来源：Lactobacilli consortium and Corynebacterium glutamicum sequential cultivation to produce single cell protein (SCP) from seaweed by-products（Algal Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全球蛋白质需求持续攀升，单细胞蛋白（SCP）被视为可持续替代蛋白的重要方向，但高昂的生产成本制约其推广。海洋工业富含营养的副产物长期未获充分利用。本研究以琼脂提取后的红藻石花菜（Gelidium corneum）工业残渣为底物，经酶解糖化后，先由四株乳酸菌联合菌群（4LAB）发酵产乳酸并富集蛋白，再以无细胞上清培养谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）进一步生产SCP。结果显示，发酵产物蛋白含量与生物可及性均显著高于原始藻渣，且谷氨酸棒杆菌产物展现更强的抗氧化活性。该策略为海洋副产物高值化利用提供了可行路径。
研究背景
据联合国预测，2050年全球人口将达98亿，粮食系统面临前所未有的压力。蛋白质作为必需大分子，其生产成本远高于碳水化合物和脂类，因此开发可持续蛋白替代源成为迫切需求。植物蛋白、昆虫蛋白、培养肉及单细胞蛋白（SCP）等方案相继被提出。SCP指利用单细胞微生物生产的蛋白质，其底物既可为高商业价值的第一代原料，也可为富含营养的农业或工业侧流（第二代底物）。固态、液态或半固态发酵均可用于SCP生产，酵母、细菌、藻类和丝状真菌等不同微生物已被探索应用。用于SCP生产的微生物应属于美国食品药品监督管理局（FDA）公认安全（GRAS）类别，并获得欧洲食品安全局（EFSA）的资格预判安全（QPS）认定，如酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌及多种乳酸菌。尽管多种工业副产物已被探索为SCP生长底物，海洋工业中营养丰富的残渣仍未得到充分利用。琼脂提取后的石花菜残渣保留有营养谱良好的碳水化合物和蛋白质组分，但这些组分不易被生物利用。对藻类粗纤维进行糖化处理后再经微生物发酵，可提高蛋白质的生物可及性与品质，并赋予更好的生物活性。
研究方法
2.1 海藻残渣的获得与前处理
琼脂-琼脂提取后的红藻石花菜（Gelidium corneum）工业残渣由葡萄牙Iberagar – Sociedade Luso-Espanhola de Colóides Marinhos公司提供。残渣用自来水冲洗以去除贝壳、沙粒或塑料碎片及其他可能的颗粒物。清洗后的残渣平铺于托盘上，在60°C烘箱中干燥72小时。干燥后的残渣经刀式粉碎机（pulverisette 14 FRITSCH，德国）处理获得细粉，可穿过2 mm筛网。粉末状残渣储存于避光塑料容器中，室温保存直至使用。
【数据】干燥温度：60°C；干燥时间：72h；筛网孔径：2mm；储存条件：室温避光
2.2 微生物菌株
使用由四株乳酸菌组成的联合菌群，分别为：Lacticaseibacillus casei ATCC 393、Lacticaseibacillus rhamnosus ATCC 7469、Levilactobacillus brevis DSM 20054和Lactobacillus plantarum ATCC 8014。选择这些菌株是因为它们具有互补的代谢能力，可确保微生物多样性并增强对海藻来源单糖的耐受性。选择C. glutamicum DSM 20300则基于其乳酸代谢能力、高比生长速率及GRAS认定。各乳酸菌种的储备培养物在无菌条件下制备：将1.5 mL处于指数生长期的MRS肉汤（PanReac Applichem）培养物转移至含300 µL预先灭菌甘油的2 mL无菌冻存管中。C. glutamicum储备物的制备程序类似，区别在于该菌株预先在BBL™ Trypticase™ Soy Broth（TSB）中培养。所有微生物菌株储存于-80°C。
