来源：Coordinated reinforcement of energy and ammonia-donor supply enhances L-Histidine production in Escherichia coli（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-组氨酸是食品、医药和添加剂行业广泛应用的高价值氨基酸，但其生物合成需要大量前体、能量和氨供体，在大肠杆菌中实现高效生产一直颇具挑战。本研究系统优化了L-组氨酸生物合成途径与磷酸戊糖途径，结合发酵过程干预、转录组学分析和多重代谢工程策略，最终构建的工程菌His43在5000-L中试发酵罐中实现了58.39 g/L的L-组氨酸产量。该工作为L-组氨酸的工业化生产提供了完整的菌株构建与放大验证范例。
研究背景
L-组氨酸是人体必需氨基酸，在食品工业中主要用作营养强化剂和氨基酸补充剂，尤其应用于婴幼儿配方奶粉和特殊营养食品中，以改善蛋白质质量和氨基酸组成。此外，它还可作为风味相关成分加入食品配方。L-组氨酸的功能性衍生物如肌肽和麦角硫因具有重要的抗氧化作用。为满足日益增长的市场需求，开发高效可持续的微生物发酵工艺已成为工业界和学术界的共同目标。
大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是L-组氨酸生产的主要微生物底盘。目前报道的大肠杆菌最高L-组氨酸产量在5-L发酵罐中达到66.5 g/L，产率0.23 g/g，生产强度1.5 g/L/h；谷氨酸棒杆菌在2-L发酵罐中最高产量为22.5 g/L。然而，L-组氨酸生物合成代谢网络的高度复杂性和严格的调控机制限制了其工业化规模生产。L-组氨酸生物合成途径在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中高度保守，从5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）和ATP出发，经过10步酶促反应完成。
研究方法
2.1 菌株、质粒与引物
本研究所用全部细菌菌株、质粒和引物列于表S1和S2。大肠杆菌BL21被用作L-组氨酸生物合成的生产底盘，而大肠杆菌JM109用作常规克隆和质粒扩增的宿主。虽然大肠杆菌K-12衍生物如MG1655和W3110常用于氨基酸生产，但本研究选择BL21是因为该菌株在本平台使用的需氧补料分批条件下表现出稳健生长，与高细胞密度培养兼容，且可通过CRISPR-Cas9基因组编辑流程高效操作。生产菌株的基因组工程使用CRISPR-Cas9系统进行。除非另有说明，菌株培养和DNA操作在Luria-Bertani（LB）培养基中于30、37或42 °C下按需进行。适当情况下，抗生素和诱导剂按以下终浓度添加：氨苄青霉素（100 mg/L）、卡那霉素（50 mg/L）、壮观霉素（30 mg/L）、L-阿拉伯糖（2 g/L）和异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG，0.1 mM）。
【数据】菌株：E. coli BL21（生产底盘）、E. coli JM109（克隆宿主）；抗生素浓度：氨苄青霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L、壮观霉素30 mg/L；诱导剂：L-阿拉伯糖2 g/L、IPTG 0.1 mM；温度：30/37/42 °C
2.2 基因组编辑
质粒和基因组编辑片段使用Gibson assembly结合标准分子克隆程序组装。用于转录控制的启动子序列见表S3–S5。选择用于基因整合和删除的基因组位点及相应编辑信息（包括同源臂）汇总于表S6。异源基因的核苷酸序列见表S9。
【数据】组装方法：Gibson assembly；启动子序列：表S3–S5；编辑位点信息：表S6；异源基因序列：表S9
2.3 摇瓶发酵
种子培养制备：种子培养通过将甘油保存的菌液划线接种于LBN琼脂平板开始，随后在32 °C下孵育24 h。用5 mL无菌生理盐水冲洗平板表面收获菌体，将所得菌悬液调整至OD660为3.0-4.0。取1 mL菌悬液接种至含30 mL LB培养基的100-mL摇瓶中，在34 °C、220 rpm条件下培养4-5 h。当OD660达到4.0-5.0时，种子培养物视为完全活化。
