来源：Untargeted metabolomics reveals the synergistic mechanism of co-cultured Aspergillus niger and Rhodotorula mucilaginosa in lepidolite bioleaching（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
锂云母是重要的锂资源矿物，微生物浸出为低品位矿石提锂提供了绿色路径。本研究构建了黑曲霉（强产酸菌）与胶红酵母（强产EPS菌）的共培养体系，使锂浸出效率达6.48%，较单培养分别提高51.0%和73.7%。非靶向代谢组学揭示共培养显著上调支链氨基酸生物合成和色氨酸代谢通路，从分子层面阐明"酸解-络合-EPS界面反应-菌丝穿透"的多机制协同浸出模型。
研究背景
锂作为新能源时代的战略资源，其全球产量已从2010年的约28,000公吨跃升至2023年的180,000公吨以上，探明储量约2,600万公吨。预计到2030年全球电动汽车保有量将达4,000万辆，锂离子电池废弃物也将累积至约1,100万吨，而许多地区的回收率仍低于5%。锂主要来源于盐湖和硬岩矿床，仅靠盐湖卤水提取远不能满足需求。真菌-酵母共培养在强化硅酸盐矿物生物浸出方面潜力可观，但种间代谢互补与协同浸出机制在分子层面的认知仍十分有限。本研究构建了整合黑曲霉（强产酸菌）与胶红酵母（强产EPS菌）的共培养体系用于锂云母生物浸出，并结合非靶向代谢组学与矿物学表征解析协同机制。
研究方法
2.1 矿石
本研究所用锂云母样品采自中国新疆阿勒泰地区（坐标：47°14' N, 89°50' E），呈淡紫色、具珍珠光泽，化学式为KLi₁.₅Al₁.₅Si₃O₁₀F₂。X射线荧光光谱（XRF）分析显示主要含52% SiO₂、26.03% Al₂O₃、7.75% K₂O和3.79% Li₂O。实验前对原矿进行顺序纯化处理：先将原矿置于去离子水中超声清洗30 min（40 kHz）去除表面松散杂质；随后在室温下用1 M盐酸（HCl）连续搅拌酸洗2 h，去除碳酸盐和氧化物包覆层；酸处理后用去离子水至少冲洗5次直至上清液pH达中性；再将样品浸入95%乙醇中1 h去除有机污染物，随后再次用去离子水冲洗5次；最后在-50°C真空条件下冷冻干燥24 h以保持结构完整性。纯化后的矿物在玛瑙研钵中研磨，经标准不锈钢筛过筛获得200-300目（35-75 μm）颗粒用于生物浸出实验。
【数据】矿石来源：新疆阿勒泰（47°14' N, 89°50' E）；化学式：KLi₁.₅Al₁.₅Si₃O₁₀F₂；SiO₂：52%；Al₂O₃：26.03%；K₂O：7.75%；Li₂O：3.79%；超声清洗：30 min/40 kHz；酸洗：1 M HCl/2 h/室温；乙醇处理：95%/1 h；冷冻干燥：-50°C/24 h；粒径：200-300目（35-75 μm）
2.2 菌株与培养基
本研究所用黑曲霉和胶红酵母菌株分别来自中国医学微生物菌种保藏中心（编号98003）和上海生物资源中心（编号11820）。通过在以蔗糖为基础液体培养基中添加Li⁺（以LiCl形式）0、50、100、150、200和300 mg/L进行锂耐受性评估。培养条件为30°C、160 rpm、7天。生长抑制以相对于无Li⁺对照的干生物量（80°C干燥至恒重）减少百分比来量化。两株菌在200 mg/L Li⁺条件下均保持>85%的相对生物量产量（抑制率<15%），确认其耐受性。此外，在1%矿浆浓度下使用200 mg/L Li⁺适应菌株进行为期20天的预实验，确认其从锂云母中释放Li⁺的能力：黑曲霉达到3.68 ± 0.35 mg/L，胶红酵母达到3.21 ± 0.28 mg/L，共培养达到5.68 ± 0.42 mg/L，分别较单培养提高54.3%和76.9%。这些预实验结果指导了正式浸出实验参数的选择。