来源：Culture-dependent recovery of Bacillus and related isolates from selected traditional Chinese plant-based fermented foods with metagenomic and physicochemical context（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芽孢杆菌属中既有益生菌也有食源性致病菌，需在种与菌株水平上加以区分。本研究从中国11个城市采集12份传统植物基发酵食品样本，结合培养依赖法、宏基因组测序与理化分析，回收237株芽孢杆菌及相关菌株，并揭示不同发酵基质间微生物群落与功能通路的差异。研究发现三种仅通过培养法获得的物种水平分类单元，证实培养法可与宏基因组学形成互补。
研究背景
芽孢杆菌属为革兰氏阳性、兼性厌氧或好氧的产芽孢细菌，既包含应用于食品、饲料或益生菌领域的菌株，也包含具有明确致病潜力的类群。部分物种已在实验研究和有限的人体干预中被探索其健康促进作用。芽孢杆菌可从多种生态位分离，其中发酵食品因其悠久的消费历史和食品应用价值而备受关注。然而，传统植物基发酵食品中可回收的芽孢杆菌及相关产芽孢细菌的多样性尚未被充分表征，复杂发酵基质中的靶向回收因培养基偏差、预处理效应和非靶标微生物干扰而面临挑战。本研究选取传统植物基发酵食品作为芽孢杆菌及相关菌株筛选与分离的原材料。
研究方法
样本采集
本研究在中国采集了12份传统植物基发酵食品，包括3份泡菜盐水（pcms）、5份发酵蔬菜（fjsc）和4份豆豉（dc）。样本标识符、来源信息和样本详情见表1。这12份传统植物基发酵食品由当地居民自然发酵不同时间制成。每份样本在分样前充分混匀。所有样本均为单次采集时间点的家庭发酵产品；因此，发酵阶段、季节变化、气候相关效应和家庭加工差异未作为本研究的标准化实验因素。采集时，新鲜发酵的植物基样本用无酶无菌镊子或移液器小心转移至无酶无菌塑料袋中。运输期间样本置于干冰上以保持冷冻状态和样本完整性。到达实验室后，每份样本的一部分立即用于芽孢杆菌及相关菌株的培养依赖法回收和理化性质测定，其余样本在−80°C保存用于后续宏基因组测序分析，最长保存时间为7天。
【数据】样本数：12份（3份泡菜盐水、5份发酵蔬菜、4份豆豉）；采集城市数：11个；保存温度：−80°C；最长保存时间：7天
培养依赖法
#### 推定芽孢杆菌菌株的分离与初筛
样本等分液分别进行热处理（65°C，45分钟）或乙醇处理（50%[v/v]乙醇，60分钟）以灭活大多数非产芽孢细菌。处理后的样本经梯度稀释后涂布于四种培养基（MRS、LB、NB和可溶性淀粉培养基），在有氧和厌氧条件下于50°C培养24小时。菌落形成后，观察并描述菌落形态（边缘轮廓、颜色、中央隆起和大小）。对推定芽孢杆菌菌株进行初筛时，使用引物FB1（5′-ACGATGCGTAGCCGAC-3′）和RB1（5′-CCATGCACCACCTGTCACTCT-3′）对单菌落进行PCR检测，这对引物此前已被报道用于芽孢杆菌靶向筛选。经琼脂糖凝胶电泳产生预期大小扩增子的菌落被保留为候选菌株，用于进一步纯化和初步分类学归属。候选菌落通过反复划线纯化，收集分离良好的纯培养物用于后续实验。记录各分离条件下的总菌落数和PCR阳性菌落数。
【数据】热处理温度：65°C；热处理时间：45分钟；乙醇浓度：50%（v/v）；乙醇处理时间：60分钟；培养基：MRS、LB、NB、可溶性淀粉培养基；培养温度：50°C；培养时间：24小时；培养条件：有氧、厌氧
#### 推定芽孢杆菌菌株的初步分类学归属
PCR阳性候选菌株收集后进行DNA提取和基于16S rRNA基因的初步分类学归属。使用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，中国）提取DNA，16S rRNA基因按照Liu等人（2020）的方法，使用正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。扩增后，PCR产物（约1500 bp）经琼脂糖凝胶电泳检测并观察条带。若条带清晰且无拖尾现象，则认为PCR产物满足后续测序要求。初步分类学归属：满足测序要求的PCR扩增产物低温保存后送至上海生工生物技术有限公司测序。获得的序列使用Seqman进行拼接和质量检查，合格序列与NCBI数据库中存放的参考序列进行比对。菌株根据16S rRNA基因序列相似性进行临时归属。由于16S rRNA基因测序在芽孢杆菌及相关类群内部的区分能力有限，这些归属应视为初步结果而非确定的物种水平鉴定。此外，虽然第2.2.1节中使用的引物组用于推定芽孢杆菌菌株的初步筛选，但后续16S rRNA基因测序显示部分PCR阳性菌株被归属于与芽孢杆菌密切相关的属。因此，基于引物的筛选步骤被视为推定芽孢杆菌候选菌株的富集步骤，而非确定的属水平鉴定。