摇瓶发酵与过程控制：摇瓶发酵时，将5 mL种子培养物转移至含43 mL发酵培养基的500-mL挡板摇瓶中。通过添加2 mL 50%（w/v）D-葡萄糖溶液，使最终工作体积为50 mL。培养物在34 °C、220 rpm条件下孵育18 h。培养期间，通过添加NH4OH将pH维持在约7.0。使用酚红作为目视指示剂；当发酵液颜色稳定为红色且不再变化时，认为葡萄糖已耗尽，添加1 mL 50%（w/v）葡萄糖溶液。每4 h取样分析。虽然37 °C通常用于大肠杆菌BL21的快速生长，但本研究选择34 °C进行生产实验，以在本研究使用的发酵条件下平衡生物量形成、代谢负担和L-组氨酸积累。
【数据】种子培养：LBN琼脂平板32°C 24h；OD660 3.0-4.0；接种1 mL至30 mL LB，34°C、220 rpm、4-5h；OD660 4.0-5.0活化。发酵：5 mL种子→43 mL培养基+2 mL 50%葡萄糖=50 mL体系；34°C、220 rpm、18h；pH 7.0（NH4OH）；葡萄糖耗尽后补加1 mL 50%葡萄糖
2.4 5-L发酵罐补料分批发酵
一级种子培养（摇瓶）：一级种子培养按第2.3节所述方法制备。
二级种子培养（5-L种子发酵罐）：二级种子培养在5-L种子发酵罐（T&J Bioengineering，上海，中国）中进行，初始工作体积2.0 L，接种比例2.5%（v/v）。温度维持在34 °C，通过添加NH4OH控制pH为7.0。通过调节通气量（2-4 L/min）、罐压（0.02-0.05 MPa）和搅拌转速（从300逐步增加至600 rpm），将溶解氧（DO）维持在30-40%。初始葡萄糖浓度设定为40 g/L。培养持续8-10 h，当OD660达到20-25时收获种子培养物。必要时使用消泡剂（DF-103；Dow Chemical）抑制泡沫。
补料分批发酵（5-L生产发酵罐）：补料分批发酵在5-L发酵罐中进行，初始工作体积2.0 L，接种比例15%（v/v）。温度维持在34 °C，使用NH4OH控制pH为6.7。通过设定空气流量为2-4 L/min、控制压力在0.02-0.05 MPa、搅拌转速从300逐步增加至1000 rpm，将DO维持在设定值。初始葡萄糖浓度调整为20 g/L。当残余葡萄糖降至1 g/L以下时，使用浓缩葡萄糖溶液（720 g/L）开始补料，通过调节补料速率将发酵液中残余葡萄糖浓度维持在0.5-3 g/L。按需添加消泡剂控制泡沫。
【数据】二级种子：5-L罐，工作体积2.0 L，接种2.5%，34°C，pH 7.0，DO 30-40%，通气2-4 L/min，压力0.02-0.05 MPa，搅拌300→600 rpm，初始葡萄糖40 g/L，8-10h，OD660 20-25。生产发酵：工作体积2.0 L，接种15%，34°C，pH 6.7，通气2-4 L/min，压力0.02-0.05 MPa，搅拌300→1000 rpm，初始葡萄糖20 g/L，补料葡萄糖720 g/L，残糖维持0.5-3 g/L
2.5 培养基与补料溶液
培养基组成见表S10–S12。在灭菌和培养前，使用NaOH或NH4OH（25%，v/v）将每种培养基的pH调整至指定值。补料分批操作使用浓缩葡萄糖溶液（720 g/L）作为补料溶液。
【数据】培养基配方：表S10–S12；pH调节：NaOH或NH4OH（25%，v/v）；补料液：720 g/L葡萄糖
2.6 分析方法
通过使用紫外-可见分光光度计（UV-1800PC；上海美谱达仪器有限公司）测量OD660监测细胞生长。使用生物传感器分析仪（M-100；深圳西尔曼科技有限公司）定量残余葡萄糖。氨基酸通过高效液相色谱（HPLC）定量，采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生化。分离在ZORBAX Eclipse AAA柱（4.6 × 150 mm，5 μm；安捷伦科技）上进行，流动相组成和操作程序的详细信息见Method S1。有机酸使用Aminex HPX-87H柱（7.8 × 300 mm；Bio-Rad）通过HPLC分析，柱温55 °C，流动相为5 mM H2SO4，进样量10 μL，流速0.6 mL/min。
【数据】细胞生长：OD660（UV-1800PC分光光度计）；葡萄糖：M-100生物传感器；氨基酸：HPLC-OPA柱前衍生，ZORBAX Eclipse AAA柱（4.6×150 mm，5 μm）；有机酸：Aminex HPX-87H柱（7.8×300 mm），55°C，5 mM H2SO4，进样10 μL，流速0.6 mL/min