真菌菌株经马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）和麦芽提取琼脂（MEA）培养基活化并制备孢子悬浮液，最终孢子浓度调整为10⁷ cells·mL⁻¹。孢子计数使用血球计数板（Neubauer improved，德国）在光学显微镜（×400）下进行。每个菌株进行三次独立计数，取平均值用于接种。标准蔗糖基础培养基（含100 g·L⁻¹蔗糖、1.5 g·L⁻¹ NaNO₃、0.5 g·L⁻¹ KH₂PO₄、0.025 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、0.025 g·L⁻¹ KCl和1.6 g·L⁻¹酵母提取物，pH调至7.0）用于矿物浸出实验。
【数据】菌株来源：CGMCC 98003（黑曲霉）/SBRC 11820（胶红酵母）；Li⁺耐受测试浓度：0-300 mg/L；培养条件：30°C/160 rpm/7天；200 mg/L Li⁺下相对生物量：>85%；预浸出实验：1%矿浆浓度/20天/200 mg/L Li⁺适应菌株；Li⁺释放量：AN 3.68±0.35 mg/L、RM 3.21±0.28 mg/L、共培养 5.68±0.42 mg/L；孢子浓度：10⁷ cells·mL⁻¹；培养基组成：蔗糖100 g·L⁻¹、NaNO₃ 1.5 g·L⁻¹、KH₂PO₄ 0.5 g·L⁻¹、MgSO₄·7H₂O 0.025 g·L⁻¹、KCl 0.025 g·L⁻¹、酵母提取物1.6 g·L⁻¹；pH 7.0
2.3 生物浸出实验
本研究设置三个实验组：黑曲霉浸出锂云母（AN组）、胶红酵母浸出锂云母（RM组）、黑曲霉与胶红酵母共浸出锂云母（AN+RM组）（实验设计见表S2）。单培养体系：将1 mL制备好的孢子悬浮液（1.0 × 10⁷ cells·mL⁻¹）接种至含100 mL无菌蔗糖培养基和1 g锂云母矿石（<75 μm）的250 mL锥形瓶中，浸出体系中最终细胞浓度约为1.0 × 10⁵ cells·mL⁻¹。共培养体系：先将两种孢子悬浮液分别用无菌培养基稀释至所需浓度，然后以等体积比（1:1，v/v）混合，获得含各菌株1.0 × 10⁷ cells·mL⁻¹的混合悬浮液。取1 mL混合悬浮液接种至相同浸出体系（100 mL培养基+1 g矿石），共培养瓶中各菌株终浓度为5.0 × 10⁵ cells·mL⁻¹。所有实验组（含无菌对照，即有矿无接种）均在30°C、160 rpm条件下培养60天，每组设三个独立重复。定期收集上清液测定Li⁺和有机酸浓度及EPS组分。通过冷冻离心收获生物量和残渣用于进一步表征。在产酸高峰期收集浸出液用于代谢组学分析。定期补充无菌培养基以补偿蒸发和取样损失。
【数据】接种量：1 mL孢子悬浮液（1.0×10⁷ cells·mL⁻¹）/瓶；体系体积：100 mL培养基+1 g矿石；单培养终浓度：~1.0×10⁵ cells·mL⁻¹；共培养终浓度：各菌株5.0×10⁵ cells·mL⁻¹；混合比例：1:1（v/v）；培养条件：30°C/160 rpm/60天；重复数：3
2.4 测试方法
浸出液pH使用台式pH计（PHSJ-4F，上海雷磁仪器有限公司）监测。Li⁺浓度通过石墨炉原子吸收光谱法（AAS；iCE 3500，Thermo Fisher Scientific，美国）按Text S1所述方法定量。有机酸采用高效液相色谱（HPLC；Agilent 1200系列，Agilent Technologies，美国）分析。EPS采用热水浴法（80°C，30 min）提取，随后蛋白质和腐殖酸含量变化通过三维激发-发射矩阵光谱（3D-EEM；Cary ECLIPSE，Agilent Technologies，美国）检测。物相转变采用X射线衍射（XRD；D-MAX2500，Rigaku Corporation，日本）分析。样品和残渣的形态特征及微区元素组成使用扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM；GeminiSEM 360，ZEISS Group，德国；EDS；Xplor 30，Oxford Instruments，英国）观察。傅里叶变换红外光谱（FT-IR；Nicolet iS20，Thermo Fisher Scientific，美国）用于研究浸出前后矿粉的化学结构、官能团和键合特征变化。此外，浸出后锂云母的表面化学和元素组成变化通过X射线光电子能谱（XPS；K-Alpha，Thermo Fisher Scientific，美国）分析。
