl₂·2H₂O（0.01 g）、MnCl₂·4H₂O（0.005 g）、NaVO₃·H₂O（0.005 g）、微量元素（5 ml）和琼脂（20 g）。第三种溶液（培养基3）含20 ml蒸馏水和柠檬酸铁铵（0.05 g）。三种溶液与5 ml维生素溶液混合。100 ml维生素溶液含核黄素（10 mg）、硫胺素-HCl·2H₂O（50 mg）、烟酸（50 mg）、吡哆醇-HCl（50 mg）、泛酸钙（50 mg）、生物素（0.1 mg）、叶酸（0.2 mg）和维生素B12（1 mg）。整体溶液在121°C下高压灭菌15分钟，然后冷却。
在制备的培养基上生长的种子培养物，以碳基底物（如葡萄糖、果糖、乙酸钠、植物油或甘油）和氮基营养物（硫酸铵）为底物，在室温下于好氧生物反应器（带空气鼓泡的搅拌罐发酵罐，具pH/DO控制）中培养3天。反应器出口进入另一个反应器，在氮限制条件下进行饥饿处理以生物合成胞内PHA。
细胞生物量通过OD₆₀₀定期监测，终点取样（t = 36 h）时以干细胞重（DCW）进行重量法定量。PHA含量通过酸性甲醇解后气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）对冻干生物量进行测定，PHA滴度（g/L）计算为DCW × PHA含量。使用两个序贯补料分批反应器：第一个反应器在正常营养条件下培养菌体，第二个反应器在氮限制条件下使菌体饥饿。
图1显示了培养或饥饿细菌的生物反应器管道和仪表图（P&ID）。图1包含两个容器：第一个容器（发酵罐1）作为培养阶段以促进微生物生物量增长，第二个容器（发酵罐2）作为PHA积累器。从生物质提取的糖、维生素溶液和三种营养培养基合并后与微生物培养物一起进入发酵罐1。氧气和氮气供应通过专用流量控制器调节，以控制培养过程中的通气和气体组成。培养液从发酵罐1转移到发酵罐2，在受控条件下额外供应碳源（如糖或有机物）以驱动胞内PHA积累。发酵罐2配备由专用流量控制器调节的氧气供应，气体管线进入积累容器以维持所需溶解氧环境。两个发酵罐均配备冷却夹套、搅拌器、液体出口和用于监测溶解氧、液位和温度等关键过程变量的在线仪表。富含PHA的最终发酵液从发酵罐2流出，送往下游过滤。实线表示液体传输，彩色线表示气体供应，虚线表示仪器或监测连接。利用该装置，生成细胞生物量、PHA、底物和氮浓度分布数据，用于开发DPM-informed AI模型。
动态物理模型（DPM）
DPM对于从物理角度解释发酵罐输出作为过程输入的函数至关重要，从而支持开发物理信息可解释的AI模型。通过生成广泛代表性过程数据，DPM为训练、验证和部署AI模型提供了坚实基础。这些物理信息AI模型支撑数字孪生，在实时运行中复制真实过程行为。稳健的数字孪生可通过在指定输入条件下预测关键过程输出来减少对离线分析测试的依赖，从而实现实时监测、控制和优化。
DPM由底物、氮、细胞生物量和产物（PHA）的质量传递或平衡方程组成（式(1)–(4)），并包含总体流量平衡方程（式(5)）。
(1) dC_S/dt = F_s(t)C_SF/V − D(t)C_S − (μ_xs/Y_xs + μ_ps/Y_ps + m_s)C_X(t)
(2) dC_N/dt = F_N(t)C_NF/V − D(t)C_N − (μ_xs + μ_xp/Y_xN)C_X(t)
(3) dC_X/dt = (μ_xs + μ_xp − D(t))C_X(t)
(4) dC_P/dt = (μ_ps − μ_xp/Y_xp)C_X(t) − D(t)C_P(t)
(5) F(t) = dV(t)/dt = F_s(t)(ρ_FS − C_SF)/ρ_w + F_N(t)(ρ_FN − C_NF)/ρ_w
