来源：Enhanced tyrosine production in Corynebacterium glutamicum via AroG A178V, RNase J deficiency, and carbon flux redirection（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酪氨酸是芳香族氨基酸家族的重要成员，在医药、食品和化工领域应用广泛。谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为工业氨基酸生产的主力菌株，其酪氨酸合成能力长期受制于反馈抑制和碳代谢流分配不均两大瓶颈。本研究从一株苯丙氨酸生产菌KY10694中鉴定出AroG A178V点突变是解除分支酸变位酶（CM）反馈抑制的关键遗传基础，并创新性地将RNase J缺失引入酪氨酸生产菌株，结合pheA与ppc基因的逐步缺失实现碳流重定向，最终在2 L发酵罐中将酪氨酸产量从5.45 mM提升至24.8 mM，增幅达4.5倍。
研究背景
谷氨酸棒杆菌的酪氨酸生产长期依赖于两条经典策略：引入抗反馈抑制的酶突变体以及重定向碳代谢流。然而，经典反馈去调控表型的遗传基础尚未完全阐明，转录后调控在酪氨酸合成中的作用也鲜有报道。本研究聚焦于三个关键问题：一是鉴定苯丙氨酸生产菌KY10694中aroG-csm区域反馈去调控表型的具体突变位点；二是考察RNase J缺失对酪氨酸生产的调控效应；三是通过逐步工程策略进一步优化酪氨酸产量。研究整合了序列分析、酶活测定、转录组分析和发酵工程等手段，系统揭示了AroG A178V突变通过影响AroG-Csm复合物内部别构通讯来解除反馈抑制的分子机制。
研究方法
菌株、质粒与培养基
本研究所用菌株和质粒列于原文表1。谷氨酸棒杆菌常规培养采用Medium 7培养基（每升水含10 g hipolypepton、10 g酵母提取物、5 g氯化钠、5 g葡萄糖），并添加17.6 mM K₂HPO₄。大肠杆菌使用Luria–Bertani（LB）培养基常规培养。2 L罐酪氨酸发酵实验中，种子培养基为改良Medium 7（每升水含10 g hipolypepton、10 g酵母提取物、5 g氯化钠、10 g葡萄糖），添加35.2 mM K₂HPO₄；生产培养基为改良CGXII-YE培养基（每升水含20 g (NH₄)₂SO₄、1 g KH₂PO₄、1 g K₂HPO₄、0.25 g MgSO₄·7H₂O、13.2 mg CaCl₂·2H₂O、10 mg FeSO₄·7H₂O、10 mg MnSO₄·4H₂O、1 mg ZnSO₄·7H₂O、0.313 mg CuSO₄·5H₂O、0.0109 mg NiCl₂、200 μg生物素、30 mg原儿茶酸、100 μg硫胺素·HCl、10 g酵母提取物），并添加444 mM葡萄糖。需要时向培养基中添加卡那霉素（25 μg/mL）。培养pheA缺失菌株时，向改良CGXII-YE培养基中添加苯丙氨酸至终浓度0.7 g/L。该浓度参考了此前利用苯丙氨酸和酪氨酸营养缺陷型谷氨酸棒杆菌进行酪氨酸生产的研究（其中苯丙氨酸添加量为650 mg/L），同时基于本实验室初步观察——若不补充苯丙氨酸，相关pheA缺失菌株的生长会显著受损。固体培养基添加1.5%（w/v）琼脂。
重组DNA技术
本研究所用寡核苷酸由FASMAC Co., Ltd.（日本神奈川）合成，序列列于原文表S1。PCR使用Herculase II Fusion DNA Polymerase（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）。限制酶和连接酶（Ligation High Ver. 2）由Toyobo Co., Ltd.（日本大阪）提供。大肠杆菌转化采用Inoue法，谷氨酸棒杆菌转化采用电穿孔法。
菌株与质粒构建
