来源：Simultaneous synthesis of resveratrol by dual-compartment metabolic engineering in Saccharomyces cerevisiae（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
白藜芦醇是一种具有多种药理活性的植物多酚，其微生物合成长期受限于前体供给不足。本研究首次在酿酒酵母的过氧化物酶体和细胞质两个区室中同时构建白藜芦醇合成途径，通过多拷贝基因整合与前体供给强化，使5-L生物反应器中白藜芦醇产量达到552.16 mg/L。¹³C代谢流分析揭示了双区室菌株的积累量接近两个单区室菌株之和，证明过氧化物酶体可被重塑为高效的细胞器工厂。
研究背景
白藜芦醇（3,4′,5-三羟基-1,2-二苯乙烯）是一种广泛存在于虎杖、花生、葡萄和蓝莓等植物中的多酚类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗衰老及心血管保护等多种生理活性，在医药、保健、营养和化妆品领域应用广泛。据QYResearch报告，全球白藜芦醇市场预计从2025年的9083万美元增长至2032年的1.64亿美元。
传统植物提取成本高昂且环境不友好，化学合成同样存在可持续性问题。微生物合成提供了一条可持续、可放大的替代路线。然而，大多数微生物缺乏白藜芦醇合成所需酶系，需要异源表达苯丙氨酸解氨酶（PAL）与肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）和二苯乙烯合酶（STS），或酪氨酸解氨酶（TAL）、4CL和STS。前体供给不足始终是限制总产量的关键瓶颈。
本研究采用双区室工程策略，首次在酿酒酵母的过氧化物酶体和细胞质中同时合成白藜芦醇，在充足前体供给条件下提高白藜芦醇合成效率。
研究方法
2.1 菌株与培养基
以酿酒酵母菌株DAY414作为代谢工程改造的初始菌株。质粒构建和扩增使用大肠杆菌EC135。大肠杆菌在添加氨苄青霉素（100 mg/L）的Luria–Bertani（LB）培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L）中培养。酿酒酵母菌株通常在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（葡萄糖20 g/L、细菌学蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L）中培养。携带URA3或TRP1标记质粒的酿酒酵母菌株分别在缺失尿嘧啶或色氨酸的合成限定（SD）培养基中生长；同时携带两种质粒的菌株则在同时缺失两种氨基酸的培养基中生长。
【数据】LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L；氨苄青霉素：100 mg/L；YPD培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L
2.2 质粒与菌株构建
#### 2.2.1 质粒构建
使用Takara公司的pMD19-T载体系列构建基因组编辑质粒。所有质粒均采用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（NEB，中国）进行组装。内源基因以酿酒酵母S288C基因组为模板，使用Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase（NEB，中国）扩增。所有异源基因由GenScript（南京，中国）合成，密码子经优化以适应酿酒酵母中的转录和翻译。经密码子优化的白藜芦醇合成基因序列见补充材料。