式(1)–(4)展示了底物、氮、生物量和产物在生长、生产和稀释效应下随时间的变化。任意时间(t)的底物浓度(C_S)是进入反应器的底物（即流量F_s(t)与入口底物流中底物浓度C_SF的乘积）与稀释损失(D(t)C_S)及细胞生物量生长、产物形成和细胞维持消耗的底物之和的差值（式(1)）。μ_xs/Y_xs代表每单位细胞生物量生长消耗的底物。μ_ps/Y_ps代表每单位产物形成消耗的底物。m_s是每个活细胞无论是否生长都必须支付的维持需求。底物库在进料时上升，稀释时下降，细胞活跃生长、积累PHA或仅维持存活时下降更快。
式(2)与式(1)对应，但追踪的是氮而非碳基底物。任意时间(t)的氮浓度(C_N)是进入反应器的氮（即流量F_N(t)与入口氮流中浓度C_NF的乘积）与稀释损失(D(t)C_N)及细胞生物量生长、产物形成和细胞维持消耗的氮之和的差值（式(2)）。μ_xs + μ_xp/Y_xN代表所有细胞生物量生长所需的氮，因为所有生物量合成都需要氮。基于质量传递原理，式(1)–(4)代表了PHA的通用方程组。
【数据】培养基1：KH₂PO₄ 2.3 g + Na₂HPO₄·2H₂O 2.9 g + 蒸馏水 50 ml；培养基2：NH₄Cl 1 g + MgSO₄·7H₂O 0.5 g + CaCl₂·2H₂O 0.01 g + MnCl₂·4H₂O 0.005 g + NaVO₃·H₂O 0.005 g + 微量元素 5 ml + 琼脂 20 g + 蒸馏水 920 ml；培养基3：柠檬酸铁铵 0.05 g + 蒸馏水 20 ml；维生素液：核黄素 10 mg + 硫胺素-HCl·2H₂O 50 mg + 烟酸 50 mg + 吡哆醇-HCl 50 mg + 泛酸钙 50 mg + 生物素 0.1 mg + 叶酸 0.2 mg + 维生素B12 1 mg + 蒸馏水至100 ml；灭菌：121°C，15 min；培养时间：3天；终点取样：t = 36 h；OD₆₀₀监测；GC-FID测定PHA
研究结果
ANN模型结果
最佳ANN模型已通过用户友好的图形界面开源发布（Sadhukhan-GitHub, 2026）。在考察的各种ANN架构中，最佳架构对应最佳R²性能。每个目标共评估5种架构×3种正则化强度=15种核心配置，另有激活函数变体（tanh）、缩放替代方案（StandardScaler）、缩减特征集和替代随机种子的附加实验。
预测C_X的ANN模型采用四隐藏层架构，神经元数分别为128、64、32和16。这种更深层的架构捕捉了发酵条件与细胞生物量积累之间复杂的非线性关系——涉及迟滞期、指数生长期和稳定期，涵盖所有底物类型和细胞生物量积累。预测C_P的ANN模型采用三隐藏层架构，神经元数为128、64和32。PHA积累由氮限制触发，遵循S形轨迹。稍浅的网络已被证明足够，同时降低了过拟合风险，因为C_P值相对于其量级表现出更大的方差。
ReLU激活在所有架构中一致优于tanh。最佳tanh配置对C_P的R²=0.676。ReLU的优势可能源于其建模发酵动力学中急剧转变（迟滞-指数、指数-稳定）的能力，这支撑了物理信息ANN模型的必要性。有界[0,1]范围也与ReLU激活及被建模的非负物理量高度吻合。
更强的L2惩罚（α=0.01）适用于更深的C_X模型以防止4层网络过拟合，而较浅的C_P模型受益于较轻的正则化（α=0.001）以保持足够的模型灵活性应对变化更大的PHA积累动力学。
模型在整体测试集上达到近乎完美的预测精度（R²>0.99）。文献独有未见子集数据上的性能自然较低但仍强健（细胞生物量和PHA浓度分别R²>0.92和R²>0.95），证明ANN模型能从以DPM生成的训练数据良好泛化到所有文献收集的分布数据。
