新分离谷氨酸棒状杆菌PP80用于高温L-谷氨酸发酵的研究

📅 2026-09-10 📰 Journal of Biotechnology 2026-11-30 📂 研究进展 👁 12

来源：Newly isolated Corynebacterium glutamicum strain PP80 for use in high-temperature L-glutamic acid fermentation（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

大规模工业发酵过程中微生物代谢产生大量热量，导致培养温度升高，严重抑制细胞生长和氨基酸产量。本研究从泰国土壤中分离出天然耐热的谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）新菌株PP80，在37–39°C高温下经青霉素触发发酵可维持40 g/L以上的L-谷氨酸产量，优于模式菌株KY9002及耐热菌株C. suranareeae N24。PP80在高温下保持较高细胞活力，且青霉素诱导的富磷脂膜囊泡增加幅度小于KY9002，提示其细胞表面特性与高温发酵性能相关。该菌株为高温L-谷氨酸发酵提供了无需实验进化的天然候选菌株。

研究背景

谷氨酸棒状杆菌是好氧革兰氏阳性菌，工业上广泛用于发酵生产多种氨基酸，尤其是L-谷氨酸和L-赖氨酸。在氨基酸发酵过程中，菌株面临热、渗透压和氧化等多种胁迫。大规模工业发酵释放大量代谢热，使培养温度升高，严重损害细胞生长与氨基酸合成。因此，L-谷氨酸和L-赖氨酸生产通常分别在30°C及低于35°C条件下进行。利用耐热微生物在较高温度下实现稳定发酵，可降低冷却能耗。实验进化虽已成为获得耐热微生物的有效手段，但从天然高温生境中分离耐热菌株仍是活跃且有价值的方向。

研究方法

2.1 菌株

以模式菌株谷氨酸棒状杆菌KY9002（ATCC 13032）作为参考菌株。以C. suranareeae N24——一种最近报道的耐热物种，能在高于40°C的温度下产生L-谷氨酸——作为比较菌株。此外，采用与N24分离方法类似的手段，从泰国采集的土壤样品中新分离出三株棒状杆菌PP80、PP25和I2L，并评估其在高温下的生长和L-谷氨酸发酵性能。

【数据】菌株：C. glutamicum KY9002 (ATCC 13032)、C. suranareeae N24、新分离株PP80/PP25/I2L；来源：泰国土壤

2.2 细菌培养条件

菌株在–80°C、25%甘油中保存。常规培养时，将甘油储备液划线接种于Luria-Bertani（LB）或AR琼脂平板（1.5%）。AR培养基按先前描述方法配制。预培养时，从LB或AR琼脂平板挑取单菌落，接种于含5 mL相应液体培养基的试管中，于30°C、200 rpm振荡培养。生长比较实验中，将1 mL过夜预培养物转接至500 mL带挡板摇瓶中的100 mL 1%葡萄糖基本培养基，于指定温度、200 rpm振荡培养。

【数据】保存条件：–80°C、25%甘油；培养基：LB或AR琼脂（1.5%）；预培养：5 mL液体培养基、30°C、200 rpm；生长比较：100 mL 1%葡萄糖基本培养基、500 mL挡板摇瓶、200 rpm

2.3 L-谷氨酸生产罐发酵培养

500 mL罐发酵：从琼脂平板取两环细胞接种至500 mL带挡板摇瓶中的50 mL 4%葡萄糖预培养培养基（每升，pH 7.2：40 g葡萄糖、20 g聚蛋白胨、3 g尿素、1.5 g KH₂PO₄、0.5 g K₂HPO₄、0.5 g MgSO₄·7H₂O、10 μg生物素），于30°C、200 rpm振荡培养12 h。取37.5 mL预培养液接种至500 mL罐中300 mL 12%葡萄糖主培养培养基（每升，pH 7.5：120 g葡萄糖、2 g (NH₄)₂SO₄、3 g KH₂PO₄、1 g MgSO₄·7H₂O、30 mg FeSO₄·7H₂O、30 mg MnSO₄·7H₂O、100 μg生物素、1 mg硫胺素）。在指定温度下，以750 rpm搅拌、通气量1.0 vvm培养。