携带rnj、pheA、pyc和ppc基因框内缺失的谷氨酸棒杆菌突变株通过两步同源重组法构建，使用自杀载体pK19mobsacB。构建pheA缺失质粒pK19-ΔpheA时，分别用寡核苷酸对ΔpheA-1/ΔpheA-2和ΔpheA-3/ΔpheA-4扩增pheA基因两侧各约500 bp的上游和下游区域。以两个PCR产物为模板，用寡核苷酸ΔpheA-1和ΔpheA-4进行重叠延伸PCR。所得PCR产物（0.9 kb）用BamHI酶切后克隆至同样经BamHI线性化的pK19mobsacB中。pK19mobsacB衍生物向谷氨酸棒杆菌的转移及第一次和第二次重组事件的筛选按此前所述方法进行。所得卡那霉素敏感和蔗糖抗性克隆用各目标基因对应的寡核苷酸Δgene-1和Δgene-4进行PCR验证。携带目标框内缺失的克隆可扩增出0.9–1.0 kb的片段。
构建pTyrWT和pTyrKY时，将aroG和csm基因作为操纵子克隆至pCNKS。对于pTyrWT，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组DNA为模板，分别用寡核苷酸对aroG-F/aroG-R和csm-F/csm-R扩增野生型aroG和csm基因。对于pTyrKY，以谷氨酸棒杆菌KY10694基因组DNA为模板，使用相同的寡核苷酸对扩增来自KY10694的aroG和csm基因。两种情况下均用寡核苷酸aroG-F和csm-R通过重叠延伸PCR融合aroG和csm片段。所得PCR产物用KpnI和BamHI双酶切后连接至经相同限制酶消化的pCNKS，分别获得pTyrWT和pTyrKY。pTyrKY中aroG和csm的突变通过Sanger测序确认，测序使用寡核苷酸aroG-F、aroG-R、aroG-Seq、csm-F和csm-R。DNA测序在山口大学基因研究中心完成。
酪氨酸生产
谷氨酸棒杆菌衍生物用于酪氨酸生产。从预培养中收获早期稳定期的细胞，洗涤一次后重悬于0.9%（w/v）NaCl溶液中。将洗涤后的细胞接种至改良CGXII-YE培养基，初始OD₆₀₀约为0.5。主培养在2 L罐式发酵罐（NBC-2000；Mitsuwa Frontech，日本大阪）中进行，工作体积1 L。通气量为每分钟每体积培养基1体积空气（vvm），初始搅拌转速800 rpm；搅拌速度根据溶解氧（DO）自动调节，最大1200 rpm，以维持整个培养过程中DO浓度≥3.0 ppm。用14%（w/w）氨水维持pH 6.5。所有培养均在30°C下进行。当培养物OD₆₀₀达到约2.0–3.0时，添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM诱导酪氨酸生产。
【数据】培养基：Medium 7/改良CGXII-YE；卡那霉素：25 μg/mL；苯丙氨酸补充：0.7 g/L；IPTG：0.5 mM；温度：30°C；pH：6.5；通气：1 vvm；搅拌：800–1200 rpm；DO：≥3.0 ppm；接种OD₆₀₀：约0.5；诱导OD₆₀₀：约2.0–3.0；工作体积：1 L
分析方法
生长、残留葡萄糖、3-脱氢莽草酸、莽草酸和苯丙氨酸水平按此前所述方法测定。酪氨酸通过高效液相色谱（HPLC）定量，使用离子交换柱（IC YS-50，内径4.6 mm × 长度125 mm；Shodex，昭和电工株式会社，日本东京），配备示差折光检测器和二极管阵列检测器（检测波长210 nm）。柱温40°C，流动相为6 mM H₃PO₄，流速1.0 mL/min。为溶解沉淀的酪氨酸，将培养液等分试样（1.0 mL）与6 N HCl（50 μL）混合，65°C加热5 min。离心后取上清液进行HPLC分析。酪氨酸对葡萄糖的摩尔得率通过酪氨酸浓度增加量除以葡萄糖浓度减少量计算。诱导后体积产率通过IPTG诱导至葡萄糖耗尽期间酪氨酸浓度的增加量计算。
【数据】HPLC柱：IC YS-50（4.6 mm × 125 mm）；柱温：40°C；流动相：6 mM H₃PO₄；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；样品处理：1.0 mL培养液+50 μL 6 N HCl，65°C 5 min
酶活测定