【数据】PCR扩增子大小：约1500 bp；引物：27F/1492R；测序公司：上海生工生物技术有限公司
#### 原始发酵食品样本中枯草芽孢杆菌枯草亚种的PCR验证
为进一步验证原始发酵食品样本中枯草芽孢杆菌枯草亚种的存在，以12份发酵食品样本的DNA提取物为模板进行亚种特异性PCR检测。引物BS310F（5′-GGCCTATTGAACACCCTGATTTA-3′）和BS310R（5′-CGGATGCGGCCTTCTTTTTC-3′）此前已被报道用于枯草芽孢杆菌枯草亚种的特异性检测，用于PCR验证。该引物对的特异性首先使用靶标菌株和代表性非靶标菌株的基因组DNA进行评估。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。同时，使用引物27F和1492R对全部12份发酵食品DNA提取物进行通用细菌16S rRNA基因PCR，以确认每份样本中存在可扩增的细菌DNA。
【数据】验证引物：BS310F/BS310R；样本数：12份
#### 芽孢杆菌及相关菌株资源保藏
培养后，通过光学显微镜下的革兰氏染色观察细菌形态。选择纯化菌株进行培养。通过离心收集细胞，将纯化菌株的生物量与脱脂乳保护剂混合，液氮中速冻，真空冷冻干燥，然后保存于菌种库中。
【数据】保护剂：脱脂乳；保藏方式：液氮速冻、真空冷冻干燥
基本理化指标测定
使用pH计测量植物基发酵食品的pH值。使用水分分析仪测定水分含量。使用盐度计测量盐浓度。使用检测试剂盒（BC1490，Solarbio，北京，中国）测定植物基发酵食品中的亚硝酸盐含量。使用BC0235还原糖试剂盒（Solarbio生物技术有限公司）测定植物基发酵食品中的总还原糖。可滴定酸度的测定按照Xiao等人（2022）和Zhang等人（2022）描述的方法进行。具体而言，将10克均质化发酵样本洗入200 mL烧杯中，加入150 mL蒸馏水（80°C）。混合物煮沸2分钟，冷却后转移至200 mL容量瓶中。加蒸馏水至刻度线，过滤溶液。随后，将10 mL滤液与60 mL蒸馏水转移至100 mL烧杯中。将烧杯置于磁力搅拌器上，用0.05 mol/L NaOH标准溶液滴定至pH达到8.20。根据消耗的NaOH标准溶液体积计算可滴定酸度。在相同条件下使用蒸馏水进行空白测定。样本的总酸度按公式（1）计算：
X1 = ((V0-V) × c × K) / (m × V3 / V4) × 1000
其中X1为样本的总酸度含量（g/1000 g）；V0为滴定至pH 8.20时消耗的NaOH标准溶液体积（mL）；V为空白测定中滴定至pH 8.20时消耗的NaOH标准溶液体积（mL）；K为以乳酸当量表示的换算系数，0.09；c为NaOH标准溶液的浓度（mol/L）；m为样本质量（g）；V3为稀释样本溶液的体积。
【数据】样本量：10 g；蒸馏水量：150 mL（80°C）；煮沸时间：2分钟；NaOH标准溶液浓度：0.05 mol/L；滴定终点pH：8.20；换算系数K：0.09
研究结果
12份中国传统植物基发酵食品的样本信息与测序
本研究纳入代表三个类别的12份传统植物基发酵样本；代表性照片如图1A所示，详细样本信息见表1和表S1。宏基因组测序在12份样本中共产生170.37 Gb数据。原始读段和清洁读段的平均数分别为94,022,287和91,935,935。质量控制和过滤后，使用k-mer大小为97的MEGAHIT进行组装，获得33,935至1,111,928个重叠群。最大和最小重叠群长度分别为787,989,470 bp和56,752,647 bp，N50范围为463 bp至26,880 bp（表S1）。每份样本预测ORF的平均数为205,403，范围为59,897至1,073,907。每份样本预测ORF的最大、最小和总长度汇总于表S2。去冗余前，所有样本的基因数和基因序列总长度分别为2,464,832和1,196,391,732 bp。非冗余基因目录的基因数和基因序列总长度分别为3547和2,622,696 bp。