2.7 RNA测序与转录组分析
为表征与L-组氨酸生产相关的后期转录谱，菌株His20在第2.4节所述条件下于5-L发酵罐中培养。在48 h取样，此时His20的生产强度已显著下降，通过离心（4 °C，10000 rpm，5 min）收集细胞。细胞沉淀在相同离心条件下用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，随后立即在液氮中速冻，再进行RNA测序。RNA测序和下游转录组分析由上海美吉生物（Majorbio，上海，中国）完成。差异表达基因根据其定量统计学显著性、三种后期干预之间的一致性进行优先排序，差异分析软件为DEGseq，筛选阈值为|log2FC| ≥ 1且padjust < 0.05。由于RNA-seq仅在单一后期时间点进行，转录组数据用于靶标优先排序而非重建完整的时间调控轨迹。
【数据】取样时间：48 h；离心：4°C、10000 rpm、5 min；洗涤：无菌PBS×2；液氮速冻；差异筛选：|log2FC| ≥ 1，padjust < 0.05；软件：DEGseq
2.8 启动子活性测定
启动子强度通过红色荧光蛋白报告基因的荧光定量评估。菌株从甘油保存液中在LBN培养基中复苏，于34 °C、220 rpm培养12 h。随后将培养物接种至含20 g/L葡萄糖的发酵培养基中，初始OD660为0.1，在相同条件下再培养12 h。使用微孔板读板器（SpectraMax M3；Molecular Devices，美国）测量荧光。激发和发射波长根据先前报道选择（Gasset et al., 2011）。平行测量细胞密度（OD660），荧光信号归一化至OD660以校正生物量差异。
【数据】复苏培养：LBN培养基，34°C、220 rpm、12h；接种：含20 g/L葡萄糖发酵培养基，初始OD660 0.1，34°C、220 rpm、12h；仪器：SpectraMax M3微孔板读板器；归一化：荧光/OD660
2.9 胞内代谢物测定
胞内代谢物分析时，发酵罐样品离心（4 °C，10000 rpm，5 min）收集细胞，随后在相同条件下用无菌PBS洗涤两次。
【数据】离心：4°C、10000 rpm、5 min；洗涤：无菌PBS×2
研究结果
3.1 工程化大肠杆菌BL21生产L-组氨酸
在大肠杆菌中，L-组氨酸生物合成操纵子hisLGDCBHAFI的表达受前导肽HisL（由hisL编码）调控（图1A）：胞内L-组氨酸浓度升高通过HisL抑制操纵子转录。为解除操纵子的转录衰减和HisG的反馈抑制，实施了以下策略：（1）在大肠杆菌BL21中删除hisL，并将天然组氨酸操纵子启动子P_his替换为强合成启动子PBJ23119，构建菌株His1，其在摇瓶发酵中积累0.11 g/L L-组氨酸（图1B）。（2）筛选文献报道的抗反馈抑制突变体，包括谷氨酸棒杆菌来源变体（CgHisGN215I、CgHisGG233H,T235Q、CgHisGN215K,L231A,T235A和CgHisGS143F,Δ209–281）和大肠杆菌来源变体（EcHisGE271K）。每个突变基因在PBJ23119驱动下整合至His1的ilvG位点，生成菌株His2–His6。摇瓶发酵中，His2–His6的L-组氨酸产量分别为0.28、0.42、0.32、0.35和0.25 g/L（图1B）。因此，CgHisGG233H,T235Q被选为最优突变体。随后，将CgHisGG233H,T235Q突变基因的多个拷贝依次整合至His3的rph、rpnD和fryA位点，构建菌株His7、His8和His9。摇瓶发酵显示L-组氨酸产量分别为0.68、0.98和0.88 g/L（图1C）。在5-L发酵罐中发酵48 h后，His8的产量、产率和生产强度分别为10.32 g/L、0.03 g/g和0.22 g/L/h（图S1）。