2 L罐发酵：从琼脂平板取一环细胞先接种至300 mL带挡板摇瓶中的20 mL AR培养基，于30°C、200 rpm振荡培养15 h。然后取1.5 mL预培养液接种至3 L摇瓶中的300 mL 4%葡萄糖预培养培养基，于30°C、200 rpm振荡培养24 h。随后取125 mL预培养液接种至2 L罐中1 L 12%葡萄糖主培养培养基，于750 rpm、1.0 vvm条件下培养。

两种罐发酵中，主培养均在30°C起始，青霉素按上述方式添加。青霉素添加后，培养温度按实验设计调控：维持在30°C、控制不超过37°C或39°C（仅当培养温度接近设定点时启动冷却系统），或不进行主动温度控制（关闭冷却器）。当600 nm光密度（OD₆₀₀）达到15–25时，添加青霉素G钾盐至终浓度5 U/mL。两种罐发酵中，pH均以28%氨水控制在7.0。

【数据】500 mL罐预培养：50 mL 4%葡萄糖培养基、30°C、200 rpm、12 h；接种量：37.5 mL/300 mL；主培养：12%葡萄糖、pH 7.5、750 rpm、1.0 vvm；2 L罐预培养：20 mL AR培养基、30°C、200 rpm、15 h，再300 mL 4%葡萄糖培养基、24 h；接种量：125 mL/1 L；青霉素终浓度：5 U/mL；添加时机：OD₆₀₀ 15–25；pH控制：7.0（28%氨水）

2.4 细胞和膜囊泡制备

取2 L罐培养液样品（60或120 mL），于10,000 × g离心10 min，分离细胞与培养上清。细胞沉淀用20 mM磷酸钾缓冲液（KPB；pH 7.5）洗涤两次，用于后续分析。为获得膜囊泡，将培养上清进一步于133,500 × g离心90 min，收集粗膜囊泡。膜囊泡沉淀重悬于≤1.0 mL含5 mM MgSO₄的50 mM KPB（pH 7.5）中并匀浆。悬液于6000 × g离心2 min两次以去除残余碎片，所得上清于221,000 × g离心60 min。最终膜囊泡沉淀重悬于0.1–0.5 mL相同缓冲液中，使用前短暂超声处理。

【数据】离心条件：10,000 × g/10 min（细胞分离）；133,500 × g/90 min（粗膜囊泡）；6000 × g/2 min×2（除碎片）；221,000 × g/60 min（最终膜囊泡）；缓冲液：20 mM或50 mM KPB（pH 7.5）+ 5 mM MgSO₄

2.5 细胞生长测定

细胞生长通过紫外-可见分光光度计测定OD₆₀₀监测。部分实验中测定干重：将细胞悬液收集于预称重的微量离心管中，用20 mM KPB（pH 7.5）洗涤，细胞沉淀于60°C烘箱中干燥并置于干燥器中（或直接在干燥器中干燥），重复干燥与称重直至重量不再下降。活菌数通过平板涂布测定：收集细胞悬液，用150 mM KCl洗涤，在150 mM KCl中系列稀释（10⁻⁵–10⁻⁶），取各稀释液100 μL涂布于AR琼脂平板。