图3显示了ANN预测精度（上图）以及细胞生物量和PHA浓度ANN替代模型的训练损失收敛情况（下图）。奇偶图比较了20%保留测试集上ANN预测值与实际细胞生物量浓度（C_X，左面板）和胞内PHA浓度（C_P，右面板）（上面板）。虚线对角线代表完美一致（y=x）。ANN对细胞生物量达到R²=0.9969、RMSE=0.2506 g/L，对PHA达到R²=0.9922、RMSE=0.148 g/L。DPM生成的数据在完整浓度范围（细胞生物量0–16 g/L；PHA 0–14 g/L）内沿奇偶线聚集，证实了高保真泛化。文献挖掘点表现出更大离散度，反映了不同研究间菌体生理、原料组成和操作条件的差异，但仍被训练好的网络良好捕获。
损失、成本或误差曲线展示了两种情况下稳健预测的三个基本特征，无任何过拟合和欠拟合迹象：（i）损失曲线平均单调下降，（ii）模型捕获可学习信号后趋于平台期，（iii）平台期数值与数据的不可约噪声基底一致。两者均以对数y轴显示损失对epoch的关系——这在此处至关重要，因为损失跨越2–3个数量级。在线性轴上，后期行为将被不可见地压缩到接近零。
细胞生物量浓度（C_X）预测模型（128–64–32–16）（左面板）以非常高的损失（约20）开始，反映随机初始化的权重产生的预测远离真实C_X值。在前10–15个epoch内，损失下降超过两个数量级——这是经典的快速下降阶段，优化器捕获数据中的主导趋势。约20个epoch后，曲线趋于平台。训练在134个epoch停止，最终损失为0.0765。平滑近单调的形状表明优化轨迹稳定，无发散或振荡迹象。
PHA浓度（C_P）预测模型（128–64–32）（右面板）以低得多的初始损失（约2）开始，部分因为C_P值量级较小，部分归因于有利的初始化。它在前约20个epoch表现出相同的快速下降阶段，之后进入细化阶段。最终损失在第342个epoch达到0.00868，比C_X模型低约一个数量级。噪声包络向下趋势确认了渐进稳健的学习。C_P模型训练更深（342 vs C_X的134个epoch）并收敛到显著更低的损失，表明C_P信号比C_X信号能更好地被所选特征集（DPM式(1)–(8)）解释。较高的C_X平台（约0.08）归因于生物量测量的噪声基底。两条曲线共同表明两个替代模型均成功收敛训练，无欠拟合（损失仍在下降）、发散（损失上升）或不稳定（大幅振荡）迹象。
图3还叠加了C_X和C_P的训练损失旁的验证损失轨迹。两者均在12%内部验证集上使用早停。两条曲线紧密追踪并一起达到平台，提供了反对过拟合的直接证据。
从ANN模型可得出以下观察：1. 包含5139个数据点的主数据集（见补充电子表格）可将DPM生成和文献挖掘的PHA发酵数据协调为稳健的ANN模型。2. 跨多种配置的系统超参数优化确定了最佳架构：C_X为(128–64–32–16)，C_P为(128–64–32)。3. 最终模型对C_X和C_P均达到R²>0.99。4. 结合物理信息和真实数据对泛化至关重要，同时提高了AI模型的可解释性和稳健性。
【数据】测试集：20%保留；C_X模型：R²=0.9969，RMSE=0.2506 g/L；C_P模型：R²=0.9922，RMSE=0.148 g/L；C_X架构：128–64–32–16，α=0.01，134 epochs，最终损失0.0765；C_P架构：128–64–32，α=0.001，342 epochs，最终损失0.00868；文献未见数据：C_X R²>0.92，C_P R²>0.95；主数据集：5139个数据点；内部验证集：12%；tanh最佳配置C_P R²=0.676
RF模型结果
在所有研究的RF配置中，性能最佳的RF模型具有表6所示的超参数。对关键RF超参数进行了结构化网格搜索，在20%保留测试集上评估。选择标准包括综合评分，加权整体测试R²（50%）和文献独有测试R²（50%），确保模型能泛化到合成数据和真实实验数据。