采用CRISPR-Cas9系统进行单基因或多基因整合。使用CRISPR RGEN Tools网站设计特异性引导RNA（gRNA）。所有引物由Sangon Biotech（上海，中国）合成。单靶点gRNA质粒构建时，以pWYE3237质粒为模板，用特异性引物扩增pScSNR52‑crRNA（含N20）和tracrRNA‑SUP4t片段，纯化后的PCR产物与NotI/EcoRI酶切的pWYE3237骨架组装，生成gRNA质粒。多靶点gRNA质粒构建时，从相应的site-A、B、C和D gRNA质粒中用特异性引物扩增全长gRNA表达盒（pScSNR52‑site A/B/C/D gRNA‑tracrRNA‑SUP4t），纯化后与NotI/EcoRI酶切的pWYE3237骨架组装，获得携带pScSNR52‑site A、B、C和D gRNA单元的多靶点gRNA质粒。
【数据】PCR聚合酶：Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase；组装试剂：NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix；限制性内切酶：NotI/EcoRI；gRNA设计网站：CRISPR RGEN Tools
#### 2.2.2 工程菌株构建
多基因座基因组整合时，编辑位点序列取自酿酒酵母基因组。将片段连接至编辑位点序列的上游和下游同源臂（HAs），组装为"上游–基因–下游"结构。每个载体在转化酿酒酵母前进行线性化。Cas9质粒预先转化至宿主菌株，随后将gRNA质粒和修复DNA片段共转化至宿主菌株进行整合。每轮基因整合后，消除gRNA质粒以进行下一轮整合。
酿酒酵母DNA转化采用LiAc/SS carrier DNA/PEG法。每次转化（100 μL感受态细胞）使用约0.1 μg质粒、1 μg DNA片段、10 μg鲑鱼精DNA和500 μL PLATE溶液，充分涡旋混匀转化混合物，30°C静置孵育30分钟。在42°C水浴中进行热激处理20分钟。转化细胞经收集后用YNB洗涤两次，均匀涂布于相应的选择性固体培养基上，30°C培养3–5天。所有转化子传代三次，随后通过特异性引物PCR扩增验证菌株构建。PCR产物条带大小与理论值一致的，进一步通过Sanger测序验证。测序结果完全正确的菌株确认为成功整合菌株。
【数据】转化方法：LiAc/SS carrier DNA/PEG法；质粒用量：约0.1 μg；DNA片段用量：1 μg；鲑鱼精DNA：10 μg；PLATE溶液：500 μL；感受态细胞：100 μL；静置孵育：30°C、30 min；热激：42°C、20 min；培养：30°C、3–5天
2.3 摇瓶与生物反应器补料分批发酵
白藜芦醇合成发酵中，工程菌株单菌落接种于YPD脂质培养基，30°C、220 rpm培养18小时作为一级种子。按10%（v/v）接种比例转接至含YPD脂质培养基的摇瓶中，30°C、220 rpm继续培养18小时作为二级种子。摇瓶生产白藜芦醇时，二级种子按10%（v/v）接种比例转接至添加3 mM酪氨酸的YPD脂质培养基中进行发酵。每12小时取样测定OD600、葡萄糖浓度和白藜芦醇滴度。每次取样后补加葡萄糖溶液。
所有样品进行三次重复分析。本研究中所有发酵实验每个条件至少设置三个独立生物学重复和三个技术重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。培养条件包括接种量、初始OD、温度和摇瓶转速在各重复批次间严格保持一致。
生物反应器补料分批发酵时，二级种子按10%（v/v）接种比例转接至5 L生物反应器（Bailun Biotech，上海，中国）中1.8 L添加5 mM酪氨酸的YPD脂质培养基。反应器配备溶解氧（DO）、pH和温度探针，由自动控制补料系统进料。发酵在30°C下进行120小时。通过向反应器中添加750 g/L葡萄糖溶液，将葡萄糖浓度维持在5–20 g/L。使用NaOH将pH控制在6。搅拌速度和通气速率经调节使DO浓度维持在约10–40%。每6小时取样测定OD600、葡萄糖浓度和白藜芦醇滴度。