【数据】生长监测：OD₆₀₀；干重测定：60°C烘箱干燥；活菌计数：150 mM KCl洗涤、10⁻⁵–10⁻⁶系列稀释、100 μL涂布AR平板

2.6 脂质分析

膜囊泡总脂质含量使用荧光染料FM4–64按先前描述方法定量。磷脂采用Bartlett磷酸盐测定法定量：先按Bligh和Dyer方法从膜囊泡中提取脂质。提取脂质中含分枝菌酸的糖脂和磷脂采用薄层色谱（TLC）分析，使用Silica Gel 60 F254板。以氯仿/甲醇/H₂O（70.2:25.5:4.3）展层20–25 min，空气干燥。糖脂和磷脂条带分别用苔黑酚/H₂SO₄和钼蓝试剂显色，随后于120°C加热2 h。迁移位置与海藻糖联分枝菌酸酯（TDCM）和海藻糖单分枝菌酸酯（TMCM）一致的条带，根据其苔黑酚/H₂SO₄阳性染色及相对已报道的C. glutamicum ATCC 13032脂质TLC图谱的迁移位置，初步判定为推定TDCM和TMCM。由于缺乏TDCM和TMCM标准品，该判定仅为初步。心磷脂和磷脂酰甘油通过与相同TLC条件下分析的标准品比较，以钼蓝试剂显色鉴定。

【数据】总脂质定量：FM4–64荧光染料；磷脂定量：Bartlett法；TLC展层：氯仿/甲醇/H₂O（70.2:25.5:4.3）、20–25 min；显色：苔黑酚/H₂SO₄（糖脂）、钼蓝（磷脂）、120°C/2 h

2.7 胞外L-谷氨酸和葡萄糖分析

从主培养中取1 mL样品，于12,000 rpm离心5 min，上清中L-谷氨酸和葡萄糖浓度按制造商说明书使用商业检测试剂盒测定。L-谷氨酸使用L-谷氨酸检测试剂盒（Yamasa NEO，Yamasa Corporation，千叶，日本）测定，其原理为L-谷氨酸被L-谷氨酸氧化酶氧化，产生的H₂O₂通过过氧化物酶依赖的显色反应定量。葡萄糖使用葡萄糖（GO）检测试剂盒（Sigma-Aldrich）测定，基于葡萄糖氧化酶/过氧化物酶比色反应。

【数据】样品量：1 mL；离心：12,000 rpm/5 min；L-谷氨酸检测：Yamasa NEO试剂盒（酶法）；葡萄糖检测：GO试剂盒（酶法）

2.8 蛋白质含量测定

蛋白质含量采用改良Lowry法测定，以牛血清白蛋白为标准。全细胞蛋白测定时，将干燥细胞样品重悬于0.5 mL含1% SDS的0.4 N NaOH中，超声数次至完全溶解。悬液与等体积（0.5 mL）1% SDS混合，于60°C加热30 min，然后进行Lowry测定。

【数据】蛋白定量：改良Lowry法；标准品：牛血清白蛋白；细胞溶解：1% SDS/0.4 N NaOH、60°C/30 min

2.9 扫描电子显微镜（SEM）

从培养中收集的细胞用50 mM KPB（pH 7.0）洗涤两次。细胞沉淀用同缓冲液配制的2.5%戊二醛固定2–3 h。后续处理和SEM观察按先前描述方法进行。

【数据】固定：2.5%戊二醛/50 mM KPB（pH 7.0）、2–3 h

2.10 基因组测序、组装与注释

全基因组测序使用Illumina测序平台完成。测序与组装流程的详细信息见补充材料。

【数据】测序平台：Illumina；组装细节：原文未详述（见补充材料）

研究结果

3.1 不同温度下分离棒状杆菌菌株的生长比较

为筛选高温下维持高发酵性能的菌株，将新分离自泰国土壤的三株棒状杆菌PP80、PP25和I2L与模式菌株C. glutamicum KY9002（ATCC 13032）——代表性L-谷氨酸生产菌株——以及C. suranareeae N24——分离自泰国、能在40°C以上产生L-谷氨酸的耐热菌株——进行比较。首先，基于全基因组系统发育树考察三株分离菌与其他C. glutamicum菌株及作为外群的C. suranareeae的亲缘关系。如图1所示，三株分离菌均属于C. glutamicum分支。PP25和PP80形成与KY9002不同的亚簇，而I2L位于不同分支。以模式菌株KY9002为参照评估系统发育距离时，PP25和PP80最近，其次为I2L——后者在C. glutamicum分支中距离最远。