【数据】冻存管规格：2mL；冻存保护剂：300µL无菌甘油；培养物体积：1.5mL；储存温度：-80°C
2.3 种子培养基与接种物制备
制备两种接种物：包含L. rhamnosus、L. brevis、L. casei和L. plantarum的乳酸菌联合菌群（4LAB），以及纯培养的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。四株乳酸菌分别在MRS培养基中、100 mL锥形瓶装70 mL培养基、37°C、100 rpm轨道振荡条件下单独培养。C. glutamicum在TSB培养基中、30°C、200 rpm条件下培养。锥形瓶直接接种1.8 mL取自2.2节所述工作储备培养物的冻存管。细胞在生长16–18小时后收获，对应指数生长期末期。在生物反应器实验中，各乳酸菌株的体积经计算以使生物反应器发酵试验开始时OD600达到0.2。对于C. glutamicum顺序发酵，选择OD600为2.0。两种试验中，收集所需培养体积并在6000 × g、4°C条件下离心15分钟。随后无菌弃去上清液，沉淀用0.5%（w/v）NaCl溶液重悬，以初始发酵液体积的10%（v/v）作为接种物使用。
【数据】LAB培养温度：37°C；转速：100rpm；培养时间：16-18h；C. glutamicum培养温度：30°C；转速：200rpm；接种OD600：0.2（4LAB）/2.0（C. glutamicum）；离心条件：6000 × g，4°C，15min；重悬液：0.5%（w/v）NaCl；接种比例：10%（v/v）
2.4 摇瓶试验
使用C. glutamicum进行摇瓶试验，培养基组成为：40 mL/L玉米浆（CSL；COPAM – Companhia Portuguesa de Amidos, S.A.，葡萄牙）、2 g/L柠檬酸氢二铵、0.2 g/L Image 1001、0.05 g/L Image 1002及磷酸钾缓冲液（pH 6.5，0.1M）。此培养基组成在前期工作中已组装用于LAB生长并替代MRS肉汤[11]。碳源方面，测试了不同浓度的L(+)-乳酸（5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L、30.0 g/L、40.0 g/L）。该试验旨在确定C. glutamicum对乳酸的耐受性，同时检验使用LAB培养基培养该菌株的适用性。对照试验选用2.75 g/L一水合葡萄糖作为碳源，因为葡萄糖存在于TSB中——TSB是推荐用于棒杆菌生长的培养基[34]。试验在500 mL摇瓶中进行，每瓶装50 mL培养基。所有摇瓶的初始pH用2M NaOH调至7.0。将C. glutamicum培养物悬液（OD600 = 1.0）接种至预先灭菌的摇瓶中，置于轨道摇床（Agitorb200，ARALAB，葡萄牙）中，200 rpm、30°C条件下培养。通过定期无菌取样监测C. glutamicum生长及葡萄糖和乳酸消耗，持续30小时。所有试验均设两次重复。
【数据】培养基组分：40 mL/L CSL、2 g/L柠檬酸氢二铵、0.2 g/L Image 1001、0.05 g/L Image 1002、磷酸钾缓冲液（pH 6.5，0.1M）；乳酸浓度梯度：5.0/10.0/20.0/30.0/40.0 g/L；对照碳源：2.75 g/L一水合葡萄糖；初始pH：7.0（2M NaOH调节）；装液量：50 mL/500 mL摇瓶；接种OD600：1.0；培养条件：200 rpm，30°C；监测时间：30h；重复数：2
2.5 海藻残渣的酶法处理