将树的数量（N）从500增加对C_X仅提供边际改进，但对C_P有一致益处。超过300棵树后收益迅速递减，OOB分数在0.986处达到平台。使用所有特征（max_features = 1.0）降低了文献独有性能（文献提取数据中C_X的R²从0.915降至0.906；C_P从0.872降至0.825）。这是因为在每个分裂点使用所有特征增加了树间相关性，降低了集成模型的方差缩减效益。sqrt设置引入足够随机性使树去相关，同时保留预测能力。将min_samples_split增加到5、min_samples_leaf增加到2，通过约束单棵树略微改善了OOB分数（C_X从0.986到0.989），但降低了文献独有数据的R²。
【数据】RF最佳超参数：树数量N=500（C_X边际改进，C_P一致益处）；300棵树后收益递减，OOB平台0.986；max_features=1.0时文献数据C_X R²从0.915降至0.906，C_P从0.872降至0.825；min_samples_split=5、min_samples_leaf=2时OOB从0.986升至0.989（C_X）
图4（上图）显示了RF模型在测试数据集（1028个数据点）上对细胞生物量（左）和PHA（右）浓度的预测精度。（下图）显示了预测性RF模型中细胞生物量（左）和PHA（右）浓度分布的特征重要性。
图5比较了文献挖掘（实际实验）未见数据与ANN预测的C_X和C_P随时间的变化。
讨论与解读
本研究证明，PHA生物合成的稳健预测需要的不仅是机理建模或数据驱动建模中的单一方法。PHA发酵受碳可用性、氮限制、微生物生长、胞内聚合物积累、产物再动员和稀释之间强耦合非线性相互作用的支配。这些相互作用解释了为何传统动力学模型通常需要针对每种新菌株、底物或操作方案重新参数化，也解释了为何基于狭窄实验数据集的纯经验AI模型可能缺乏可迁移性。
本工作的核心贡献在于开发了一种混合建模框架，将动态物理模型（DPM）、文献挖掘实验数据和机器学习（ANN和RF）相结合，从五个可实测的发酵状态变量预测细胞生物量和PHA浓度：时间、初始底物浓度、初始氮浓度、当前底物浓度和当前氮浓度。两个目标虽然在机理上耦合（式(3)允许生物量利用再动员的PHA生长，式(4)为该生长扣除PHA），但需要训练为两个独立的单输出网络，以提高基于文献未见数据的精度。只有两种不同的架构和正则化配置（C_X：128–64–32–16，α=0.01；C_P：128–64–32，α=0.001）才能给出最优结果。
ANN在未见实验数据上（R²>0.95）优于RF（R²>0.80），表明深度网络能更好地捕捉发酵动力学的非线性转变。ANN模型以开源软件形式发布，推荐用于菌株-底物筛选、补料-氮限制设计和数字孪生发酵中的软传感。
编译者解读
本研究的亮点在于"机理生成数据+文献真实数据"的混合训练策略——用DPM扩充数据空间覆盖，用文献数据锚定真实发酵行为，巧妙化解了纯数据驱动模型对实验数据量的渴求。ANN对未见文献数据的优越泛化（R²>0.95）提示深层架构确实捕捉到了发酵动力学的本质非线性。从合成生物学应用视角看，该框架的价值在于将菌株-底物筛选从"湿实验试错"推向"干实验预筛"，显著降低探索成本。局限在于模型预测依赖五个输入特征的准确性，且对非常规代谢工程菌株（如非天然底物利用途径）的适用性仍需验证。开源发布形式值得推崇，这使框架能随社区数据积累持续进化。
参考来源
Sadhukhan, J. (2026). A hybrid kinetic–machine learning framework for PHA biosynthesis prediction. Digital Chemical Engineering. DOI: 10.1016/j.dche.2026.100330
DOI: 10.1016/j.dche.2026.100330