来源：Rational design of heptaprenyl diphosphate synthase and metabolic optimization drive biosynthesis of menaquinone-7 by Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甲萘醌-7（MK-7）是维生素K2家族中生物利用度最高的形式，在凝血、骨代谢和心血管健康中发挥重要作用。微生物合成MK-7受限于关键酶催化效率低、前体供给不足和NADPH供应失衡。本研究通过模块化途径重构、AI辅助挖掘高活性HepS/HepT组合、结构引导的多层次酶工程改造以及发酵优化，在大肠杆菌中实现了2.51 g/L的MK-7产量，为复杂异戊二烯类天然产物的高效生物制造提供了系统策略。
研究背景
MK-7由萘醌头基和含七个异戊二烯单元的侧链组成，是维生素K2家族中应用前景最广的形式之一。其生物利用度较高、体内半衰期较长、生理活性更稳定。随着骨质疏松、动脉钙化和心血管疾病等年龄相关疾病发病率上升，MK-7需求持续增长。天然提取法受限于原料中MK-7含量低、提取效率差和批次一致性不佳；化学合成步骤复杂、顺反异构难以控制、副产物多且存在环境问题。微生物发酵利用可再生原料、条件温和可控、环境友好，是绿色规模化生产MK-7的理想路线。目前微生物生产MK-7主要依赖发酵优化，但关键酶催化效率不足、前体供给受限和辅因子失衡仍是核心瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒列于补充材料中。大肠杆菌DH5α用于质粒构建和扩增，大肠杆菌BW25113用于MK-7生产。质粒使用ClonExpress一步克隆试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京，中国）构建。所有DNA操作均按照标准分子克隆方案进行。构建的质粒和工程菌株通过聚合酶链式反应（PCR）分析和DNA测序验证。
【数据】菌株：E. coli DH5α（质粒构建）、E. coli BW25113（MK-7生产）；试剂盒：ClonExpress One Step Cloning Kit；验证方法：PCR、DNA测序；其余参数：原文未详述
2.2 遗传操作
由成簇规律间隔短回文重复序列-Cas9介导的基因组编辑按先前描述的方法进行。该系统包括质粒pCas和pTarget。质粒pTarget含有单向导RNA表达盒、N20引导序列和多个限制性酶切位点。以质粒pTarget为模板，通过基于PCR的定点突变引入20 bp的引导RNA识别序列。基于目标基因序列设计含500 bp同源臂的供体DNA片段，使用ClonExpress一步克隆试剂盒插入质粒pTarget的PstI和XbaI限制性酶切位点。制备目标菌株的电感受态细胞，依次转化pCas和pTarget。阳性菌落通过PCR和测序验证，随后消除pTarget和pCas质粒（Jiang et al., 2015）。
【数据】编辑系统：CRISPR-Cas9（pCas/pTarget）；引导序列：20 bp N20；同源臂长度：500 bp；限制性酶切位点：PstI、XbaI；其余参数：原文未详述
2.3 摇瓶培养
对于摇瓶发酵，将单菌落接种至3 mL LB培养基中，在37 °C、220 rpm条件下过夜培养作为种子液。随后将种子液以2%（v/v）接种量转接至含25 mL Terrific Broth培养基的250 mL摇瓶中，在37 °C、220 rpm条件下培养。当培养物在600 nm处的光密度（OD600）达到约0.6–0.8时，加入阿拉伯糖至终浓度0.2%进行诱导，随后在30 °C、220 rpm条件下培养24 h。培养结束后，以6,000 × g离心5 min收集细胞。将所得细胞沉淀重悬于含20 g/L葡萄糖的25 mL M9培养基中，调节pH至7.0。在37 °C、220 rpm条件下进行12 h的生物转化。需要时，根据质粒抗性标记加入相应抗生素。
【数据】种子液体积：3 mL LB；接种量：2%（v/v）；摇瓶体积：250 mL；培养基体积：25 mL TB；诱导OD600：0.6–0.8；阿拉伯糖浓度：0.2%；诱导温度：30 °C；诱导转速：220 rpm；诱导时间：24 h；离心条件：6,000 × g、5 min；重悬液：25 mL M9 + 20 g/L葡萄糖；pH：7.0；生物转化温度：37 °C；生物转化转速：220 rpm；生物转化时间：12 h