粗提物按此前所述方法制备，略有修改。细胞在发酵罐中30°C培养，诱导后3 h离心收获，用冰预冷的0.2%（w/v）KCl溶液洗涤一次，−20°C保存备用。将细胞重悬于1.2 mL 40 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中，置于2 mL螺帽管中，加入0.6 g玻璃珠，用珠磨破碎仪（μT-12；Taitec，日本东京）以3200 rpm破碎10 min（10个循环，每循环30 s珠磨后冰上孵育30 s）。离心去除细胞碎片和玻璃珠，所得上清液对相同缓冲液透析6 h后用于酶活测定。粗提物中DS活性按Srinivasan和Sprinson的方法测定，CM活性按Cotton和Gibson的方法测定。简要而言，DS活性测定在250 μL反应体系中进行，含100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.4）、0.5 mM赤藓糖-4-磷酸、0.5 mM磷酸烯醇式丙酮酸和酶，30°C反应5 min。加入三氯乙酸终止反应，生成的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸经高碘酸裂解和亚砷酸盐淬灭后用硫代巴比妥酸法测定。产生的粉色发色团在549 nm处测定，摩尔消光系数为72 mM⁻¹cm⁻¹。CM活性测定在200 μL反应体系中进行……
【数据】粗提物制备：40 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）；珠磨：3200 rpm，10 min（10×30 s循环）；透析：6 h；DS活性测定：100 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.4），0.5 mM E4P，0.5 mM PEP，30°C，5 min；检测波长：549 nm；消光系数：72 mM⁻¹cm⁻¹
研究结果
鉴定AroG A178V为KY10694来源aroG-csm区域反馈调控改变的关键突变
为鉴定KY10694来源aroG-csm区域反馈调控改变表型所对应的突变，我们对整合至pTyrKY中的aroG和csm基因进行了Sanger测序，并与谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的亲本序列进行比较。序列分析揭示aroG第533位核苷酸发生C-to-T替换，导致A178V氨基酸替换，而csm中未检测到突变。
随后我们检验了该替换是否影响DS和CM活性及其受苯丙氨酸和酪氨酸的反馈抑制。以AD3/pCNKS为对照，在不存在或存在苯丙氨酸（30 mM）和酪氨酸（3 mM）的条件下，对AD3/pTyrWT和AD3/pTyrKY制备的粗提物进行酶活测定。虽然我们尝试测定DS活性，但在本实验条件下结果重现性不足，因此后续分析聚焦于CM活性。在不存在苯丙氨酸和酪氨酸时，AD3/pTyrWT和AD3/pTyrKY的CM比活力分别为27.3和21.0 mU/mg蛋白，而载体对照为3.84 mU/mg蛋白。在存在苯丙氨酸和酪氨酸时，载体对照和AD3/pTyrWT的CM活性显著下降，分别降至1.40和6.46 mU/mg蛋白，对应63.6%和76.3%的抑制率。相比之下，AD3/pTyrKY在存在这些氨基酸时CM活性未见显著下降（29.7 mU/mg蛋白），表明该酶在这些条件下未受到明显抑制（图2）。这些结果表明AroG中的A178V替换在很大程度上解除了CM活性受苯丙氨酸和酪氨酸的反馈抑制。
【数据】CM比活力（无氨基酸）：AD3/pTyrWT 27.3 mU/mg，AD3/pTyrKY 21.0 mU/mg，载体对照3.84 mU/mg；CM比活力（有氨基酸）：载体对照1.40 mU/mg（抑制63.6%），AD3/pTyrWT 6.46 mU/mg（抑制76.3%），AD3/pTyrKY 29.7 mU/mg（无显著抑制）
携带KY10694来源aroG-csm区域的菌株的酪氨酸生产
我们随后评估了携带KY10694来源aroG-csm区域的菌株在发酵罐中能否高效生产酪氨酸。AD3/pTyrKY在含444 mM葡萄糖的改良CGXII-YE培养基中生长良好，葡萄糖在21 h内完全消耗（图3A和B）。在此条件下，酪氨酸、苯丙氨酸、3-脱氢莽草酸和莽草酸的最高浓度分别达到5.45、14.5、3.18和12.7 mM（图3C–F）。酪氨酸得率和体积产率分别为0.012 mol/mol葡萄糖和0.25 mM/h。3-脱氢莽草酸和莽草酸（均为芳香族氨基酸生物合成的中间代谢物）的大量积累与流向莽草酸途径的高通量一致。这些结果表明AD3/pTyrKY为后续工程改造提供了合适的酪氨酸生产背景。