【数据】总测序量：170.37 Gb；平均原始读段数：94,022,287；平均清洁读段数：91,935,935；k-mer大小：97；重叠群数范围：33,935-1,111,928；N50范围：463-26,880 bp；平均预测ORF数：205,403；去冗余前基因数：2,464,832；非冗余基因数：3547
12份中国传统植物基发酵食品中菌株的分离与初步分类学归属
在大多数测试的分离条件下，芽孢杆菌引物阳性率范围为56.48%至82.28%（表S3）。值得注意的是，热激结合MRS上的厌氧培养未产生引物阳性菌落（0/98，0%），表明该条件在本工作流程中不能有效富集靶标菌株。对于引物阳性菌株，基于近全长16S rRNA基因测序的初步分类学归属支持其分类为芽孢杆菌相关类群，除一个条件外（81.82%），其余条件的确认率为100%，表明本工作流程下筛选特异性相对较高。回收的分类群（推定物种）数量因条件而异，若干分类群仅在特定分离条件下被独特回收。芽孢杆菌靶向引物的特异性经实验进一步评估：在8株芽孢杆菌菌株中观察到预期扩增子，而在7株非芽孢杆菌菌株中未检测到扩增（图S1），支持其在测试条件下用于初步候选筛选的特异性。使用该工作流程，共回收237株芽孢杆菌及相关菌株，代表6个属和19个物种水平分类单元（表S4）。在这些发酵食品中，占优势的临时归属分类群为凝结芽孢杆菌（Heyndrickxia coagulans）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），分别占总菌株数的31.22%和30.80%（图1B）。在发酵基质类别水平上，fjsc和dc比pcms表现出更丰富的可培养芽孢杆菌及相关菌株多样性（图1C）。基于16S rRNA基因的初步分类学归属，不同样本组间的优势分类群和独有分类群各不相同。例如，pcms含有包括短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）和人参魏茨曼氏菌（Weizmannia ginsengihumi）在内的独有分类群，fjsc独有产出了包括河口芽孢杆菌（Bacillus aestuarii）和巴伦戈茨类芽孢杆菌（Paenibacillus barengoltzii）在内的分类群，而dc含有诸如解糖芽孢杆菌（Bacillus glycinifermentans）和博尔斯泰短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelensis）等独特分类群。在单个样本中，CDa3、MYa、ZXb和XYb表现出相对更丰富的菌株组成，而HNSYc和ZYc表现出大致相似的菌株谱（图1C–G）。
【数据】引物阳性率范围：56.48%-82.28%；热激+MRS厌氧培养阳性率：0%（0/98）；回收菌株总数：237株；属数：6个；物种水平分类单元数：19个；凝结芽孢杆菌占比：31.22%；地衣芽孢杆菌占比：30.80%
植物基发酵基质组间α多样性的差异
评估α多样性指标以表征传统植物基发酵食品中的微生物群落丰富度和多样性。覆盖率接近100%（数据未显示），表明测序深度充分、数据质量可靠，尽管一些低丰度分类群仍可能被低估。在不同发酵基质组间，Ace、Chao和Shannon指数呈现相同的数值趋势，fjsc表现出最高值，其次是dc，然后是pcms（图2A–C）。相比之下，Simpson指数呈现相反趋势，pcms表现出最高值，其次是dc，然后是fjsc（图2D）。然而，Kruskal–Wallis检验显示样本组间α多样性无统计学显著差异（P > 0.05），表明观察到的数值差异不具有统计学意义。
【数据】α多样性指数：Ace、Chao、Shannon、Simpson；统计检验：Kruskal–Wallis检验；P值：> 0.05（无显著差异）
不同植物基发酵基质类别间β多样性的显著差异
为评估不同发酵基质类别间的微生物群落差异性，基于Bray-Curtis和二元Jaccard距离度量分析了β多样性。在基于物种水平Bray-Curtis距离的PCoA中，pcms（蓝点）和fjsc（红点）表现出大量重叠，而dc（绿点）与两组明显分离（图3A）。二元Jaccard和Bray-Curtis分析显示相似的模式，表明pcms和fjsc的微生物群落组成高度相似，而dc与两组均有显著差异（P < 0.01）（图3B）。基于Bray-Curtis和二元Jaccard距离的NMDS也显示相似的聚类模式，应力值分别为0.045和0.054，表明排序拟合良好（图3C和D）。NMDS图进一步显示pcms和fjsc紧密聚集并部分重叠，而dc与两者明显分离，表明dc与另外两组之间的微生物群落组成存在显著差异（P < 0.01）。
