来源：Integrated metabolomic and microbiomic analysis reveals aroma-enhancing mechanisms of a β-glucosidase-producing Bacillus cereus A15 in tobacco fermentation（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
烟叶发酵过程中香气释放不足长期制约原料品质提升。本研究建立了一种结合流式细胞分选与七叶苷-铁离子显色法的高通量筛选策略，从烟叶表面微生物中筛得一株高产β-葡萄糖苷酶的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）A15。将该菌株应用于烟叶发酵后，感官品质、挥发性风味物质、代谢通路与微生物群落结构均发生显著变化。多组学联用揭示了一条“微生物—代谢物—感官品质”的调控链条，为低品质烟叶的生物加工提供了菌株资源与技术参考。
研究背景
烟草是全球重要的非食用经济作物，其风味品质与商业价值高度依赖挥发性风味组分的组成与含量。萜烯类物质占烟草挥发性香气成分的30%以上，赋予烟叶花果香与木香特征，直接影响香气量、协调性与感官舒适度。然而，低品质烟叶普遍存在游离萜烯含量不足的问题。更关键的是，烟草中大部分萜烯以糖苷结合态存在，化学性质稳定、挥发性极低，必须经β-葡萄糖苷酶催化水解为自由态萜烯后才能发挥香气贡献。如何激活或增强β-葡萄糖苷酶活性、高效解锁糖苷结合态萜烯，成为该领域的核心科学问题。
研究方法
2.1 烟叶样品
供试烤烟品种为云烟87，采集自湖南郴州。选取成熟度一致、无病虫害、色泽均匀的烟叶，自然晾干至水分含量12%–15%，于25°C、相对湿度60%的阴凉干燥环境中储存，用于后续功能微生物筛选与发酵实验。
【数据】品种：云烟87；产地：湖南郴州；水分含量：12%–15%；储存条件：25°C、相对湿度60%
2.2 培养基与关键溶液配制
LB液体培养基（胰蛋白胨10 g·L⁻¹、酵母提取物5 g·L⁻¹、NaCl 10 g·L⁻¹）经121°C高压灭菌20 min，室温保存。LB固体培养基额外添加琼脂15 g·L⁻¹，灭菌方式同上。富集诱导培养基（七叶苷1 g·L⁻¹、胰蛋白胨0.2 g·L⁻¹、酵母粉0.05 g·L⁻¹、K₂HPO₄ 1 g·L⁻¹、MgSO₄·7H₂O 0.5 g·L⁻¹、FeCl₃·6H₂O 0.05 g·L⁻¹）溶于超纯水定容至1 L，灭菌后室温保存。显色底物溶液以PBS缓冲液（pH 7.4）新鲜配制，含5 mM七叶苷与5 mM Fe³⁺，过滤除菌后立即使用。
【数据】LB培养基：胰蛋白胨10 g·L⁻¹、酵母提取物5 g·L⁻¹、NaCl 10 g·L⁻¹；琼脂：15 g·L⁻¹；灭菌：121°C、20 min；富集培养基：七叶苷1 g·L⁻¹、K₂HPO₄ 1 g·L⁻¹、MgSO₄·7H₂O 0.5 g·L⁻¹、FeCl₃·6H₂O 0.05 g·L⁻¹；显色液：5 mM七叶苷、5 mM Fe³⁺、PBS pH 7.4
2.3 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选与鉴定
称取10 g预留烟叶样品，置于含100 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，于10°C、220 r·min⁻¹条件下振荡洗脱2–3 h，充分释放烟叶表面附着的微生物。洗脱液经四层无菌纱布过滤去除叶片残渣，滤液以8000 r·min⁻¹离心10 min。弃上清，沉淀以无菌生理盐水重悬。取10 mL重悬液接种至90 mL富集诱导培养基中，于30°C、220 r·min⁻¹振荡培养72 h，实现目标微生物的复苏与富集。富集培养物经离心、洗涤后制备成单细胞悬液，细胞浓度调至10⁶–10⁷ CFU·mL⁻¹备用。使用流式细胞仪进行单细胞分选，分选所得单细胞收集至预先装有200 μL复苏培养基的96孔板中，每孔一个细胞。分选后的96孔板密封后于30°C、100 r·min⁻¹低速振荡培养3 d。培养液出现轻微浑浊后，每孔加入10 μL显色底物溶液，静置孵育2 h。