2.4 补料分批发酵
在5-L生物反应器中进行补料分批发酵以评估工程菌株的放大性能。将单菌落接种至25 mL LB培养基中，在37 °C、220 rpm条件下过夜培养。随后以2%（v/v）接种量转接至含250 mL发酵培养基的2-L摇瓶中，在相同条件下培养8 h。将二级种子液以10%（v/v）接种量接入含2.25 L发酵培养基的5-L生物反应器中。初始温度设为37 °C，通过自动添加40%（w/v）氨水将pH维持在6.95。溶解氧含量控制在35%，搅拌转速范围为300–900 rpm。初始葡萄糖耗尽后，添加补料培养基。在第16 h加入阿拉伯糖至终浓度0.2%，并将温度降至30 °C以诱导关键酶表达。诱导8 h后，温度恢复至37 °C，继续补料分批发酵。发酵培养基含25 g/L葡萄糖、7.5 g/L (NH4)2SO4、3 g/L K2HPO4·3H2O、8 g/L KH2PO4、2 g/L MgSO4·7H2O、1 g/L柠檬酸钠和1 mL/L微量元素溶液。需要时加入相应抗生素。补料培养基含600 g/L葡萄糖和6 g/L MgSO4·7H2O。微量元素溶液含2.0 g/L Al2(SO4)3·18H2O、0.75 g/L CoSO4·7H2O、2.5 g/L CuSO4·5H2O、0.5 g/L H3BO3、24 g/L MnSO4·H2O、2.5 g/L NiSO4·6H2O和15 g/L ZnSO4·7H2O。
【数据】生物反应器体积：5 L；种子液：25 mL LB、37 °C、220 rpm过夜；二级种子：2%（v/v）转接、250 mL发酵培养基、8 h；发酵接种量：10%（v/v）；发酵培养基体积：2.25 L；初始温度：37 °C；pH：6.95（40% w/v氨水自动调节）；DO：35%；搅拌：300–900 rpm；诱导时间点：16 h；阿拉伯糖浓度：0.2%；诱导温度：30 °C；诱导时长：8 h；恢复温度：37 °C；发酵培养基组分：25 g/L葡萄糖、7.5 g/L (NH4)2SO4、3 g/L K2HPO4·3H2O、8 g/L KH2PO4、2 g/L MgSO4·7H2O、1 g/L柠檬酸钠、1 mL/L微量元素；补料培养基：600 g/L葡萄糖、6 g/L MgSO4·7H2O；微量元素组分：2.0 g/L Al2(SO4)3·18H2O、0.75 g/L CoSO4·7H2O、2.5 g/L CuSO4·5H2O、0.5 g/L H3BO3、24 g/L MnSO4·H2O、2.5 g/L NiSO4·6H2O、15 g/L ZnSO4·7H2O
2.5 分析方法
为监测MK-7产量，从500 μL发酵样品中以12,000 × g、室温离心5 min收集大肠杆菌细胞，弃去上清液。随后加入2 mL正己烷/异丙醇混合溶剂（2:1，v/v）振荡10 min提取MK-7。提取后收集有机相，经0.22-μm膜过滤后进行高效液相色谱分析。MK-7使用配备紫外检测器的高效液相色谱系统在254 nm处定量。色谱分离采用反相C18柱（Hypersil™ ODS C18，4.6 × 250 mm，5 μm；Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）。柱温维持在40 °C。流动相为100%甲醇，流速1.0 mL/min，进样体积10 μL。MK-7浓度使用购自上海源叶生物科技有限公司（上海，中国）的MK-7标准品制备的标准曲线计算。所有实验均设三个生物学重复，数据以平均值±标准差表示。
【数据】样品体积：500 μL；离心：12,000 × g、5 min、室温；提取溶剂：2 mL正己烷/异丙醇（2:1，v/v）；振荡时间：10 min；滤膜：0.22 μm；检测波长：254 nm；色谱柱：Hypersil™ ODS C18（4.6 × 250 mm，5 μm）；柱温：40 °C；流动相：100%甲醇；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；标准品来源：上海源叶生物科技有限公司；重复数：3个生物学重复
2.6 计算机辅助筛选与HepS/HepT复合物工程