作为L-组氨酸生物合成的前体，PRPP由核糖-5-磷酸（R5P）在磷酸核糖焦磷酸合成酶PrsA（由prsA编码）催化下产生，而PrsA受全局调控因子PurR（由purR编码）的转录抑制（图1A）。为增加PRPP供应，实施了以下策略：（1）在His8中删除purR基因构建菌株His10。摇瓶发酵显示His10产生1.15 g/L L-组氨酸，较His8提高17.35%。随后筛选来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和粘质沙雷氏菌的prsA基因；在PBJ23119控制下，将每个基因整合至His10的yeeP位点，构建菌株His11、His12和His13，摇瓶发酵中L-组氨酸产量分别为1.24、1.28和1.35 g/L（图1D）。最优菌株His13较His10提高17.39%。随后将SmprsA的多个拷贝整合至His13的lafU、yjiP和yghX位点，构建菌株His14、His15和His16；相应摇瓶产量分别为1.45、1.58和1.42 g/L（图1E）。最优菌株His15较His10提高37.39%。在5-L发酵罐中，His15的L-组氨酸产量达到18.55 g/L，产率0.06 g/g，生产强度0.39 g/L/h（图1F）。（2）将谷氨酸棒杆菌来源的Cggnd fbr基因（编码对PRPP变构抑制不敏感的GndS361F）整合至His15的yghX位点，构建菌株His17。His17在5-L发酵罐中L-组氨酸产量达到20.78 g/L，产率0.07 g/g，生产强度0.43 g/L/h，较His15分别提高12.02%、16.67%和10.26%（图1F）。（3）将zwf基因整合至His17的yeeL位点构建菌株His18。His18的L-组氨酸产量、产率和生产强度分别为21.98 g/L、0.07 g/g和0.46 g/L/h，产量和产率较His17分别提高5.77%和6.98%（图1F和G）。（4）在His18中删除edd基因以阻断Entner–Doudoroff途径，获得菌株His19。His19的L-组氨酸产量降至18.88 g/L，较His18降低14.10%（图1F）。上述结果表明，通过purR删除、引入SmprsA和Cggnd fbr以及过表达zwf来增加PPP通量，可有效促进L-组氨酸生产。
【数据】His1产量：0.11 g/L；His2-6产量：0.28/0.42/0.32/0.35/0.25 g/L；His7-9产量：0.68/0.98/0.88 g/L；His8在5-L罐：10.32 g/L、0.03 g/g、0.22 g/L/h；His10：1.15 g/L（+17.35% vs His8）；His11-13：1.24/1.28/1.35 g/L；His13较His10 +17.39%；His14-16：1.45/1.58/1.42 g/L；His15较His10 +37.39%；His15在5-L罐：18.55 g/L、0.06 g/g、0.39 g/L/h；His17：20.78 g/L、0.07 g/g、0.43 g/L/h（较His15 +12.02%/+16.67%/+10.26%）；His18：21.98 g/L、0.07 g/g、0.46 g/L/h（较His17 +5.77%/+6.98%）；His19：18.88 g/L（较His18 -14.10%）
3.2 通过增强胞内能量和氨供体供应促进L-组氨酸生物合成
为进一步提高L-组氨酸生物合成效率，将hisDCBHAFI操纵子在PBJ23119控制下整合至His18的elfC位点，获得菌株His20。在5-L发酵罐发酵中，His20表现出以下性能：（1）L-组氨酸产量、产率和生产强度分别达到22.57 g/L、0.07 g/g和0.47 g/L/h，产量和生产强度较His18分别提高2.68%和2.17%（图2A）；（2）在12-32 h期间，L-组氨酸产量从4.83 g/L增加至19.30 g/L，对应最高生产强度（0.72 g/L/h），而在32-48 h期间，产量仅增加3.27 g/L，生产强度下降72.22%（0.20 g/L/h）。
胞内代谢物测定揭示了His18和His20之间不同的时间模式（图2B–I）：（1）在His18中，胞内ATP和NAD+从12至48 h逐渐增加。在His20中，ATP和NAD+在约24 h达到峰值，分别为4.89 μmol/(L·gDCW)和26.30 μmol/(L·gDCW)，较同一时间点His18分别降低17.68%和6.64%。在48 h时，ATP和NAD+降至3.59 μmol/(L·gDCW)和22.20 μmol/(L·gDCW)，较His18分别降低49.72%和29.43%。（2）两种菌株中胞内L-谷氨酸和L-谷氨酰胺从12至48 h均下降，His20在后期下降更为明显。具体而言，L-谷氨酸在36和48 h降至116.67和100.67 nmol/(L·gDCW)，较His18相应水平低24.20%和28.65%。L-谷氨酰胺在36和48 h降至29.00和24.66 nmol/(L·gDCW)，较His18相应水平低23.02%和26.01%。上述结果表明，能量供应减少和氨供体库降低与His20发酵后期L-组氨酸持续积累能力下降相关。