▲ 基于2144个棒状杆菌菌株直系同源核苷酸序列构建的最大似然法基因组系统发育树。

随后比较各分离菌与C. glutamicum KY9002和C. suranareeae N24在LB平板上的最大生长温度（图2a）。所有受试菌株在37°C以下生长相似。然而，KY9002和I2L在39°C时生长显著减弱，在41°C几乎不生长；而PP80、N24和PP25在39°C下仍保持旺盛生长。其中N24和PP25在41°C生长良好，PP80在41°C仅微弱生长。菌落在较高培养温度下逐渐变黄。同时比较了1%葡萄糖基本培养基中的液体培养生长（图2b）。I2L因在平板上高温生长能力低于KY9002而被排除；PP25虽耐热性高，但L-谷氨酸产量极低（见下文），也被排除。N24在41°C以下均有显著生长；PP80在37°C以下生长良好，39°C时生长略有下降，41°C几乎不生长。KY9002的生长随温度从30°C升至39°C逐渐下降，41°C时显著减弱。

▲ Growth comparison of several Corynebacterium strains on LB plates (a) and in flask cultures (b). (a) Corynebacterium strains KY9002, PP80, PP25, I2L, and N24 were precultured overnight in 5 mL of AR medium at 30 °C, streaked onto LB agar plates, and incubated at 30, 37, 39 and 41°C (left to right) f

【数据】平板生长：所有菌株≤37°C生长相似；KY9002/I2L：39°C显著减弱、41°C几乎不生长；PP80/N24/PP25：39°C旺盛生长；N24/PP25：41°C良好生长；PP80：41°C弱生长。液体培养（1%葡萄糖基本培养基）：N24≤41°C显著生长；PP80≤37°C良好、39°C略降、41°C几乎不生长；KY9002随30→39°C逐渐下降、41°C显著减弱

3.2 分离耐热棒状杆菌菌株的L-谷氨酸发酵能力

本研究旨在获得适合高温L-谷氨酸发酵的菌株，以筛选耐胁迫生产菌。因此，在500 mL罐中、30、37和39°C条件下，考察各分离菌在青霉素触发的L-谷氨酸生产条件（12%葡萄糖）下的生长和L-谷氨酸生产能力（图3）。所有批次培养均在30°C起始。青霉素添加后，培养温度维持在30°C，或允许升高但不超过37°C或39°C。在此条件下，PP25生长速率较慢，青霉素添加后OD₆₀₀显著下降，L-谷氨酸产量低于2 g/L。相比之下，KY9002、PP80和N24在所有测试温度下均表现出较好的生长，且在30°C下产生较高量的青霉素触发L-谷氨酸（>40 g/L）。当生长温度从30°C升至37和39°C时，KY9002的L-谷氨酸滴度大幅下降，而PP80和N24即使在高温下仍维持较高产量（>25 g/L）。然而，在37和39°C下，青霉素触发发酵条件下N24的细胞生长和L-谷氨酸产量均低于PP80。因此，摇瓶培养中固有的生长耐热性并不能必然预测L-谷氨酸发酵性能。在这些菌株中，PP80在所有测试温度下均表现出最高产率，且在39°C下仍保持>40 g/L的滴度。这些结果表明，PP80是所测菌株中最适合高温L-谷氨酸生产的菌株。KY9002、PP80和N24在测试温度控制条件下的葡萄糖消耗和L-谷氨酸得率汇总于表S2。尽管潜在机制尚不清楚，PP80和PP25尽管基因组关系密切却表现出截然不同的表型：PP80在高温下维持L-谷氨酸生产，而PP25在青霉素添加后生长不良，L-谷氨酸产量低于2 g/L。