使用深度学习模型UniKP和TransKP评估候选序列的催化参数，以预测的kcat值作为主要筛选标准（Yu et al., 2023）。使用AlphaFold3网络服务器预测HepS/HepT蛋白结构，使用Rosetta从头酶设计协议进行候选酶与底物之间的分子对接和能量评分（Abramson et al., 2024; Meiler & Baker, 2006）。对所选酶进行理性工程改造时，使用Discovery Studio 2019 Visualizer分析突变对底物结合构象和结合亲和力的影响（Dassault Systèmes BIOVIA, 2019）。使用蛋白质设计算法FoldX计算突变引起的蛋白质折叠自由能变化（Delgado et al., 2025），使用进化偶联分析集成流程（EVcouplings）进行共识设计和突变评分（Hopf et al., 2019）。
【数据】深度学习模型：UniKP、TransKP；结构预测：AlphaFold3；对接工具：Rosetta；分析软件：Discovery Studio 2019；算法：FoldX、EVcouplings；其余参数：原文未详述
2.7 分子动力学（MD）模拟
使用AlphaFold3网络服务器预测野生型（WT）和突变型（MUT）HepS/HepT复合物的结构。随后使用AutoDock Vina将法尼基焦磷酸（FPP）和异戊烯基焦磷酸（IPP）依次对接至预测的活性位点，构建MD模拟的初始复合物结构（Trott & Olson, 2010）。对于MD模拟，使用通用AMBER力场生成配体参数。在B3LYP-D3/6-31G(d)理论水平下使用约束静电势方法获得部分原子电荷。使用AmberTools将配体拓扑文件转换为GROMACS兼容格式（Case et al., 2023）。蛋白质残基使用Amber ff14SB力场描述（Maier et al., 2015）。每个模拟体系在矩形TIP3P水盒中溶剂化，加入Na+离子中和体系总电荷。Mg2+参数取自TIP3P水模型的默认AMBER离子参数。经过两步能量最小化后，体系温度在50 ps内从0逐步升至300 K，并在NPT系综下于300 K、1 bar条件下平衡50 ps。当温度、压力、势能和体系密度达到稳定波动时，认为平衡充分。最后，每个体系进行三次独立的100-ns MD模拟。通过监测主链RMSD和总能量曲线评估生产模拟的收敛性。
【数据】结构预测：AlphaFold3；对接工具：AutoDock Vina；力场：AMBER通用力场、Amber ff14SB；电荷方法：RESP（B3LYP-D3/6-31G(d)）；水模型：TIP3P；离子：Na+、Mg2+；温度梯度：0→300 K（50 ps）；平衡：NPT、300 K、1 bar、50 ps；模拟时长：3 × 100 ns；其余参数：原文未详述
研究结果
3.1 MK-7从头生物合成途径的模块化构建与优化
为实现大肠杆菌中MK-7的从头生物合成，将途径模块化重构为三个模块：萘醌头基供给、异戊二烯侧链供给和MK-7合成（图1A）。首先，将枯草芽孢杆菌基因hepS/hepT、menA和menG组装到表达质粒中并导入大肠杆菌BW25113，获得菌株EK0，发酵后产生3.4 mg/L MK-7。随后，将天然menF启动子替换为强组成型启动子J23110，获得菌株EK1，MK-7产量为9.3 mg/L。接着，将异源甲羟戊酸（MVA）途径引入菌株EK1。具体而言，由EfmvaE和EfmvaS组成的MVA上游模块由pBAD启动子控制，而由MmmvaK、ScpmK和ScmvaD组成的下游模块由J23119启动子驱动。将MVA途径整合到基因组yciQ位点获得菌株EK2，MK-7产量提高至16.3 mg/L（图1B）。由于异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）调节IPP与二甲基烯丙基二磷酸之间的平衡，从而影响异戊二烯前体供给，进一步筛选了不同来源的IDI。其中，来自Myxococcus stipitatus的IDI表现最佳，将MK-7产量提高至28.9 mg/L（图1C）。随后通过调整MK-7合成模块的质粒拷贝数优化途径表达。中等拷贝数的表达系统更有利于MK-7积累，产量进一步提高至38.6 mg/L（图1D）。为识别MK-7合成模块的潜在瓶颈，比较了hepS/hepT、menA和menG的不同基因排列方式（图1E）。当hepS/hepT置于表达模块前端时MK-7产量最高，而将menA或menG置于前端则降低产量（图1F）。这些结果表明侧链形成可能是当前合成模块的主要限速步骤。因此，选择HepS/HepT作为后续同源挖掘和理性工程改造的关键靶点。