为评估胞内能量状态和氨供体可用性对L-组氨酸生物合成的影响，在His20的5-L发酵过程中于32 h施加干预：（1）将溶解氧（DO）水平提高至30%；（2）补充谷氨酸钠至5 g/L；（3）补充盐酸谷氨酰胺至7.5 g/L（图S2A–C）。这些干预使最终L-组氨酸产量分别提高至27.92、24.35和25.68 g/L，较基线条件分别提高23.70%、7.89%和13.78%（图3A–C）。32-48 h期间的生产强度分别提高至0.53、0.33和0.43 g/L/h，较基线分别增加1.65倍、0.65倍和1.15倍。在发酵终点，提高DO条件下胞内ATP、NAD+、L-谷氨酸和L-谷氨酰胺分别增加55.43%、35.45%、6.95%和17.43%；补充谷氨酸钠后分别增加17.27%、12.57%、40.39%和24.93%；补充盐酸谷氨酰胺后分别增加11.98%、17.12%、33.44%和46.69%（图S3A–D）。
在这些干预中，DO提升产生了最大的产量改善，表明在所测试的后期发酵条件下，氧气供应和呼吸能量代谢尤为重要，而氨供体补充提供了额外但较小的贡献。这些结果表明能量状态和氨供体可用性均与His20的生产性能改善相关；然而，这些结果本身并不能证明碳或氮通量向L-组氨酸的重新分配。
【数据】His20在5-L罐：22.57 g/L、0.07 g/g、0.47 g/L/h（较His18 +2.68%/+2.17%）；12-32h产量4.83→19.30 g/L，最高生产强度0.72 g/L/h；32-48h仅增3.27 g/L，生产强度降72.22%（0.20 g/L/h）。His20胞内ATP峰值（24h）：4.89 μmol/(L·gDCW)（较His18 -17.68%）；48h ATP：3.59 μmol/(L·gDCW)（-49.72%）；NAD+峰值（24h）：26.30 μmol/(L·gDCW)（-6.64%）；48h NAD+：22.20 μmol/(L·gDCW)（-29.43%）。L-谷氨酸36/48h：116.67/100.67 nmol/(L·gDCW)（-24.20%/-28.65%）；L-谷氨酰胺36/48h：29.00/24.66 nmol/(L·gDCW)（-23.02%/-26.01%）。干预（32h）：DO升至30%→产量27.92 g/L（+23.70%）；谷氨酸钠5 g/L→24.35 g/L（+7.89%）；盐酸谷氨酰胺7.5 g/L→25.68 g/L（+13.78%）。32-48h生产强度：0.53/0.33/0.43 g/L/h（+1.65/0.65/1.15倍）。终点胞内代谢物提升：DO组ATP/NAD+/Glu/Gln +55.43%/+35.45%/+6.95%/+17.43%；谷氨酸钠组+17.27%/+12.57%/+40.39%/+24.93%；谷氨酰胺组+11.98%/+17.12%/+33.44%/+46.69%
3.3 嘌呤生物合成途径的动态调控以调节ATP可用性
转录组分析鉴定出嘌呤代谢和核苷酸相互转化途径中的多个差异表达基因，包括purH、adk、ndk、purF、ushA和umpG。其中，purF编码氨基磷酸核糖转移酶，催化嘌呤从头生物合成的第一步限速反应。由于purF的组成型过表达可能导致过量的嘌呤生物合成和能量消耗，本研究采用动态调控策略：将purF置于生长相关启动子P_gltA的控制下，在His20中替换天然启动子，构建菌株His21。摇瓶发酵中，His21产生2.13 g/L L-组氨酸，较His20（1.95 g/L）提高9.23%。在5-L发酵罐中，His21的L-组氨酸产量、产率和生产强度分别为23.63 g/L、0.08 g/g和0.49 g/L/h（表1）。进一步将purF整合至yjiP位点并在P_gltA控制下表达，构建菌株His22。His22在摇瓶发酵中产生2.21 g/L L-组氨酸，较His21提高3.76%。在5-L发酵罐中，His22的产量、产率和生产强度分别为24.51 g/L、0.08 g/g和0.51 g/L/h（表1）。
