来源：Effects of an endophyte Aspergillus niger in controlling internal browning of pineapple and its biosafety assessment（Postharvest Biology and Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
菠萝采后内部褐变（IB）是导致其品质劣变和经济损失的重大生理病害。本研究系统评估了内生真菌黑曲霉S（Aspergillus niger S）对菠萝采后品质的影响，并从形态学、基因组学和代谢产物三个层面开展了严格的生物安全性评估。结果证实，该菌株通过调控抗坏血酸-谷胱甘肽循环增强果实抗氧化能力，有效延缓衰老并抑制IB发生；同时确认其为不产赭曲霉毒素A和伏马菌素B的非产毒菌株，可作为安全的生物保鲜剂。
研究背景
菠萝是全球商业价值最高的热带水果之一，但采后内部褐变这一生理失调常导致品质迅速劣化，严重降低果实商品价值。IB主要表现为果实内部核心附近果肉组织褐变，而外表无可见症状，常规分选手段难以察觉，造成巨大经济损失。已有多种防控策略被探索，包括外源施用脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯等植物激素，但受限于不同贮藏条件下的效果不稳定或操作复杂，迄今尚未建立商业可行且持续有效的方法。内生菌作为共生定殖于植物内部组织而不引起负面症状的微生物类群，近年来因其环境可持续性和高效生物防治潜力而备受关注。本研究基于前期从菠萝果实中分离获得的内生真菌黑曲霉S，系统表征其对果实品质的影响，并对其作为菠萝保鲜剂的生物安全性进行严格评估。
研究方法
2.1 果实材料与处理
菠萝果实（Ananas comosus L. cv ‘Comte de Paris’）于商业成熟期（特征为果皮绿色略带微黄）采自中国广东省湛江市的商业种植园。采收后，果实在20 ± 1°C控温条件下于24小时内运抵实验室。选取大小均匀（平均重量约700 g）、无明显机械损伤或病理症状的果实进行后续采后处理。内生真菌黑曲霉S（前期从菠萝果肉中分离并保存于本实验室）在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上于25°C培养10天。随后用无菌蒸馏水收集分生孢子，调整至浓度为5 × 10⁷ cfu·mL⁻¹的标准孢子悬浮液。通过细雾喷洒将孢子悬浮液施用于单个果实表面，对照果实喷洒等体积蒸馏水。试验采用完全随机设计，设三个生物学重复，每个重复包含30个果实。处理后，果实以打孔聚乙烯薄膜（厚度0.04 mm）包裹，于20 ± 1°C贮藏18天。整个贮藏期间监测生理指标和品质参数。
【数据】果实品种：Comte de Paris；采后温度：20 ± 1°C；孢子浓度：5 × 10⁷ cfu·mL⁻¹；薄膜厚度：0.04 mm；贮藏温度：20 ± 1°C；贮藏时间：18天；生物学重复：3个，每重复30个果实
2.2 菠萝IB指数和黄化指数的评估
为评估IB指数，在每个贮藏时间点将菠萝果实纵向切成两半。IB强度采用五级评分制：0级，0–5%褐变；1级，6–25%褐变；2级，26–50%褐变；3级，51–75%褐变；4级，76–99%褐变；5级，100%褐变。计算各处理的平均IB强度。果实表面黄化指数同样采用五级评分制：0级，0%黄化；1级，1–10%黄化；2级，11–25%黄化；3级，26–50%黄化；4级，51–75%黄化；5级，76–100%黄化。计算各处理的平均黄化强度。
【数据】IB分级：0–5级（0–100%褐变区间）；黄化分级：0–5级（0–100%黄化区间）
2.3 菠萝挥发性风味物质的检测