【数据】葡萄糖消耗：21 h内完全消耗；酪氨酸最高浓度：5.45 mM；苯丙氨酸最高浓度：14.5 mM；3-脱氢莽草酸最高浓度：3.18 mM；莽草酸最高浓度：12.7 mM；酪氨酸得率：0.012 mol/mol葡萄糖；体积产率：0.25 mM/h
RNase J缺失增强酪氨酸生产
鉴于RNase J缺失此前与苯丙氨酸产量提高相关，我们考察了删除编码RNase J的rnj基因能否在KY10694来源aroG-csm背景下进一步提高酪氨酸产量。因此，将RNase J缺失菌株AD3 Δrnj/pTyrKY在与AD3/pTyrKY相同的发酵条件下培养。AD3 Δrnj/pTyrKY在发酵早期阶段的生长和葡萄糖消耗速度略慢于AD3/pTyrKY，但两株菌最终达到相同的最大OD₆₀₀（135），并在21 h内完全消耗葡萄糖（图3A和B）。在此条件下，RNase J缺失显著增强了酪氨酸生产。AD3 Δrnj/pTyrKY积累的酪氨酸高达10.0 mM，而AD3/pTyrKY为5.45 mM（图3C）。酪氨酸得率和体积产率分别为0.022 mol/mol葡萄糖和0.54 mM/h。苯丙氨酸产量也有所增加，但增幅较小，从14.5 mM增至16.4 mM（图3D）。相比之下，3-脱氢莽草酸和莽草酸的最高浓度分别从AD3/pTyrKY的3.18和12.7 mM降至AD3 Δrnj/pTyrKY的1.83和6.18 mM（图3E和F）。这些结果表明RNase J缺失在该背景下增强了芳香族氨基酸的生产，其中对酪氨酸积累的促进效应尤为显著。
【数据】最大OD₆₀₀：135（两株菌相同）；葡萄糖消耗：21 h内完全消耗；酪氨酸：AD3/pTyrKY 5.45 mM → AD3 Δrnj/pTyrKY 10.0 mM；苯丙氨酸：14.5 → 16.4 mM；3-脱氢莽草酸：3.18 → 1.83 mM；莽草酸：12.7 → 6.18 mM；酪氨酸得率：0.022 mol/mol葡萄糖；体积产率：0.54 mM/h
酪氨酸生产背景下RNase J缺失相关的转录组变化
为深入了解RNase J缺失促进酪氨酸增产的分子基础，我们比较了AD3/pTyrKY和AD3 Δrnj/pTyrKY在发酵罐培养诱导后3 h收获细胞的转录组。RNase J缺失菌株中多个参与莽草酸途径的基因转录水平升高（原文表2）。特别是aroG、aroB、aroE、aroK和aroC上调，而aroD和aroA基本不变。相比之下，aroF和csm下调。在这些基因中，aroF的下调（从422降至167 CPM，log2FC = −1.33）和aroC的上调（从135增至295 CPM，log2FC = 1.12）具有统计学显著性。值得注意的是，比对至aroG和csm的读数在RNase J缺失菌株中呈现相反趋势——aroG增加而csm减少。RNase J缺失还与中心碳代谢的广泛变化相关（原文表2）。在糖酵解基因中，fda和eno显著下调，分别从1886降至800 CPM（log2FC = −1.24）和从3427降至1591 CPM（log2FC = −1.11），而tpi显著上调，从783增至1636 CPM（log2FC = 1.06）。此外，pgi、gapA、gpmA和pyk也出现下调，而pfkA和pgk上调。参与磷酸戊糖途径的基因（包括zwf、pgl、rpi、tkt和tal）总体呈现下调趋势（原文表2）。TCA循环相关基因也呈现类似趋势，包括gltA、sucD、fum、mdh、mqo、aceA和aceB；其中aceA从205降至29.3 CPM（log2FC = −2.80），具有统计学显著性（原文表2）。除上述途径外，广泛的转录变化还影响多种细胞功能，包括细胞被膜生物合成和细胞分裂、翻译、RNA代谢、DNA复制/修复、氧化应激防御、金属稳态、肌醇利用和芳香族化合物分解代谢（补充表S2）。综合来看，这些数据表明RNase J缺失与广泛的调控重连相关，而非单一生物合成步骤的简单改变。