为进行石花菜残渣的酶解，将连接控制单元及Electrolab Fermentation Manager软件（Fermac 320，Electrolab）的2-L生物反应器容器装入1 L浆液，其中含125 g/L湿重藻类原料和Milli-Q®水。反应器随后在高压灭菌器中于121°C灭菌30分钟，冷却至50°C。用2M H₂SO₄将浆液pH调至4.8。酶预处理在生物反应器中的无菌海藻浆液上进行，条件如下。由β-葡萄糖苷酶NS 22118（250 EGU/g）和Celluclast™（700 EGU/g）（Novozymes，丹麦）组成的酶 cocktail，浓度分别为0.75 mg/mL和1.3 mg/mL，以Milli-Q®水配制，按175 µL/g生物质干重的剂量加入灭菌的生物质浆液中。生物反应器控制参数设置为匹配酶cocktail的最适活性条件，即pH 4.8、温度50°C、无菌条件。pH用2M H₂SO₄和15%（w/v）NH₄OH维持，搅拌速度设为500 rpm。水解进行24小时，随后将水解液冷却至37°C，用15%（w/v）NH₄OH将pH调至6.5以进行乳酸发酵，详见2.6节。
【数据】底物浓度：125 g/L湿重；灭菌条件：121°C，30min；酶解温度：50°C；酶解pH：4.8；酶用量：175 µL/g生物质干重；酶配方：β-葡萄糖苷酶NS 22118（250 EGU/g）0.75 mg/mL + Celluclast™（700 EGU/g）1.3 mg/mL；搅拌速度：500rpm；水解时间：24h；pH调节剂：2M H₂SO₄和15%（w/v）NH₄OH
2.6 乳酸发酵
石花菜残渣水解后，反应器中的水解液无菌补充培养基组分以达到2.4节所述限定培养基组成（不含磷酸钾缓冲液）。生物反应器控制参数调整为乳酸发酵条件——溶解氧（DO）设为5%饱和度，pH设定点为6.5。搅拌速度和空气流速基于溶解氧（DO）设定点以级联模式控制。该策略中，首先调整搅拌速度以维持DO在设定范围内（50–200 rpm，以更好地维持微好氧环境）。若搅拌达到上限而DO仍低于设定点，则增大空气流量，最高至1.0 L/min。生物反应器接种按2.3节所述制备的4LAB接种物，发酵以1.25 L初始体积开始。生物反应器以补料分批模式运行，初始水解液糖耗竭后加入浓缩葡萄糖溶液（600 g/L）。补料速率控制在维持葡萄糖浓度2.5–25 g/L之间。指数生长期采用连续补料，速率根据先前发酵中测得的葡萄糖消耗速率确定，并逐小时调整以匹配观察到的需求。指数期后，葡萄糖补料以脉冲方式添加，由生物反应器中测得的葡萄糖浓度触发，以避免积累或耗竭。发酵持续126小时，定期无菌取样监测活细胞数、糖消耗、代谢物形成和蛋白质含量。总浆液体积通过记录补料溶液和pH调节溶液（2M H₂SO₄溶液和15%（w/v）NH₄OH溶液）的添加量计算。取样体积和蒸发量也予以考虑。蒸发速率通过从计算所得最终体积中减去最终测得的发酵液体积，再除以总发酵时间估算。
【数据】DO设定值：5%饱和度；pH设定值：6.5；搅拌范围：50-200rpm；最大空气流量：1.0L/min；初始体积：1.25L；补料葡萄糖浓度：600g/L；葡萄糖维持范围：2.5-25g/L；发酵时间：126h
2.7 顺序发酵
对于顺序发酵，首先按2.6节所述进行52小时乳酸发酵。随后无菌收集反应器内容物，在8000 × g条件下离心……（原文此处截断）
【数据】首次乳酸发酵时间：52h；离心条件：8000 × g（原文未详述完整离心参数）
研究结果
3.1 石花菜海藻残渣批次表征