观察孔内颜色变化，选取呈黑色、黑褐色或深棕色的阳性孔。采用平板划线法纯化获得目标功能菌株。初筛阳性菌株接种至LB固体培养基，经平板划线纯化3次获得纯培养物。以细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增16S rDNA基因序列。PCR反应体系与程序参照标准方案。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证后，送上海生工生物工程有限公司进行双向测序。测序结果拼接后，在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，确定菌株分类学地位。
【数据】洗脱：10 g烟叶、100 mL无菌生理盐水、10°C、220 r·min⁻¹、2–3 h；离心：8000 r·min⁻¹、10 min；富集培养：30°C、220 r·min⁻¹、72 h；细胞浓度：10⁶–10⁷ CFU·mL⁻¹；复苏培养：30°C、100 r·min⁻¹、3 d；显色：10 μL底物、静置2 h；PCR引物：27F/1492R；电泳：2%琼脂糖凝胶
2.4 β-葡萄糖苷酶活性测定
采用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）比色法测定目标菌株的β-葡萄糖苷酶活性。将活化后的目标菌株接种至LB液体培养基中，于30°C、220 r·min⁻¹振荡培养48 h。培养液于4°C、8000 r·min⁻¹离心10 min，收集上清液作为胞外粗酶液备用。酶活测定体系如下：0.1 mL预热粗酶液与0.9 mL pNPG底物溶液（溶于1 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 5.0）混合，于50°C水浴反应30 min。立即加入1 mL 1 M Na₂CO₃溶液终止反应。混匀后以5000 rpm离心5 min，测定上清液在405 nm处的吸光度。以不同浓度的对硝基苯酚（pNP）标准溶液在相同反应体系下建立标准曲线，据此计算反应中生成的pNP浓度。酶活单位（U）定义如下：在50°C、pH 5.0条件下，每毫升酶液每分钟催化生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。
【数据】培养：30°C、220 r·min⁻¹、48 h；离心：4°C、8000 r·min⁻¹、10 min；反应体系：0.1 mL粗酶液+0.9 mL pNPG底物（1 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液，pH 5.0）；反应条件：50°C、30 min；终止：1 mL 1 M Na₂CO₃；离心：5000 rpm、5 min；检测波长：405 nm
2.5 功能菌株的烟叶发酵验证
将产β-葡萄糖苷酶菌株按2%（v/v）接种量接种至LB培养基中，于37°C、220 r/min振荡发酵24 h。随后将发酵液OD₆₀₀调至约1.0，按10%（v/w）接种量均匀喷洒至烟叶表面。对照组喷洒等体积无菌水。所有样品于37°C、相对湿度70%条件下发酵3 d。分别于发酵0、1、2、3 d取样，保存于−80°C备用。发酵结束后，烟叶于70°C烘干，并在相对湿度60%环境中平衡24 h。
【数据】接种量：2%（v/v）；发酵条件：37°C、220 r/min、24 h；OD₆₀₀：约1.0；喷洒量：10%（v/w）；发酵：37°C、相对湿度70%、3 d；取样时间点：0、1、2、3 d；烘干：70°C；平衡：相对湿度60%、24 h
2.6 烟叶品质感官评价
感官评价依据国家标准YC/T 415-2011《在制品烟草感官评价方法》执行。邀请7名具备资质的专业烟草感官评价人员组成评价小组，所有样品均采用盲评方式。依据YC/T 415-2011规定的评价指标体系，从烟气特性、香气特性、烟气特征和口感特征四个方面对烟叶样品逐项打分。烟气特性包括浓度、劲头、流畅度和余味感；香气特性包括香气质量、香气量、香气扩散度和杂气；烟气特征包括细腻度、柔和度和醇和度；口感特征包括刺激性、回味、干燥感和甜度。各指标加权求和得到样品综合得分，用于表征整体感官品质。得分越高表示感官品质越好。