【数据】一级种子培养：30°C、220 rpm、18 h；接种比例：10%（v/v）；二级种子培养：30°C、220 rpm、18 h；摇瓶发酵：3 mM酪氨酸、30°C、220 rpm、每12 h取样；5-L反应器：1.8 L培养基、5 mM酪氨酸、30°C、120 h；葡萄糖维持：5–20 g/L（补加750 g/L葡萄糖溶液）；pH：6（NaOH控制）；DO：约10–40%；取样间隔：每6 h
2.4 分析方法
使用Sangon Biotech酵母快速总RNA提取试剂盒提取酿酒酵母RNA。使用Tiangen FastKing cDNA第一链合成试剂盒（含基因组去除）进行RNA逆转录。靶基因拷贝数和逆转录水平使用NEB GoTaq qPCR Master Mix试剂盒通过荧光定量PCR定量，以ALG9为内参基因，以无模板空白组为对照。对荧光定量PCR产物进行熔解曲线分析以验证产物特异性。数据分析采用2⁻ΔΔCT法，使用LightCycler 96软件（Roche，瑞士）。每个样品设置三个技术重复。
所有样品OD600经稀释至适当浓度后，使用V-1100D紫外可见分光光度计（Mapada，上海，中国）测定。葡萄糖浓度使用SBA-40D生物传感分析仪（SBA，山东，中国）测定。白藜芦醇测定时，取1 mL样品离心取上清，取300 μL上清与300 μL乙醇充分混匀，经0.22 μm滤膜过滤。HPLC定量白藜芦醇的方法见补充材料。LC‒MS/MS仪器和分析条件见补充材料。
【数据】内参基因：ALG9；定量方法：2⁻ΔΔCT法；OD600仪器：V-1100D紫外可见分光光度计；葡萄糖分析仪：SBA-40D；过滤膜：0.22 μm滤膜
2.5 荧光共定位分析
（原文节选至此，后续具体步骤未详述。）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 不同细胞区室中的白藜芦醇合成
本研究首次在酿酒酵母的不同细胞区室中建立了白藜芦醇合成途径。选择仅需三种外源酶TAL、4CL和STS的酪氨酸途径，以缩短代谢途径并减少副产物形成。来自Herpetosiphon aurantiacus的TAL基因、来自Arabidopsis thaliana的4CL基因和来自Vitis vinifera的STS基因经密码子优化后，通过CRISPR-Cas9系统整合至基因组中（图1、图2A）。将这些外源基因TAL、4CL和STS整合至初始菌株Rev01中，构建细胞质区室菌株Rev02（图2B）。为构建过氧化物酶体区室菌株Rev03，将外源基因TAL-SKL、4CL-SKL、STS-SKL和ACC1-SKL整合至菌株Rev01中，相应酶通过C端信号肽SKL靶向至过氧化物酶体（图2C）。此外，天然不存在于过氧化物酶体中的ACC1也通过信号肽靶向至该区室（图2C）。所有基因均在组成型启动子PTEF1、PTPI1和PTEF2下表达。
为确认SKL标记酶有效靶向过氧化物酶体，构建了共表达GFP‑GGGG‑PEX3和mCherry‑SKL的酵母菌株。GFP‑GGGG‑PEX3作为过氧化物酶体膜标记物，mCherry‑SKL作为过氧化物酶体基质报告蛋白。激光扫描共聚焦显微镜和共定位分析显示GFP与mCherry之间存在明显的荧光重叠（图2D），验证了SKL标记酶的有效过氧化物酶体靶向，并确认过氧化物酶体白藜芦醇生物合成途径组装成功。
两种工程菌株中均成功检测到白藜芦醇，证实了合成途径在各自区室中的有效性（图2B、C）。LC‒MS/MS色谱图分析显示，工程菌株发酵上清液目标峰的分子离子（227.00 m/z）和关键碎片离子（184.90和143.00 m/z）模式与白藜芦醇标准品完全一致，证实目标产物为反式白藜芦醇（图2E）。HPLC色谱图分析显示，白藜芦醇标准品在4.2 min处出峰，Rev02和Rev03均在相同保留时间出峰（图2F）。这些结果表明Rev02和Rev03成功合成了白藜芦醇。