【数据】基础菌株EK0产量：3.4 mg/L；启动子替换后EK1产量：9.3 mg/L；MVA途径整合后EK2产量：16.3 mg/L；最优IDI来源：Myxococcus stipitatus；IDI优化后产量：28.9 mg/L；中等拷贝数优化后产量：38.6 mg/L；最优基因排列：hepS/hepT置于前端
3.2 基于深度学习的HepS/HepT挖掘
上述结果确定HepS/HepT为MK-7合成模块的关键潜在瓶颈。为进一步提高MK-7生物合成，采用人工智能（AI）辅助挖掘策略结合基于分子对接的结构评估，从大量同源序列中筛选潜在高活性HepS/HepT组合（图2A）。以枯草芽孢杆菌HepT为查询序列，通过BLASTp搜索NCBI ClusteredNR数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）检索到约5,000个HepT同源物。根据序列长度过滤候选序列以去除不完整、截短或异常长的序列，可接受的长度范围为查询HepT序列的80–120%。随后，使用深度学习模型UniKP和TransKP以FPP为底物预测候选HepT同源物的kcat值，并根据预测的kcat值对候选序列排序（图2B）。分别选取每个模型排名前50的候选序列，基于基因组注释和基因上下文提取同一物种的相应hepS基因，构建候选HepS/HepT组合用于进一步结构评估。使用AlphaFold3预测候选HepS/HepT复合物的结构，使用Rosetta通过分子对接评估其底物结合能力。以Rosetta参数total_score和dG_cross/dSASA × 100作为筛选指标。total_score反映复合物的整体能量稳定性，值越低表示构象越稳定；dG_cross/dSASA × 100表示单位埋藏表面积的界面相互作用能，用于评估界面质量，值越低通常表示相互作用越有利。由于这两个指标在数值尺度和物理意义上存在差异，对其进行归一化并整合为综合评分，以避免不同维度导致的排名偏差。根据综合评分选取前10个HepS/HepT组合进行摇瓶验证（图2C）。实验结果显示，所选10个HepS/HepT组合中有7个产生的MK-7产量高于对照BaHepS/HepT。其中，来自Solibacillus sp. FSL W7-1436的HepS/HepT复合物表现最佳，MK-7产量达到79.9 mg/L，比对照高106.9%（图2D）。
【数据】BLASTp检索同源物数量：约5,000个；序列长度范围：查询序列的80–120%；每个模型选取候选数：前50；摇瓶验证组合数：10个；有效组合数：7个；最佳组合来源：Solibacillus sp. FSL W7-1436；最佳产量：79.9 mg/L；比对照提高：106.9%
3.3 结构引导的HepS/HepT复合物多层次工程改造提高MK-7生物合成
为进一步提高HepS/HepT复合物的催化性能，通过整合结构建模、分子对接和多种计算机辅助设计方法对所选高活性同源物进行理性工程改造。首先，使用AutoDock Vina分子建模模拟软件将FPP和IPP依次对接至HepS/HepT复合物的预测活性位点。随后鉴定底物5 Å范围内的氨基酸残基作为潜在参与底物结合或构象调控的位点。结合保守性分析，排除高度保守的催化基序（如DDXXD）及邻近的关键保守残基。最终选择活性位点周围的若干残基，如hepT的F210和Q211，作为后续活性位点工程改造的候选位点（图3C）。在此基础上，结合三种计算机辅助策略筛选所选位点的突变。具体而言，使用Discovery Studio 2019评估突变对底物结合亲和力的潜在影响，以结合ΔΔG表示；使用FoldX计算突变引起的蛋白质折叠自由能变化，以折叠ΔΔG表示。进一步应用EVcouplings基于10,563条同源序列进行共识设计和突变评分。筛选过程中，优先选择DS2019和FoldX预测中ΔΔG < 0（表示有利的能量效应）的突变，同时要求EVcouplings评分 > −0.3以排除进化上不利的替换，同时保持足够的候选库用于多参数筛选（见补充材料）。满足至少两个标准的突变被选用于实验验证（图3A、B）。结果显示，HepT的F210Y突变显著促进MK-7生物合成，产量提高至110.9 mg/L，比WT SolHepS/HepT复合物高38.8%（图3D）。随后以F210Y为模板进行迭代突变，但未获得MK-7产量进一步显著提高的突变复合物（见补充材料）。考虑到HepS/HepT复合物以异源寡聚体形式发挥作用，其活性依赖于有效的亚基组装，推测稳定亚基间界面可增强催化效率。因此对界面残基进行基于FoldX的虚拟饱和突变，选取预测可降低界面结合自由能的前20个突变进行实验验证（图3E）。其中，HepS Y132W在HepT F210Y基础上进一步提高MK-7产量，达到130.2 mg/L（图3F）。随后研究了远端残基，这些残基可能通过调节蛋白质构象、动力学或局部柔性影响酶活性。使用蛋白质语言模型ESM-1 V预测潜在有益的远端突变，并基于Rosetta Cartesian_ddg计算排除去稳定突变（图3G）。实验验证显示，HepT P75A进一步将MK-7产量提高至——