▲ Cell growth (a) and L-glutamic acid production (b) by Corynebacterium strains KY9002, PP80, and N24 (left to right) in 500-mL jar fermentors. Each strain was cultivated in 300 mL of 12% glucose production medium in a 500-mL jar fermentor. In all runs, cultures were initiated at 30°C and, after penic

【数据】PP25产量：<2 g/L；30°C产量（KY9002/PP80/N24）：>40 g/L；37–39°C产量（PP80/N24）：>25 g/L；PP80在39°C：>40 g/L；N24在37–39°C低于PP80

3.3 C. glutamicum PP80的温度依赖性L-谷氨酸发酵

基于上述结果，进一步使用放大规模的2 L罐考察PP80的L-谷氨酸生产（图4）。2 L罐实验中增设了无温度控制条件——青霉素添加后培养温度不进行主动控制。虽然500 mL和2 L系统采用相同的基本温度控制策略，但两种规模下L-谷氨酸生产曲线略有差异，可能反映混合、气液传质和热响应方面的规模依赖性差异。发酵结束时，所有主动控温培养——即全程维持30°C，或青霉素添加后允许升高但不超过37°C或39°C——中初始葡萄糖几乎全部消耗。这些结果表明，L-谷氨酸滴度的差异反映的是PP80的代谢性能而非底物消耗不完全。当培养温度控制在37或39°C时，PP80产生近50 g/L的L-谷氨酸；相应的底物得率汇总于表S2。青霉素添加后无主动温度控制的培养中，PP80产生>40 g/L的L-谷氨酸，略低于37和39°C条件下的产量——尽管发酵温度最高升至41°C。当罐冷却系统设定为37或39°C时，培养温度在发酵后期逐渐下降，可能是因为代谢活动和产热停止。

▲ Growth (red lines) and L-glutamic acid production (blue lines) of C. glutamicum PP80 in 2-L jar fermentor cultures (a). In all runs, cultures were initiated at 30°C and, after penicillin addition, the temperature was (i) maintained at 30°C, (ii) controlled to not exceed 37°C, (iii) controlled to not

【数据】37/39°C控温培养产量：近50 g/L；无温度控制培养：>40 g/L（最高温度41°C）；发酵结束时主动控温培养中葡萄糖几乎全部消耗

3.4 温度和青霉素对C. glutamicum PP80与KY9002细胞生长及细胞表面特性的比较分析

为表征青霉素触发发酵中与维持L-谷氨酸生产相关的表型差异，使用2 L罐培养比较PP80与KY9002的细胞生长、活力、形态和膜囊泡产生。KY9002中，对数生长早期添加青霉素显著干扰细胞生长；不添加青霉素时OD₆₀₀为70–80，添加青霉素培养8 h后降至20–26。青霉素（5 U/mL）强烈抑制PP80的生物量积累，与KY9002中观察到的现象一致（图5a）。所有培养均在30°C起始，温度控制模式在相当于青霉素添加的时间点启动。因此，8 h后测定的干重包含了30°C共同初始生长阶段积累的生物量。不添加青霉素时，所有温度控制条件下KY9002的最终干重均高于PP80。然而，在随后8 h期间，30°C、≤37°C和≤39°C条件下，KY9002的干重分别增加6.0、7.5和6.8倍，PP80分别增加7.0、7.2和7.5倍。可见，温度特异阶段的生物量积累在两菌株间相当。添加青霉素后，KY9002和PP80在所有测试温度控制条件下的干重均降至对应无青霉素水平的≤30%。

▲ 在有或无青霉素处理的2-L罐发酵培养谷氨酸棒杆菌KY9002和PP80中，总细胞质量(a)和细胞活力(b)的变化。所有培养物初始均在30°C下生长。在添加青霉素时，或在无青霉素培养物的对应时间点，