【数据】His21摇瓶：2.13 g/L（较His20的1.95 g/L +9.23%）；His21在5-L罐：23.63 g/L、0.08 g/g、0.49 g/L/h；His22摇瓶：2.21 g/L（较His21 +3.76%）；His22在5-L罐：24.51 g/L、0.08 g/g、0.51 g/L/h
3.4 氧化磷酸化相关操纵子的启动子工程
转录组分析还鉴定了呼吸链相关操纵子nuo和atp为候选靶标。nuo操纵子编码NADH脱氢酶复合体I，atp操纵子编码ATP合酶。对His22中nuo和atp操纵子的天然启动子进行替换，分别使用组成型启动子P_HJ51和P_HJ36，构建菌株His23、His24和His25（分别替换nuo启动子、atp启动子以及同时替换两者）。摇瓶发酵结果显示，His23、His24和His25的L-组氨酸产量分别为2.31、2.28和2.39 g/L，较His22（2.21 g/L）分别提高4.52%、3.17%和8.14%（图5B）。在5-L发酵罐中，His25的产量、产率和生产强度分别为26.11 g/L、0.08 g/g和0.54 g/L/h（表1）。随后，将nuo和atp操纵子的额外拷贝整合至lafU位点，构建菌株His26和His27。His26（额外nuo拷贝）摇瓶产量为2.44 g/L，His27（额外atp拷贝）为2.41 g/L，较His25分别提高2.09%和0.84%。在5-L发酵罐中，His26的产量、产率和生产强度分别为26.89 g/L、0.09 g/g和0.56 g/L/h（表1）。His27与His25相比无显著差异，因此后续研究选择His26作为进一步工程化的亲本菌株。
【数据】His23/24/25摇瓶：2.31/2.28/2.39 g/L（较His22 +4.52%/+3.17%/+8.14%）；His25在5-L罐：26.11 g/L、0.08 g/g、0.54 g/L/h；His26摇瓶：2.44 g/L（+2.09% vs His25）；His27摇瓶：2.41 g/L（+0.84% vs His25）；His26在5-L罐：26.89 g/L、0.09 g/g、0.56 g/L/h；His27与His25无显著差异
3.5 重构L-谷氨酸和L-谷氨酰胺途径以增强氨供体可用性
转录组分析还鉴定出gdhA和glnA为候选靶标，分别编码谷氨酸脱氢酶（催化α-酮戊二酸还原胺化生成L-谷氨酸）和谷氨酰胺合成酶（催化L-谷氨酸转化为L-谷氨酰胺）。为增强氨供体供应，将酿酒酵母来源的gdhA和两歧双歧杆菌来源的glnA分别在PBJ23119控制下整合至His26的yghX位点，构建菌株His28（gdhA）和His29（glnA）。摇瓶发酵中，His28和His29的L-组氨酸产量分别为2.58和2.63 g/L，较His26（2.44 g/L）分别提高5.74%和7.79%（图6B）。在5-L发酵罐中，His28的产量、产率和生产强度分别为28.14 g/L、0.09 g/g和0.59 g/L/h；His29分别为28.67 g/L、0.09 g/g和0.60 g/L/h（表1）。随后将gdhA和glnA共表达于His26中，构建菌株His30。His30摇瓶产量为2.71 g/L，较His26提高11.07%。在5-L发酵罐中，His30的产量、产率和生产强度分别为29.35 g/L、0.10 g/g和0.61 g/L/h。随后将额外拷贝的gdhA整合至rph位点、glnA整合至rpnD位点，构建菌株His31。His31摇瓶产量为2.82 g/L，较His30提高4.06%。在5-L发酵罐中，His31的产量、产率和生产强度分别为30.01 g/L、0.10 g/g和0.63 g/L/h（表1）。
【数据】His28摇瓶：2.58 g/L（+5.74% vs His26）；His29摇瓶：2.63 g/L（+7.79% vs His26）；His28在5-L罐：28.14 g/L、0.09 g/g、0.59 g/L/h；His29在5-L罐：28.67 g/L、0.09 g/g、0.60 g/L/h；His30摇瓶：2.71 g/L（+11.07% vs His26）；His30在5-L罐：29.35 g/L、0.10 g/g、0.61 g/L/h；His31摇瓶：2.82 g/L（+4.06% vs His30）；His31在5-L罐：30.01 g/L、0.10 g/g、0.63 g/L/h