琼脂提取后海藻残渣的表征对于确定其作为发酵原料的潜力以及评估发酵后营养价值的提升至关重要。表征结果见表2。石花菜工业残渣的总碳水化合物含量（27.3 ± 3.0 g/100 g DW）显著低于相应原料藻的报道值（通常为50–60 g/100 g DW）[52]。这一降低在预期之中，因为先前的琼脂提取过程去除了大部分多糖组分，从而降低了碳水化合物对生物质组成的贡献。然而，剩余碳水化合物中仍有相当一部分为琼脂（13.3 ± 1.4 g/100 g DW），未在工业加工过程中被回收，而纤维素占14.0 ± 2.3 g/100 g DW。本研究中观察到的琼脂含量与Mateus等[36]报道的值（12.5 ± 3.0 g/100 g DW）相当，但这些作者报道了较高的纤维素含量（22.4 ± 1.3 g/100 g DW）。工业残渣的蛋白质含量（18.5 ± 0.7 g/100 g DW）与Ashoush等[53]报道的粗石花菜13.2 ± 1.1 g/100 g DW相比呈现明显增加，这可能是因为琼脂提取过程中去除了大部分碳水化合物组分。该值略低于其他石花菜残渣的报道值，即Trigueros等[54]的21 ± 1 g/100 g DW和Faraj等[55]的25 g/100 g DW。这种变异性可能源于季节和地理差异、提取工艺的不同，以及蛋白质定量方法的差异——先前研究使用凯氏定氮法，而本研究使用氨基酸总和法。所得灰分含量（22.8 ± 2.1 g/100 g DW）与红藻观察值一致，Faraj等[55]的研究表明34个不同物种的平均值为22.9 ± 11 g/100 g DW。类似地，脂质含量（0.6 ± 0.05 g/100 g DW）接近石花菜属的报道值，通常在0.7–2.2 g/100 g DW范围内[53]。在评估工艺可重复性和可放大性时，应考虑石花菜残渣的组成变异性——这种变异性源于供应商差异、地理来源、季节性生长、收获条件、环境因素及琼脂提取加工条件的差异。这种变异性可能显著影响水解液组成，进而影响发酵性能，这强调了在加工前进行生物质表征的重要性。因此，尽管所提出的工艺可能适用于来自不同工业来源或地点的生物质，但批次特异性表征对于评估工艺可行性并确保一致性能仍然至关重要。
【数据】总碳水化合物：27.3 ± 3.0 g/100 g DW；琼脂：13.3 ± 1.4 g/100 g DW；纤维素：14.0 ± 2.3 g/100 g DW；蛋白质：18.5 ± 0.7 g/100 g DW；灰分：22.8 ± 2.1 g/100 g DW；脂质：0.6 ± 0.05 g/100 g DW
3.2 酶解
在最终调整培养基组成之前，先在生物反应器中对残渣中的纤维素进行酶解以产生葡萄糖。在所有试验中，酶解处理均表现出高效率，释放了总可释放葡萄糖的91.6%。选择24小时为最佳水解时长，特别是考虑到酶cocktail溶液未经灭菌，将水解延长至此时限以上会导致葡萄糖被微生物污染物部分消耗，并产生乳酸等微生物代谢物。用于预处理的酶成本是实际应用中的重要考量；需要进行全面的技术经济分析以评估大规模可行性，尽管酶回收策略（如固定化或膜过滤回收）和降低酶载量有助于提高成本效益。
【数据】葡萄糖释放率：91.6%（占总可释放葡萄糖）；最佳水解时间：24h
3.3 4LAB发酵
酶解后，海藻水解液（总浆液）补充矿物质培养基和玉米浆（2.6节），并加入LAB接种物（2.3节）。培养持续126小时，结果见图1。图1(b)所示的细胞生长结果揭示了发酵最初2.5小时内的短暂延迟期，随后进入指数生长期，在大约18小时趋于稳定。该指数期与葡萄糖消耗和乳酸产生速率的稳定增加相关，如图1(a)所示，同时蛋白质含量也增加。观察到的生长动力学紧密遵循典型微生物生长模式，表明初始底物几乎没有或完全没有抑制作用。这意味着本研究中使用的酶解液缺乏可能阻止细胞增殖的抑制性化合物。将葡萄糖浓度维持在25 g/L以下是为了防止乳杆菌的生长和代谢抑制，因为高葡萄糖水平已被证明会对这些过程产生不利影响[56]。36小时后，观察到乳酸产生速率显著下降，伴随总活细胞浓度降低，对生物量和乳酸生产力均有明显影响。此时，葡萄糖补料基于反应器中的葡萄糖浓度进行控制，通过HPLC分析监测。总蛋白质含量在剩余发酵时间内也停止增加。乳酸产生的减少可能意味着代谢转变——发酵产生的能量从支持生长转向维持pH平衡，如de Oliveira等[57]所提出的。