采用配备10个金属氧化物传感器的电子鼻系统（PEN3，Win Muster Air-sense Analytics Inc.，德国）检测贮藏菠萝的挥发性风味物质谱。检测方法参照本课题组前期报道（Lai et al., 2024）进行。
【数据】电子鼻型号：PEN3；传感器数量：10个金属氧化物传感器
2.4 总可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）的测定
取菠萝果肉100 g，切成小块，匀浆后收集汁液。总可溶性固形物（TSS）、可滴定酸（TA）和可溶性蛋白含量按前期报道的方法测定（Lu et al., 2011）。
【数据】果肉用量：100 g；测定指标：TSS、TA、可溶性蛋白
2.5 过氧化氢（H₂O₂）和丙二醛（MDA）的定量
H₂O₂浓度按照本课题组前期研究方法测定（Zhang et al., 2015）。丙二醛（MDA）含量作为膜脂过氧化和细胞完整性的指标，参照前期报道的方法进行评估（Luo et al., 2011）。
【数据】测定指标：H₂O₂浓度、MDA含量
2.6 抗氧化成分与酶活性的评估
菠萝果肉中还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的浓度采用商业试剂盒（苏州格瑞斯生物科技有限公司，中国）测定，严格按制造商说明书操作。抗坏血酸（AsA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的水平参照前期报道的方法测定（Costa et al., 2002）。AsA-GSH循环中关键酶的活性——包括抗坏血酸过氧化物酶（APX；EC: 1.11.1.11）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR；EC: 1.8.5.1）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR；EC: 1.6.5.4）——按前期报道的方法测定（Zhou et al., 2017）。为进行转录水平验证，使用基因特异性引物（表S2），通过RT-qPCR方法分析AcAPX3、AcMDHAR和AcDHAR的相对表达水平，方法参照前期报道（Léchaudel et al., 2018; Song et al., 2025）。
【数据】测定指标：GSH、GSSG、AsA、DHA、APX、DHAR、MDHAR活性及相应基因表达
2.7 黑曲霉菌株的形态学特征描述
参考菌株黑曲霉P和黑曲霉N购自北京北纳生物有限公司（中国北京）。黑曲霉N为不产赭曲霉毒素A（OTA）和伏马菌素B（FB）的非产毒菌株（Yeun Kim et al., 2014），而黑曲霉P为已确认的OTA和FB共产菌株（Frisvad et al., 2011）。所有供试黑曲霉菌株均在PDA上活化并于25°C培养10天。用无菌蒸馏水收集分生孢子，制备标准孢子悬浮液（10⁶ cfu·mL⁻¹）。为评估宏观生长特征，取1 μL悬浮液点接于PDA平板中央，于25°C黑暗中培养。10天后，系统记录菌落直径、形态、边缘特征和色素沉着等形态学参数。微观评估中，使用光学显微镜（BX53，Olympus，东京，日本）检查菌丝和分生孢子制片。通过显微摄影记录分生孢子头结构和分生孢子形态的细节。
【数据】孢子悬浮液浓度：10⁶ cfu·mL⁻¹；接种量：1 μL；培养温度：25°C；培养时间：10天；培养基：PDA
2.8 黑曲霉菌株的分子鉴定与系统发育分析
采用优化的CTAB法从真菌菌丝中提取总基因组DNA（Koh et al., 2021）。使用通用引物ITS1和ITS4扩增内转录间隔区（ITS）区域（含5.8S rDNA）。所有扩增反应在20 μL体系中进行，包含1 μL模板DNA、0.5 μL各引物、8 μL ddH₂O和10 μL 2× Taq PCR StarMix（含上样染料）。热循环程序如下：95°C初始变性4分钟；随后35个循环的95°C变性60秒、55°C退火60秒、72°C延伸60秒；最后72°C终延伸8分钟。PCR产物由上海桑尼生物工程有限公司纯化并测序。使用MEGA 6.0版进行系统发育分析。序列比对通过Clustal W执行，采用邻接法（NJ）构建系统发育树。