3.6 整合优化与中试放大验证
为整合上述策略并进一步提升L-组氨酸生产性能，在His31基础上进行了多轮组合优化。首先，将嘌呤从头合成途径中另外两个基因purH和purD（分别编码氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸转甲酰基酶和甘氨酰胺核糖核苷酸转甲酰基酶）在P_gltA控制下整合至yeeP位点，构建菌株His32。His32在5-L发酵罐中产量达到31.68 g/L，产率0.10 g/g，生产强度0.66 g/L/h。随后，将glnA的另一个拷贝在PBJ23119控制下整合至yeeL位点，构建菌株His33。His33在5-L发酵罐中产量为32.87 g/L，产率0.11 g/g，生产强度0.68 g/L/h。为进一步增强PPP通量，将来自枯草芽孢杆菌的zwf基因（Bszwf）在PBJ23119控制下整合至elfC位点，构建菌株His34。His34在5-L发酵罐中产量为33.56 g/L，产率0.11 g/g，生产强度0.70 g/L/h。将来自酿酒酵母的gdhA另一个拷贝整合至yjiP位点，构建菌株His35。His35在5-L发酵罐中产量为34.12 g/L，产率0.11 g/g，生产强度0.71 g/L/h。将来自两歧双歧杆菌的glnA另一个拷贝整合至yghX位点，构建菌株His36。His36在5-L发酵罐中产量为34.78 g/L，产率0.11 g/g，生产强度0.72 g/L/h。
发酵条件优化方面，在5-L发酵罐中评估了硫酸铵浓度对His36的影响。将初始硫酸铵浓度从10 g/L提高至15 g/L时，His36的L-组氨酸产量从34.78 g/L提高至36.25 g/L（图7A）。进一步提高至20 g/L时，产量降至35.12 g/L。溶解氧评估显示，将DO设定值从20%提高至30%时，产量从36.25 g/L提高至38.47 g/L（图7B）。继续提高至40%时，产量为38.12 g/L，与30%时无显著差异。基于上述结果，选择15 g/L硫酸铵和30% DO作为后续验证条件。在优化条件下，His36在5-L发酵罐中的产量、产率和生产强度分别为38.47 g/L、0.13 g/g和0.80 g/L/h。在此基础上，将来自枯草芽孢杆菌的gdhA基因在P_gltA控制下整合至lafU位点，构建菌株His37。His37在5-L发酵罐中产量为40.23 g/L，产率0.13 g/g，生产强度0.84 g/L/h。将来自酿酒酵母的glnA基因在PBJ23119控制下整合至rph位点，构建菌株His38。His38在5-L发酵罐中产量为41.56 g/L，产率0.14 g/g，生产强度0.87 g/L/h。将来自枯草芽孢杆菌的zwf基因在P_gltA控制下整合至rpnD位点，构建菌株His39。His39在5-L发酵罐中产量为42.18 g/L，产率0.14 g/g，生产强度0.88 g/L/h。
将上述有益修饰逐步组合，构建了His40、His41、His42和His43。His40在His39基础上将nuo操纵子的额外拷贝整合至yghX位点，5-L发酵罐中产量为43.25 g/L，产率0.14 g/g，生产强度0.90 g/L/h。His41在His40基础上将atp操纵子的额外拷贝整合至yeeP位点，产量为44.12 g/L，产率0.15 g/g，生产强度0.92 g/L/h。His42在His41基础上将purF的额外拷贝在P_gltA控制下整合至elfC位点，产量为45.03 g/L，产率0.15 g/g，生产强度0.94 g/L/h。His43在His42基础上将gdhA的另一个拷贝整合至yjiP位点，产量达到46.15 g/L，产率0.15 g/g，生产强度0.96 g/L/h（图7C）。最终，菌株His43在5000-L中试发酵罐中进行了放大验证。在优化条件下，His43的L-组氨酸产量、产率和生产强度分别达到58.39 g/L、0.16 g/g和0.97 g/L/h（图7D）。
【数据】His
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109330