【数据】EPS提取：80°C/30 min热水浴；仪器：PHSJ-4F pH计、iCE 3500 AAS、Agilent 1200 HPLC、Cary ECLIPSE 3D-EEM、D-MAX2500 XRD、GeminiSEM 360 SEM、Nicolet iS20 FT-IR、K-Alpha XPS——原文未详述各仪器检测参数
2.5 非靶向代谢组学分析
非靶向代谢组学分析采用超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UHPLC-HRMS/MS）。从1 mL浸出液样品（第15天采集，处于代谢物分泌高峰期）中提取代谢物：加入3 mL预冷的甲醇/乙腈/水（2:2:1，v/v/v）混合液（-20°C），涡旋30 s，4°C超声处理10 min（40 kHz），并于-20°C孵育1 h以沉淀蛋白质。4°C下14,000 × g离心15 min后，收集上清液并在温和氮气流下干燥。残留物用100 μL乙腈/水（1:1，v/v）复溶，经0.22 μm PTFE膜过滤后进行LC-MS分析。色谱分离在ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm内径，1.8 μm粒径；Waters Corporation，美国）上进行，柱温40°C。流动相为（A）含0.1%甲酸的水溶液（v/v）和（B）含0.1%甲酸的乙腈溶液（v/v）。梯度洗脱程序如下：0-2 min，1% B；2-15 min，1%至99% B线性梯度；15-18 min，保持99% B；18-18.1 min，返回1% B；18.1-22 min（原文此段止于此处）。
【数据】样品体积：1 mL（第15天）；提取液：甲醇/乙腈/水（2:2:1，v/v/v）3 mL/-20°C；涡旋30 s；超声：4°C/10 min/40 kHz；孵育：-20°C/1 h；离心：14,000×g/15 min/4°C；复溶：100 μL乙腈/水（1:1）；滤膜：0.22 μm PTFE；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温：40°C；流动相：0.1%甲酸水/0.1%甲酸乙腈；洗脱程序：0-2 min 1% B→2-15 min 1%-99% B→15-18 min 99% B→18-18.1 min 1% B→18.1-22 min（原文截断）
研究结果
3.1 pH值与Li⁺浸出浓度
pH变化可间接反映真菌生长过程中酸性代谢物的分泌情况。如图1所示，AN组pH在前7天内迅速下降，之后降速放缓，在第30天达到最低值1.98。RM组pH在前5天快速下降，随后出现波动，约在第30天达到最低值2.12，之后逐渐回升。AN+RM共培养组pH持续下降，在第25天达到最低值1.81。
相比之下，AN组pH在整个浸出过程中始终显著低于RM组，表明黑曲霉分泌酸性代谢物的能力强于胶红酵母。AN+RM组pH在整个浸出期间均低于两个单培养组，证明共培养通过种间互作显著增强了酸性代谢物的分泌。所有浸出组pH在浸出30天后均有所回升，这可能归因于后期培养基中养分耗竭，导致真菌代谢物释放减少甚至消耗其酸性代谢产物。