【数据】底物结合位点鉴定范围：5 Å；EVcouplings同源序列数：10,563条；筛选标准：ΔΔG < 0（DS2019和FoldX）、EVcouplings评分 > −0.3；F210Y突变产量：110.9 mg/L；比WT提高：38.8%；界面突变验证数：前20个；Y132W+F210Y产量：130.2 mg/L；远端突变预测模型：ESM-1 V；排除标准：Rosetta Cartesian_ddg
3.4 WT与MUT HepS/HepT复合物的MD模拟分析
对WT和MUT HepS/HepT复合物进行了100-ns MD模拟以解析突变对蛋白质动态行为的影响。主链RMSD曲线显示，WT和MUT复合物在模拟过程中均达到收敛，但MUT复合物的RMSD值略低于WT，表明突变可能增强了复合物的结构稳定性（图4A）。HepT的RMSF分析显示，MUT中部分柔性区域（特别是活性位点周围环区）的波动幅度减小，提示突变降低了局部构象灵活性（图4B）。代表性构象比较揭示了WT与MUT之间底物结合距离的差异（图4C）。
【数据】模拟时长：100 ns；RMSD：MUT略低于WT；RMSF：MUT活性位点周围环区波动减小；其余参数：原文未详述
3.5 途径表达协调与NADPH再生
为协调途径表达并增强NADPH供应，设计了IspA–HepS/HepT融合蛋白。直链表示刚性连接肽（EAAAK），曲线表示柔性连接肽（GGGGS），n表示连接肽重复数（图5A）。测试了融合方向和连接肽类型对MK-7产量的影响（图5B）。
【数据】连接肽类型：刚性EAAAK、柔性GGGGS；其余参数：原文未详述
3.6 5-L生物反应器中的补料分批生产
在5-L生物反应器中进行补料分批发酵，在恒定溶解氧含量35%条件下监测OD600、MK-7产量和残余葡萄糖的时间曲线（图6A）。图6B展示了MK-7补料分批发酵过程中5-L生物反应器的照片。图6C展示了时间曲线（图注未完）。最终，工程菌株在5-L生物反应器中MK-7产量达到2.51 g/L。
【数据】生物反应器体积：5 L；溶解氧：35%；最终MK-7产量：2.51 g/L；其余参数：原文未详述
讨论与解读
MK-7是维生素K2家族中有价值的脂溶性醌类化合物，其高效可持续生产对食品、膳食补充剂和医疗保健应用具有重要意义。MK-7生产涉及萘醌头基形成、异戊二烯侧链延伸、还原力供应和发酵放大等多个过程。因此，MK-7积累不仅取决于单个前体模块或关键酶，还取决于模块间通量平衡、异源酶的宿主兼容性、细胞代谢负担和发酵稳定性。本研究通过整合模块化途径重构、AI辅助酶工程、动态代谢调控、中心碳重分配和发酵优化的多层次策略对大肠杆菌进行工程改造，实现了高效的MK-7从头生物合成。结果表明，系统协调酶催化、前体供给、辅因子再生、宿主生理和发酵控制对于克服单点瓶颈、提高MK-7及其他复杂天然异戊二烯类产物产量至关重要。HepS/HepT复合物被鉴定为限制MK-7生产的关键因素。因此，鉴定高性能HepS/HepT组合可能有助于克服MK-7侧链生物合成的瓶颈。此前的酶优化工作主要依赖系统发育相关的同源筛选或随机突变。
编译者解读：该研究的方法论价值在于将深度学习预测（UniKP/TransKP）与分子对接（Rosetta）和结构引导的理性设计（FoldX/EVcouplings/ESM-1 V）串联为可操作的酶挖掘与改造流水线，将HepS/HepT的筛选从经验试错提升为计算驱动的定向进化。2.51 g/L的产量在MK-7微生物合成领域处于领先水平，但该策略对同源序列质量和结构预测精度的依赖仍是其向其他异戊二烯类产物推广时的潜在局限。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135786
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135786