摇瓶发酵中，细胞质菌株Rev02产白藜芦醇滴度较高（53.79 ± 3.78 mg/L），但比生产速率较低（74.32 ± 1.69 μg/gDCW/h）（图2G）。相反，过氧化物酶体菌株Rev03的合成效率提高，比生产速率显著升高至119.79 ± 7.05 μg/gDCW/h（图2G）。与细胞质合成途径菌株相比，过氧化物酶体合成途径菌株的白藜芦醇滴度较低（34.67 ± 1.53 mg/L），但比生产速率高出61%。这一差异可能归因于细胞的区室化——过氧化物酶体区室可促进底物结合，同时避免其他反应的干扰。过氧化物酶体内白藜芦醇的成功合成表明，过氧化物酶体工程是目标化合物合成的可行且有前景的策略，该细胞器的生物合成潜力可通过理性工程显著提升。
【数据】细胞质菌株Rev02滴度：53.79 ± 3.78 mg/L；Rev02比生产速率：74.32 ± 1.69 μg/gDCW/h；过氧化物酶体菌株Rev03滴度：34.67 ± 1.53 mg/L；Rev03比生产速率：119.79 ± 7.05 μg/gDCW/h；比生产速率提升：61%；LC-MS/MS特征峰：227.00 m/z（分子离子）、184.90和143.00 m/z（碎片离子）；HPLC保留时间：4.2 min
3.2 过氧化物酶体中白藜芦醇合成模块的高效组装
为进一步提高过氧化物酶体区室菌株Rev03的白藜芦醇合成能力，增加了合成模块的表达水平。构建了白藜芦醇合成基因的融合表达盒（PScTEF1-TAL-SKL-PScTPI1-4CL-SKL-PScTEF2-STS-SKL，7.4-kb序列）。利用本研究开发的多位点整合方法，将该表达盒同时整合至亲本菌株Rev03的多个基因组位点（图3A）。该策略中，多个gRNA表达盒串联连接于单个gRNA质粒上。经三轮迭代整合，靶基因拷贝数增加十倍（图3B）。
菌株Rev04由Rev03衍生而来，将7.4-kb表达盒同时整合至三个基因组位点，增加了拷贝数。菌株Rev05由Rev04衍生而来，将相同的7.4-kb表达盒同时整合至另外三个基因组位点，同样增加了额外拷贝数。菌株Rev06由Rev05衍生而来，将表达盒同时整合至另外四个基因组位点，增加四个拷贝，使白藜芦醇合成基因拷贝数达到最高（11拷贝）（图3B）。值得注意的是，该方法能够通过大DNA片段整合实现四个不同基因组位点的同时编辑。例如，菌株Rev06由Rev05衍生而来，将表达盒同时整合至基因组位点XI1、XI2、XI3和XI5，四位点整合的阳性率约为50%。该多位点整合方法具有位点可选、拷贝数可控、修饰无缝和效率高的特点。
菌株Rev06中TAL、4CL和STS基因的定量拷贝数分别为9、10和9，与整合拷贝数紧密匹配，确认所有靶基因均成功整合（图3C）。基因转录分析显示三个白藜芦醇生物合成基因均有表达；然而，RT-qPCR测定的转录水平（cDNA丰度）与其相近的拷贝数并不一致。TAL和STS的cDNA丰度分别比4CL高5.3倍和4.8倍（图3C）。这些发现表明基因表达不仅取决于基因剂量，启动子差异和转录调控也强烈影响转录效率。
强化白藜芦醇合成模块后，白藜芦醇滴度随基因拷贝数增加而逐步提高。摇瓶发酵中，工程菌株Rev04（4拷贝）和Rev05（7拷贝）的产量分别为34.48 ± 2.93 mg/L和45.28 ± 6.53 mg/L。与Rev03相比，Rev06（11拷贝）产量显著提升至104.23 ± 7.66 mg/L，提高了200%（图3D）。获得了具有较高白藜芦醇合成能力的高拷贝菌株。由于单基因拷贝数过高可能影响菌株生长，未继续增加三个基因的拷贝数。