浸出液Li⁺浓度是评估真菌介导矿物溶解效果的主要指标。如图1所示，无菌对照组仅表现出极微弱的Li⁺释放，60天后最高浓度为0.26 mg/L，表明无菌培养基本身的浸出效果可忽略不计。相比之下，所有真菌浸出组的Li⁺释放均显著增强。AN组和RM组在60天期间Li⁺浓度均稳步上升，分别在第60天达到峰值5.75 mg·L⁻¹和5.01 mg·L⁻¹。AN+RM共培养组在早期阶段Li⁺浓度增长明显更快，在第40天达到最大值8.685 mg·L⁻¹。计算所得最终浸出效率为：AN组4.29%，RM组3.73%，AN+RM组6.48%。共培养体系的浸出效率较AN组和RM组分别提高51%和73.7%。AN+RM组的增强性能与共培养体系中观察到的较低pH高度吻合。由于pH在一定程度上反映酸性代谢物含量，有机酸产量的增加可能促进了锂的溶解。矿物中的金属离子在酸性条件下更易释放；较高的酸浓度提供更强的质子供体能力，从而强化酸解效应。Li⁺浓度的变化还受到生物质吸附和次生硅酸盐矿物中锂掺入的影响。
【数据】pH最低值：AN组1.98（第30天）、RM组约2.12（第30天）、AN+RM组1.81（第25天）；Li⁺峰值：AN组5.75 mg·L⁻¹（第60天）、RM组5.01 mg·L⁻¹（第60天）、AN+RM组8.685 mg·L⁻¹（第40天）；无菌对照最高Li⁺：0.26 mg/L（第60天）；浸出效率：AN 4.29% / RM 3.73% / AN+RM 6.48%；提升幅度：较AN组+51%、较RM组+73.7%
3.2 真菌代谢物分析
#### 3.2.1 有机酸检测
有机酸是公认直接控制生物浸出效率、在矿物溶解机制中起关键作用的主要代谢物。如图2所示，AN组和RM组的单一浸出体系在总有机酸分泌量和优势酸种方面表现出明显不同的特征。
AN组中，柠檬酸为主要有机酸，在第15天达到最高浓度14.7 g·L⁻¹，同时产生草酸、苹果酸和少量葡萄糖酸。RM组中，草酸为主要有机酸，在第3天达到峰值10.41 g·L⁻¹，其次是柠檬酸和葡萄糖酸。AN+RM共培养体系中，柠檬酸呈现独特的高产特征，约在第15天达到最高浓度17.96 g·L⁻¹。与单一浸出体系相比，共培养体系产生了更高的总有机酸输出，柠檬酸产量显著提升。
AN组中，柠檬酸产量在前15天快速增长，第15天达到最大值14.7 g·L⁻¹，随后逐渐下降至第60天的8.32 g·L⁻¹。这一下降与养分耗竭及稳定期/衰亡期的开始同步，此阶段有机酸可能通过TCA循环作为碳源被重新消耗以维持能量。RM组中，草酸在第3天迅速达到峰值10.41 g·L⁻¹，随后在第10天急剧下降至2.15 g·L⁻¹，表明草酸作为能量底物被快速利用。值得注意的是，胶红酵母可通过乙醛酸支路代谢草酸，将其转化为乙醛酸，进而生成苹果酸进入TCA循环产生ATP。AN+RM共培养中，柠檬酸在第15天达到17.96 g·L⁻¹，并保持相对较高的浓度（12.67 g·L⁻¹）直至第30天，之后逐渐下降。共培养中的持续产酸表明，两菌株间的代谢接力提供了连续的碳流，防止了酸的过早再消耗。这一时间模式表明，虽然有机酸兼具浸出剂和能量底物的双重角色，但在共培养体系中其产生优先服务于矿物溶解而非分解代谢消耗——这是提高生物浸出效率的关键协同特征。
真菌生物浸出的一个关键机制是有机酸分泌，通过酸解作用促进矿物溶解和金属释放；分泌的质子削弱金属离子键，促进其迁移进入溶液。在分泌的酸中，柠檬酸因其强酸性和多羧基结构而特别有效，较二元或一元羧酸更能强化金属浸出。AN组较RM组具有更高浸出效率因此归因于更高的柠檬酸产量。柠檬酸优异的络合能力已在蛇纹石生物浸出中得到证实。研究表明，在蛇纹石生物浸出过程中，柠檬酸与镍形成的络合物比其他有机酸更稳定，这是其具有优异镍提取效率的原因。这归因于其更高的解离常数，有利于络合物形成。AN+RM共培养的增强性能可能源于种间协同作用进一步刺激了有机酸分泌，尤其是对高效金属离子释放至关重要的柠檬酸。