【数据】aroF：422 → 167 CPM（log2FC = −1.33）；aroC：135 → 295 CPM（log2FC = 1.12）；fda：1886 → 800 CPM（log2FC = −1.24）；eno：3427 → 1591 CPM（log2FC = −1.11）；tpi：783 → 1636 CPM（log2FC = 1.06）；aceA：205 → 29.3 CPM（log2FC = −2.80）
通过pheA和ppc缺失实现碳流重定向以进一步提高酪氨酸产量
鉴于RNase J缺失对酪氨酸产量的促进幅度大于苯丙氨酸（图3），我们首先删除了pheA——该基因编码预苯酸脱氢酶，是预苯酸分支流向苯丙氨酸的第一关键酶——以将分支点碳流导向酪氨酸生物合成。所得菌株AD4 ΔpheA/pTyrKY在与AD4/pTyrKY相同的发酵条件下培养，但培养基中添加0.7 g/L苯丙氨酸以支持生长。AD4 ΔpheA/pTyrKY的生长曲线与AD4/pTyrKY相似（图4A），并在21 h内完全消耗葡萄糖（图4B）。在此条件下，pheA缺失使酪氨酸产量从10.0 mM显著提高至21.7 mM（图4C）。酪氨酸得率和体积产率分别为0.048 mol/mol葡萄糖和1.2 mM/h。如预期所料，苯丙氨酸积累被消除，补充的苯丙氨酸在培养结束时逐渐降至1 mM以下（图4D）。此外，3-脱氢莽草酸和莽草酸的最高浓度从1.83和6.18 mM分别降至……（原文后续数据未提供完整数值）
【数据】酪氨酸：10.0 → 21.7 mM（pheA缺失后）；酪氨酸得率：0.048 mol/mol葡萄糖；体积产率：1.2 mM/h；苯丙氨酸补充：0.7 g/L；培养结束时补充苯丙氨酸：<1 mM；葡萄糖消耗：21 h内完全消耗
讨论与解读
本研究鉴定出AroG A178V是KY10694来源aroG-csm区域反馈去调控表型的遗传基础，并证明该突变可与RNase J缺失及碳流重定向有效组合以提升谷氨酸棒杆菌的酪氨酸产量。由于csm中未检测到突变，而KY10694来源aroG-csm区域显著改变了CM活性对苯丙氨酸和酪氨酸的反馈响应，AroG A178V很可能是该表型的主要决定因素。这一解释与谷氨酸棒杆菌AroG–Csm复合物的酶间别构模型一致——芳香族氨基酸与AroG的结合影响CM活性——也与结核分枝杆菌中同源AroG–Csm系统的研究相符。值得注意的是，结核分枝杆菌AroG的同源结构中A178位于苯丙氨酸结合口袋附近，该位点与酶间别构直接相关。因此，A178V替换很可能扰乱了AroG–Csm复合物内部的别构通讯，而非直接改变Csm本身。由于结论基于粗提物中CM活性的测定，且DS活性在本实验条件下无法获得足够好的重现性，当前数据支持AroG A178V改变反馈调控的解释。
编译者解读
本研究展现了一条清晰的代谢工程升级路径：从经典诱变菌株中逆向鉴定有益突变，再与现代合成生物学工具叠加。AroG A178V的发现再次印证了"菌株本身蕴藏答案"的策略价值——通过全基因组测序回溯经典表型的遗传基础，比盲目设计突变体更加高效。RNase J缺失带来的转录组广泛重连则提示，RNA代谢层面的全局调控是氨基酸生产菌株优化的潜在新维度。三步工程策略（去调控+调控重连+碳流重定向）的递进逻辑值得借鉴，但pheA缺失后需外源补充苯丙氨酸的代价，以及RNase J缺失对多种细胞功能的广泛影响，提示工业化应用时需权衡营养需求与菌株稳健性。未来若能将A178V突变精细解析至结构层面，或可指导更具普适性的别构位点设计。
参考来源
Kataoka, N. Enhanced tyrosine production in Corynebacterium glutamicum via AroG A178V, RNase J deficiency, and carbon flux redirection. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026.
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.06.007
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.06.007