【数据】表达盒大小：7.4-kb；Rev04（4拷贝）产量：34.48 ± 2.93 mg/L；Rev05（7拷贝）产量：45.28 ± 6.53 mg/L；Rev06（11拷贝）产量：104.23 ± 7.66 mg/L；产量提升：200%；四位点整合阳性率：约50%；Rev06拷贝数：TAL 9、4CL 10、STS 9；cDNA丰度比：TAL比4CL高5.3倍、STS比4CL高4.8倍
3.3 通过系统代谢工程强化前体供给模块
前体供给常限制总体产量。本研究优化了过氧化物酶体内白藜芦醇合成前体丙二酰-CoA的可利用性。丙二酰-CoA由乙酰-CoA经ACC1作用直接生成，而过氧化物酶体中的乙酰-CoA主要来源于脂肪酸的β-氧化（图4A）。因此，采用代谢工程策略提高前体可利用性。该策略涉及三个前体节点的过表达：ACC1-SKL（节点1）；ATP结合盒长链脂肪酸转运蛋白PXA1和PXA2，以及脂肪酸合酶亚基FAS1和FAS2（节点2）；定位于过氧化物酶体的β-氧化途径酶，包括酰基辅酶A氧化酶（POX1）、过氧化物酶体水合酶-脱氢酶-差向异构酶（FOX2）和过氧化物酶体3-酮脂酰-CoA硫解酶（POT1）（节点3）。
#### 3.3.1 过表达（原文节选至此，后续内容未完整呈现。）
【数据】原文未详述
3.4 过氧化物酶体与细胞质区室同时合成白藜芦醇
（原文节选至此，该部分完整方法及数据未在提供范围内充分呈现，以下为可获取内容。）
【数据】原文未详述
3.5 区室化菌株中白藜芦醇合成相关的细胞碳代谢
【数据】原文未详述
讨论与解读
白藜芦醇作为具有多种药理活性的植物次生代谢产物，在制药、功能食品、化妆品和饲料添加剂领域备受关注。异源微生物合成白藜芦醇被视为传统植物提取和化学合成的可持续替代方案。本研究对酿酒酵母的过氧化物酶体和细胞质进行工程改造，用于白藜芦醇合成，显著增加了区室化前体乙酰-CoA的供给并提高了白藜芦醇滴度。研究建立并优化了包含过氧化物酶体白藜芦醇合成模块和区室化前体供给模块（含多个节点）的过氧化物酶体途径，随后将过氧化物酶体与细胞质合成途径相结合。据作者所知，该系统性策略首次报道了在过氧化物酶体内以及同时利用双区室（过氧化物酶体和细胞质）进行白藜芦醇的微生物合成。与现有方法相比，双区室方法解决了乙酰-CoA供给不足这一白藜芦醇合成的瓶颈。¹³C-MFA揭示，双区室菌株中过氧化物酶体被成功改造为白藜芦醇合成的可行场所，这归因于其过氧化物酶体乙酰-CoA含量的显著增加。
在代谢工程菌株构建过程中，质粒过表达等方法（原文节选至此，后续内容未完整呈现。）
编译者解读
本研究将真核细胞器区室化策略引入白藜芦醇合成，巧妙利用过氧化物酶体的β-氧化途径天然产生乙酰-CoA这一特点，将前体供给与产物合成在空间上耦合。双区室并行合成的设计思路跳出了传统单一细胞质工程的框架，具有较好的普适性和推广价值。值得注意的是，作者开发的多位点整合方法实现了可控拷贝数的无缝基因组编辑，四靶点同时整合阳性率约50%，为其他复杂天然产物的细胞器工程提供了可借鉴的技术范式。然而，过氧化物酶体区室菌株的绝对滴度仍低于细胞质菌株，区室容量和底物转运效率的进一步提升可能是后续优化方向。552.16 mg/L的产量距离工业化要求仍有差距，碳流在双区室间的精细分配机制也值得深入研究。
参考来源
Shi R. Simultaneous synthesis of resveratrol by dual-compartment metabolic engineering in Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 2026.
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135806
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135806