【数据】PCR体系：20 μL（模板DNA 1 μL + 引物各0.5 μL + ddH₂O 8 μL + 2× Taq PCR StarMix 10 μL）；PCR程序：95°C 4min；35个循环（95°C 60s，55°C 60s，72°C 60s）；72°C 8min
2.9 OTA和FB生物合成核心基因的基因组筛查
为确定OTA和FB产生的遗传基础，采用优化的CTAB法提取供试菌株DNA（Koh et al., 2021），并通过PCR扩增筛查核心生物合成同源基因的存在。OTA生物合成涉及的5个核心基因——卤化酶基因（HAL）、碱性亮氨酸拉链转录因子基因（BZIP）、非核糖体肽合成酶基因（NRPS）、聚酮合酶基因（PKS）和P450氧化酶基因（P450）——以及FB生物合成所需的10个关键基因——FUM1、FUM8、FUM14、FUM3、FUM6、FUM7、FUM10、FUM13、FUM15和FUM21——使用基因特异性引物（表S3）进行扩增，方法参照前期报道（Gil-Serna et al., 2018; Palumbo et al., 2013; Susca et al., 2016）。PCR反应按前期报道进行，扩增产物进一步通过1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳分析，以确认这些产毒标记基因的存在或缺失（Gil-Serna et al., 2019）。
【数据】筛查基因：OTA相关5个（HAL、BZIP、NRPS、PKS、P450）；FB相关10个（FUM1、FUM3、FUM6、FUM7、FUM8、FUM10、FUM13、FUM14、FUM15、FUM21）；凝胶浓度：1.0%（w/v）琼脂糖
2.10 不同培养条件下OTA和FB积累的动力学评估
为评估黑曲霉S的产毒潜力，在多种培养基质和环境参数下检测其合成霉菌毒素的能力。为评估OTA产生能力，将分生孢子悬浮液接种至PDA、酵母提取物蔗糖（YES）和麦麸（WB）培养基中；平板随后于15°C、25°C或30°C黑暗中培养21天。OTA浓度使用专用ELISA试剂盒（北京勤邦生物技术有限公司，中国）每7天间隔定量检测。
【数据】培养基：PDA、YES、WB；培养温度：15°C、25°C、30°C；培养时间：21天；检测间隔：7天；检测方法：ELISA试剂盒
研究结果
3.1 黑曲霉S对菠萝IB的减轻与衰老的延缓作用
在20°C贮藏12天后，对照组菠萝的IB症状变得非常明显，导致采后品质显著劣化（图1A）。这些观察与前期研究结果一致，即IB症状通常在采后9至12天之间显现（Lai et al., 2024）。然而，与对照相比，采后施用黑曲霉S显著降低了IB指数（P ≤ 0.05）。伴随成熟进程，菠萝果皮逐渐黄化（图1B），这一生理变化通常会缩短采收果实的货架期。而黑曲霉S处理有效降低了黄化指数，表明采后成熟和衰老被显著延缓。这种成熟延缓很可能与果肉中IB的抑制存在内在关联，因为IB的发生常与果实衰老相关。上述结果表明，黑曲霉S处理通过延缓果实衰老和抑制IB发生延长了菠萝的贮藏寿命。
【数据】贮藏温度：20°C；IB显著降低：P ≤ 0.05；IB症状显现时间：采后9–12天
3.2 黑曲霉S处理对菠萝贮藏期间营养品质的影响
黑曲霉S处理组和对照组的TSS含量在贮藏期间均逐渐下降。然而，在贮藏第3、6和9天，黑曲霉S处理果实的TSS显著高于对照组（图1C）。类似地，黑曲霉S处理果实的TA含量得到明显维持，在第3、6和12天显著高于未处理果实（图1D）。此外，在整个贮藏期间，黑曲霉S处理有效维持了果肉中较高水平的可溶性蛋白（图1E）。这些结果证实，采后施用黑曲霉S保持了菠萝贮藏期间的营养品质。