该假说得到乙偶姻浓度增加的支持——乙偶姻是为缓解培养基酸化而产生的代谢物，代价是乳酸产量下降。在Lactobacillus lactis中已有类似的代谢转变记录：好氧条件下乙偶姻的产生增强了细胞存活率[58]。尽管发酵过程中维持了微好氧条件，但溶解氧（DO）水平控制不一致——偏离5%的目标值——可能触发了从厌氧代谢向好氧代谢的转变。这种转变可能使丙酮酸流向乙偶姻而非乳酸。乳酸生产力的下降也可能归因于产物抑制——高乳酸浓度增加渗透压，从而抑制乳杆菌的代谢活性，如Cui等[59]所述。为减轻这些抑制效应，可探索使用灌注反应器。这种系统能够连续去除乳酸，可能同时提高生长和乳酸生产力。Cui等[59]展示了类似的方法，他们成功利用阴离子交换树脂在发酵过程中去除乳酸。发酵在126小时后终止，此时乳酸产生完全停止，最终浓度为101 g/L。蛋白质方面，整个发酵过程中仅产生总量8.4 g，最终浓度为8.0 ± 0.2 g/L，大部分在前24小时内产生。乳酸和蛋白质的产率及生产力见表3，列出其最大值和终值。蛋白质产率方面，该发酵实现了1.2 g SCP/g初始蛋白质（初始蛋白质为原料提供的蛋白质）。乳酸生产方面，这些结果相较于其他补料分批发酵有所改进，特别是与de Oliveira等[57]报道的在与本研究所用条件极为相似的情况下实现0.65 g/(L·h)生产力的研究相比。然而，如文献[60,61]所示，带有乳酸去除的补料分批发酵和连续发酵……
【数据】延迟期：2.5h；指数期稳定时间：约18h；乳酸最终浓度：101g/L；蛋白质总产量：8.4g；蛋白质终浓度：8.0 ± 0.2 g/L；蛋白质产率：1.2 g SCP/g初始蛋白质；发酵总时长：126h
讨论与解读
本研究成功建立了利用石花菜工业残渣作为可持续底物、通过顺序发酵策略生产具有增强营养和功能特性的单细胞蛋白（SCP）的可行工艺。该生物过程包括酶解、乳酸菌（LAB）发酵及随后的谷氨酸棒杆菌好氧培养，展示了将未充分利用的海洋副产物有效增值为高附加值蛋白质原料的路径。酶预处理高效释放可发酵糖，实现91.6%的水解产率，为微生物生长提供了无抑制作用的适宜培养基。使用四株乳杆菌联合菌群的首次发酵产生了高滴度乳酸（101 g/L），冻干全发酵液的蛋白质生物可及性增至80.1 ± 5.9%，而海藻残渣为28.2 ± 4.6%。全发酵液粉末根据其PDCAAS评分也是极好的蛋白质来源。此外，其低分子量肽段比例增加，提示了生物活性潜力，随后通过其抗氧化特性得到证实。该发酵经离心后产生两个组分：富含生物量的沉淀和富含乳酸的上清液。沉淀的蛋白质含量提高至37.4 ± 0.7 g/100 g DW，生物可及性改善至62.9 ± 6.0%，并具有抗氧化特性。
编译者解读
该研究以"顺序发酵"策略为核心——先用乳酸菌将藻渣中的糖转化为乳酸并同步富集蛋白，再用谷氨酸棒杆菌消耗乳酸继续产蛋白——实现了同一底物的两级增值。方法上的亮点在于酶解与发酵在同一生物反应器内衔接，减少工艺单元操作；对乳酸菌发酵后期代谢转向乙偶姻的机制分析，也为工业放大中的pH调控和产物抑制问题提供了诊断思路。局限在于酶解液未灭菌导致的时间窗口限制，以及蛋白质总产量绝对值仍偏低（8.4 g/126 h），距离商业化尚有距离。未来若结合乳酸在线移除和连续发酵，有望进一步提升过程经济性。
参考来源
Marques, D. J. (2026). Lactobacilli consortium and Corynebacterium glutamicum sequential cultivation to produce single cell protein (SCP) from seaweed by-products. Algal Research. DOI: 10.1016/j.algal.2026.104818
DOI: 10.1016/j.algal.2026.104818