青霉素处理后，KY9002的活菌数随时间延长而下降，而PP80在37°C和39°C下保持较高的细胞活力（图5b）。扫描电子显微镜观察显示，37°C培养中，青霉素处理后KY9002细胞出现明显的表面损伤和变形，而PP80细胞形态相对完整（图6）。两菌株在青霉素处理后均产生膜囊泡，但PP80产生的富磷脂膜囊泡增加幅度小于KY9002（图7a）。薄层色谱分析显示，两菌株膜囊泡中推定TDCM和TMCM的条带模式存在差异（图8）。这些结果表明，PP80在高温青霉素触发条件下维持细胞表面完整性方面优于KY9002，这可能是其高温发酵性能较好的原因之一。

▲ Scanning electron microscopy (SEM) of the cell morphology of KY9002 and PP80 cultivated at 37°C in a 2-L jar fermentor. Cells were collected 6 h after penicillin addition (Pen +) or without penicillin addition (Pen −), and processed for SEM.

▲ Membrane vesicle (MV) generation and changes in lipid and phospholipid contents of MVs in 2-L jar fermentor cultures of C. glutamicum KY9002 and PP80. MVs were prepared from 60 or 120 mL of cultures grown at 30, 37, or 39°C with (Pen +) or without (Pen −) penicillin treatment. (a) Total lipid conten

▲ TLC profile of putative mycolic acid-containing glycolipids and phospholipids in membrane vesicles released from C. glutamicum KY9002 and PP80 in 2-L jar fermentor cultures. Membrane vesicles were prepared as described in Fig. 7. (a) Lipids extracted from membrane vesicles (150 μg lipid per lane) we

【数据】KY9002无青霉素OD₆₀₀：70–80；青霉素处理后8 h：20–26；干重增长（8 h，KY9002）：6.0倍（30°C）、7.5倍（≤37°C）、6.8倍（≤39°C）；干重增长（8 h，PP80）：7.0倍（30°C）、7.2倍（≤37°C）、7.5倍（≤39°C）；青霉素处理后干重：≤无青霉素水平的30%

讨论与解读

为扩展青霉素触发L-谷氨酸发酵的操作温度窗口，本研究分离了多株谷氨酸棒状杆菌并评估其高温生长与L-谷氨酸生产能力。PP80在37和39°C下比KY9002生长更旺盛，显示更强的耐热性；但PP80在39和41°C下的生长不及耐热菌株C. suranareeae N24。然而，PP80在37–39°C的L-谷氨酸发酵中优于KY9002和N24。这些结果表明，无青霉素摇瓶培养中的固有生长耐热性本身不能预测青霉素触发L-谷氨酸发酵中的表现。500 mL与2 L罐实验采用相同的基本温度控制策略，但绝对生产曲线存在一定差异，提示规模效应对发酵性能的影响不容忽视。PP80在高温下维持较高的细胞活力，且青霉素诱导的膜囊泡变化与KY9002不同，提示细胞包膜特性可能与其高温发酵性能相关。

编译者解读：本研究以"天然耐热菌株筛选"替代"实验进化"策略，从泰国土壤中直接分离出高温发酵性能优良的PP80菌株，避免了实验室进化所需的长周期与不确定性。其亮点在于将生长耐热性与发酵耐热性明确区分——N24虽生长耐热性更强，但发酵性能不及PP80，提示高温谷氨酸发酵的菌株筛选应直接以发酵性能为标准而非仅看生长能力。PP80在无主动控温条件下仍能产酸>40 g/L，对工业降温成本控制具有实际意义。不足之处在于TDCM/TMCM鉴定缺乏标准品，膜囊泡变化与产酸维持之间的因果关系尚需进一步验证。

参考来源

Kataoka N. Newly isolated Corynebacterium glutamicum strain PP80 for use in high-temperature L-glutamic acid fermentation. Journal of Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.08.005

DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.08.005

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