【数据】柠檬酸峰值：AN组14.7 g·L⁻¹（第15天）、AN+RM组17.96 g·L⁻¹（第15天）；草酸峰值：RM组10.41 g·L⁻¹（第3天）；AN组柠檬酸第60天降至8.32 g·L⁻¹；RM组草酸第10天降至2.15 g·L⁻¹；AN+RM组柠檬酸第30天仍达12.67 g·L⁻¹
#### 3.2.2 EPS中蛋白质和腐殖酸的变化
如图3的3D-EEM荧光光谱所示，AN组和RM组EPS组分均主要由色氨酸类蛋白质、腐殖酸和类富里酸物质组成。
这些组分的荧光强度随时间呈现先增后减的趋势。然而，AN组的腐殖酸荧光强度弱于RM组，而蛋白质荧光强度更强，表明黑曲霉具有更强的蛋白质合成能力，胶红酵母具有更强的腐殖酸产生能力。与各自的单培养相比，AN+RM共培养在EPS基质中的腐殖酸和蛋白质含量均显著增加，暗示协同条件下真菌蛋白质合成增强。随着细胞生长和增殖，蛋白质成为EPS的主要结构组分。部分氨基酸可与金属形成络合物，提高浸出效率。当微生物进入衰亡期，浸出过程中形成的蛋白质等有机化合物开始降解，真菌中腐殖酸含量逐渐增加。腐殖酸有助于调节浸出过程中的pH并维持溶液稳定性，同时腐殖酸中的羟基等官能团可与金属配位形成螯合物。在AN+RM共培养中，两者均显著增加（原文段落截断于此）。
【数据】EPS提取：热水浴法80°C/30 min；3D-EEM结果：色氨酸类蛋白质、腐殖酸、类富里酸物质为主；AN组腐殖酸荧光弱于RM组、蛋白质荧光强于RM组；AN+RM组腐殖酸和蛋白质均高于单培养
3.3（原文结果部分后续内容未提供完整节选，以下为可获得的图表对应结果信息）
图4展示了生物浸出过程中多糖含量的变化。
图5展示了不同实验组浸出残渣的FT-IR光谱（a）和XRD图谱（b）。
图6为SEM图像：（a）无细菌的锂云母及浸出残渣：（b、c）AN组，（d、g）RM组，（e、f、h、i）AN+RM组。
图7为锂云母和浸出残渣的XPS光谱。
图8为KEGG通路富集气泡图（选取前30条）：（a）AN+RM vs AN和（b）AN+RM vs RM。
图9为黑曲霉与胶红酵母共培养浸出锂云母的联合浸出机制图。
图10（原文无图注）。
【数据】图4-图10对应数据原文未在节选部分详述
讨论与解读
本研究构建了黑曲霉与胶红酵母共培养体系以强化锂云母生物浸出并阐明真菌-酵母协同的代谢基础。共培养使锂浸出效率提升至6.48%，分别较AN和RM单培养提高51.0%和73.7%。这一提升与柠檬酸产量增加（17.96 g·L⁻¹）、EPS中蛋白质和腐殖酸类组分升高以及更强的矿物表面腐蚀相关。非靶向代谢组学显示支链氨基酸生物合成和色氨酸代谢通路富集，表明共培养促进了浸出过程中的碳/能量代谢和胁迫适应。综合浸出性能与FT-IR、XRD、SEM-EDS和XPS结果，提出的机制涉及有机酸驱动的酸解和络合作用、EPS介导的粘附与界面络合、氨基酸相关的代谢重构以及菌丝/细胞-矿物接触。尽管共培养较单培养提高了锂释放量，但绝对浸出效率对工业应用而言仍然有限。未来工作应优化矿浆浓度、营养供给、反应器操作和菌株比例，并将菌株特异性定量与酶活性测定相结合以验证直接的种间互作。
编译者解读
本研究以"功能互补"为设计逻辑，将强产酸菌与强产EPS菌配对，巧妙地将两种单培养各自"偏科"的代谢能力整合为协同体系。代谢组学证据将表型差异锚定到支链氨基酸合成和色氨酸代谢通路上，使"为什么共培养更好"不再停留于猜测。值得关注的是，共培养体系中柠檬酸产量超出单培养最优值，提示种间互作激活了超越简单加和的代谢重编程。然而6.48%的绝对浸出效率距离工业应用仍有距离，且菌株比例、营养供给等关键参数尚未系统优化。后续若能将合成生物学工具引入菌株改造——例如强化黑曲霉的柠檬酸合成通量或增强胶红酵母的EPS分泌——并实现两种功能在单一菌株内的正交整合，或可进一步突破效率瓶颈。
参考来源
期刊：Biochemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110390
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110390