【数据】TSS显著升高时间点：第3、6、9天；TA显著升高时间点：第3、6、12天；可溶性蛋白：整个贮藏期均较高
3.3 黑曲霉S处理对菠萝贮藏期间挥发性风味物质谱的影响
复杂而丰富的挥发性有机化合物谱是菠萝果实的特征，其释放水平通常随成熟进程而增强。电子鼻分析显示，在整个贮藏期间，黑曲霉S处理组和对照组的挥发性化合物总体响应值均呈一致上升趋势（图2A）。具体而言，靶向氮氧化物（W5S）、烷烃（W1S）、含硫有机化合物（W1W）、醇类/酸类/酮类（W2S）以及含硫和含氯有机化合物（W2W）的传感器响应值随时间持续增加。在传感器阵列中，W5S、W1W和W2W传感器的响应值最为突出，表明这些是菠萝贮藏期间释放的主要挥发性化合物类别。比较分析显示，在贮藏后期（第6、9和12天），黑曲霉S处理果实中这些关键传感器的响应值显著低于对照组（图2B）。这些结果与处理组观察到的黄化指数降低高度一致，因为香气释放的延迟可作为果实成熟和衰老延缓的生理指标。
【数据】关键传感器：W5S、W1W、W2W；显著降低时间点：第6、9、12天
3.4 黑曲霉S处理对菠萝贮藏期间抗氧化能力的影响
在整个贮藏期间，菠萝果肉中观察到H₂O₂的逐渐积累，随后MDA含量显著增加（图3A、B）。AsA和GSH是果肉组织中的主要非酶抗氧化剂。随着活性氧（ROS）的积累，这些分子分别被氧化转化为脱氢抗坏血酸（DHA）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），导致AsA/DHA和GSH/GSSG比值显著降低，加剧了膜脂过氧化，并与贮藏期间菠萝IB指数的升高密切相关（图1A）。然而，黑曲霉S处理显著提高了AsA和GSH水平，从而在整个贮藏期间维持了更高的AsA/DHA和GSH/GSSG比值（图3C–H）。此外，黑曲霉S处理有效激活了AsA-GSH循环中关键酶——APX、DHAR和MDHAR——的活性（图S1）。相应地，黑曲霉S处理菠萝中相应基因——AcAPX3、AcDHAR和AcMDHAR——的转录水平在整个贮藏期间显著上调（图S1）。这些结果表明，黑曲霉S处理通过调节AsA-GSH循环途径增强了采后菠萝的抗氧化能力。
【数据】H₂O₂：逐渐积累；MDA：显著增加；AsA/DHA和GSH/GSSG比值：处理组显著更高；APX、DHAR、MDHAR活性及基因表达：显著上调
3.5 黑曲霉菌株的鉴定
内生黑曲霉S最初是在前期研究中从菠萝果实中分离获得（Shen et al., 2024）。为阐明黑曲霉S与参考菌株黑曲霉N（非产毒）和黑曲霉P（产毒）之间的系统发育关系，扩增并测序了各菌株的真菌rDNA ITS区域。序列分析显示，黑曲霉N和P的rDNA ITS片段长度为568 bp，而黑曲霉S的片段为571 bp。采用邻接法评估分离菌株的分类地位。所得系统发育树显示，这些分离菌株聚类在属于黑曲霉的单一支系中，从而确认了它们作为黑曲霉属成员的身份（图4A）。然而，这种高度的序列相似性并不能用于区分这些黑曲霉菌株中的产毒菌株和非产毒菌株。
【数据】ITS片段长度：黑曲霉N和P为568 bp，黑曲霉S为571 bp；系统发育方法：邻接法
3.6 供试黑曲霉菌株的形态学特征描述
将黑曲霉S的宏观和微观特征与参考菌株黑曲霉N（非产毒）和黑曲霉P（产毒）进行比较。这些分离菌株的形态学特征与黑曲霉物种聚合群的既定描述一致（Li et al., 2020）。在PDA培养基上培养时，黑曲霉S和黑曲霉N的菌落正面和反面均呈现均匀的棕色至深棕色色素沉着（图4B）。然而，黑曲霉P表现出独特的形态特征——中央深色区域被明显的黄色圆形外围所环绕。显微分析显示，三个菌株均产生半球形至放射状结构的深棕色分生孢子头（图4B）。但黑曲霉P的分生孢子头直径明显小于黑曲霉S和N。所有分离菌株的分生孢子表型相似，呈球形，色素沉着从无色到深棕色不等，表面纹理从光滑到粗糙。总体而言，黑曲霉S的菌落形态与非产毒参考菌株黑曲霉N一致，但与产毒参考菌株黑曲霉P存在显著差异。