【数据】PCoA距离度量：Bray-Curtis；NMDS应力值：0.045（Bray-Curtis）、0.054（二元Jaccard）；P值：< 0.01（dc与其他两组）
12份中国传统植物基发酵食品门水平相对丰度的差异
进一步比较了12份中国传统植物基发酵食品样本的门水平相对丰度。基于宏基因组注释共检测到122个门，包括厚壁菌门（Firmicutes）、子囊菌门（Ascomycota）和变形菌门（Proteobacteria）。厚壁菌门是9份样本中的优势注释门，而CDa2、CDa3和XYb表现出独特的门水平群落结构（图4A）。具体而言，子囊菌门在CDa2和CDa3中表现出最高的相对丰度，而变形菌门是XYb中的优势注释门（图4A）。在发酵基质组水平上，厚壁菌门是pcms、fjsc和dc中的优势注释门（图4B）。子囊菌门的相对丰度在pcms中最高但在dc中最低，而变形菌门的相对丰度在fjsc中最高但在pcms中最低（图4B）。维恩图分析表明，4个门为pcms独有，包括Candidatus Vogelbacteria和腕足动物门（Brachiopoda）；35个门为fjsc独有，包括Endomyxa和Perkinsozoa；10个门为dc独有，包括Elusimicrobia和Blastocladiomycota（图4C）。
【数据】检测到的总门数：122个；pcms独有门数：4个；fjsc独有门数：35个；dc独有门数：10个
12份中国传统植物基发酵食品属水平相对丰度的差异
分析了12份中国传统植物基发酵食品样本的属水平相对丰度。这些样本中共检测到3306个注释属，芽孢杆菌属是宏基因组数据集中的优势注释属。具体而言，芽孢杆菌属在FZc（35%）、HNSYc（33%）和ZYc（24%）中表现出较高的相对丰度，而在TCc中的相对丰度较低（7%）。因此，芽孢杆菌属的相对丰度顺序为FZc > HNSYc > ZYc > TCc（图5A）。注释为乳杆菌属（Lactobacillus）的序列在若干植物基发酵食品样本中相对丰富。注释为乳杆菌属的序列相对丰度在LZb中最高（38%），其次是ZXb（36%）、MYa（14%）、LNSYb（7%）、CDa3（3%）和CDa2（2%）。因此，注释为乳杆菌属的序列相对丰度顺序为LZb > ZXb > MYa > LNSYb > CDa3 > CDa2（图5A）。在dc中，三个最丰富的注释属为——
【数据】检测到的总注释属数：3306个；芽孢杆菌属相对丰度：FZc 35%、HNSYc 33%、ZYc 24%、TCc 7%；乳杆菌属相对丰度：LZb 38%、ZXb 36%、MYa 14%、LNSYb 7%、CDa3 3%、CDa2 2%
讨论与解读
中国传统植物基发酵食品蕴藏多样的微生物群落，在某些产品类别中可能代表芽孢杆菌及相关产芽孢细菌的潜在来源。以往对发酵食品微生物资源的研究多集中于乳酸菌，对芽孢杆菌相关菌株多样性和可回收性的系统研究仍然匮乏。本研究采用芽孢杆菌靶向培养依赖筛选与宏基因组和理化分析相结合的综合策略，从三类中国传统植物基发酵食品中回收芽孢杆菌及相关菌株，并比较表征这些菌株所存在的生态背景。通过该方法回收了237株归属于芽孢杆菌及相关属的菌株，并鉴定了样本组间微生物群落组成、注释功能通路及与理化性质关联的差异。值得注意的是，三种物种水平分类单元仅通过培养依赖法获得，支持培养法和宏基因组测序可提供发酵食品微生物群互补而非相同信息的观点。尽管测序覆盖率接近100%，表明测序深度总体足以——
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将"培养依赖"与"培养非依赖"策略并列比较，而非仅以宏基因组替代传统分离。三种仅靠培养法检出的物种提示：复杂发酵基质中低丰度菌株的回收仍依赖培养条件的精细化设计。从合成生物学应用角度看，237株菌株资源库的价值在于为后续益生菌筛选、安全评价和功能基因挖掘提供了实体材料基础。然而，16S rRNA基因初步归属的局限性决定了物种级结论尚需基因组层面确认，培养条件对可回收多样性的偏向性也需更多培养基组合的系统优化。
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109413