【数据】培养基：PDA；培养条件：25°C，10天；分生孢子头直径：黑曲霉P明显小于黑曲霉S和N
3.7 黑曲霉菌株中OTA和FB生物合成核心基因的基因组筛查
黑曲霉中OTA的生物合成由保守的基因簇介导，包含PKS、HAL、BZIP和NRPS（图5A、B）。类似地，FB的产生需要FUM基因簇的协同作用，包括FUM1、FUM3、FUM6–8、FUM10、FUM13–15和FUM21（图5C、D）（Wang et al., 2018）。为评估黑曲霉S的产毒潜力，以产毒菌株黑曲霉P和非产毒菌株黑曲霉N为参照，通过基因组PCR筛查检测这些核心生物合成基因的存在情况。结果表明，产毒菌株黑曲霉P中所有OTA和FB生物合成相关靶基因均成功扩增获得。
【数据】筛查基因：OTA相关（PKS、HAL、BZIP、NRPS）、FB相关（FUM1、FUM3、FUM6–8、FUM10、FUM13–15、FUM21）；黑曲霉P：全部基因扩增阳性
3.8 不同培养条件下黑曲霉菌株的生长谱与形态表现
将黑曲霉菌株分别接种于PDA、YES、CYAS和WB培养基上，在15°C、25°C和35°C条件下培养21天，比较其生长谱和形态表现。图6展示了不同环境条件下各黑曲霉菌株的生长差异。
【数据】培养基：PDA、YES、CYAS、WB；温度梯度：15°C、25°C、35°C；培养时间：21天
讨论与解读
内生菌是共生定殖于植物内部组织而不引起明显负面症状的微生物。近年来，源于植物的内生菌因其环境可持续性和高效生物防治效果而受到广泛关注。前期研究成功从菠萝中分离出内生真菌黑曲霉S，并证明其作为菠萝IB生物防治药剂的潜力。本研究进一步证实，采后施用黑曲霉S显著降低了贮藏期间菠萝果肉的IB指数。值得注意的是，黑曲霉S处理还通过降低黄化指数和减少挥发性有机化合物释放有效延缓了果实成熟和衰老。这些结果与营养品质的保持相一致——处理组果实的TSS、TA和可溶性蛋白水平显著更高。果实衰老与活性氧的过量积累密切相关，而黑曲霉S通过上调AsA-GSH循环关键酶活性及其基因表达，增强了果实的抗氧化防御能力。生物安全性评估方面，形态学特征显示黑曲霉S与非产毒参考菌株表型一致，与产毒菌株差异显著；基因组PCR筛查确认其缺乏OTA和FB生物合成的核心基因。黑曲霉S在不同培养条件下均未表现出OTA或FB的产毒潜力，确认其为非产毒菌株。
编译者解读：本研究在生物防治菌株开发中嵌入了系统化的安全性评估链条——从形态学比对、核心基因筛查到多条件培养下的代谢产物检测，为合成生物学视角下的食品保鲜菌株开发提供了完整范式。值得注意的是，ITS序列分析无法区分产毒与非产毒菌株，这提示单一分子标记在菌株安全性鉴定中存在局限。黑曲霉S对菠萝衰老的延缓效应与AsA-GSH循环的强化之间的因果关系，值得进一步通过基因敲除或过表达实验加以验证。该菌株作为内生菌的生物防治应用，也提示了微生物互作在采后病害防控中的潜力。
参考来源
Deng, Q. (2026). Effects of an endophyte Aspergillus niger in controlling internal browning of pineapple and its biosafety assessment. Postharvest Biology and Technology, 2026.
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114413
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114413