【数据】评价标准：YC/T 415-2011；评价人数：7人；评价方式：盲评
2.7 挥发性化合物测定
采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）测定烤烟中挥发性化合物。称取1.5 g烤烟置于20 mL顶空瓶中，加入10 μL浓度为0.2155 g·L⁻¹的癸酸乙酯溶液作为内标。使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME纤维头于60°C萃取30 min，随后在GC-MS系统中于270°C解吸5 min。GC-MS分析采用Trace1310气相色谱仪联用TSQ8000质谱仪。分离在TG-5毛细管柱（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）上进行，条件如下：氦气为载气，流速1 mL·min⁻¹；进样口温度270°C。柱温箱初始温度40°C保持2 min，以10°C·min⁻¹升温至270°C，保持5 min。传输线温度280°C，离子源温度300°C。质谱采用电子轰击（EI）模式，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 33–400。挥发性峰通过与NIST质谱库比对及保留指数确认。
【数据】样品量：1.5 g；内标：10 μL癸酸乙酯（0.2155 g·L⁻¹）；萃取：60°C、30 min；解吸：270°C、5 min；色谱柱：TG-5（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；载气：氦气、1 mL·min⁻¹；升温程序：40°C保持2 min→10°C·min⁻¹→270°C保持5 min；EI：70 eV；扫描范围：m/z 33–400
研究结果
3.1 烟叶高产β-葡萄糖苷酶菌株的高通量筛选
为从烟叶土著微生物中高效获取高产β-葡萄糖苷酶的功能菌株，本研究建立了结合流式细胞单细胞分选与七叶苷-铁离子显色法的高通量筛选体系（图1）。首先从烟叶中洗脱并收集微生物，通过流式细胞仪对烟叶微生物群落进行单细胞分选，共获得828个微生物单细胞，接种至96孔板进行纯培养。培养后采用七叶苷-铁离子体系对各菌株发酵液进行产酶活性快速鉴定。其原理为：发酵液中的β-葡萄糖苷酶催化七叶苷水解生成七叶亭，七叶亭迅速与Fe³⁺结合形成黑色复合物，使反应体系呈现明显的黑色或深棕色。由此可直观判断菌株的产酶能力。随后选取颜色最深的20株阳性菌株（编号A1–A20），采用对硝基苯酚（pNP）法对其β-葡萄糖苷酶活性进行定量测定。颜色阴性孔不再进一步分析，该方法设计用于高活性菌株的阳性富集。结果表明，20株菌的β-葡萄糖苷酶活性范围为18.1–31.0 U/mL。其中，菌株A15酶活最高，达31.0 U/mL，为优势高产菌株。基于16S rRNA基因测序及NCBI数据库BLAST比对分析，该菌株被鉴定为蜡状芽孢杆菌A15。
【数据】单细胞分选总数：828个；阳性菌株数：20株（A1–A20）；酶活范围：18.1–31.0 U/mL；A15酶活：31.0 U/mL；鉴定结果：Bacillus cereus A15
3.2 蜡状芽孢杆菌A15发酵烟叶的感官品质评价
为评估高产β-葡萄糖苷酶菌株蜡状芽孢杆菌A15在烟叶发酵中的实际应用价值，从烟气特性、香气特性、烟气特征和口感特征四个维度对发酵终点烟叶样品进行综合评分。感官评价综合得分的雷达图直观展示了两种样品间的品质轮廓差异（图2）。结果表明，EX_3（接种蜡状芽孢杆菌A15发酵组）在香气特性、烟气特征和口感特征等多个关键指标上均优于CK_3（仅喷洒无菌水组）。雷达图包围面积扩大表明整体感官品质得到全面优化。具体而言，在烟气特性方面，EX_3烟叶的烟气浓度和劲头得分由6.3（CK_3）降至6.0，呈适度下降趋势；流畅度和余味感得分均由6.0升至6.2（提升3.3%）。这些变化表明菌株A15有效缓解了烟叶中尼古丁含量过高引起的强烈刺激感，使烟气风格由粗糙转为柔和持久，抽吸体验更加舒适协调。在香气特性方面，EX_3表现出增香与净化双重效应。其香气质量和香气量得分均由5.8升至6.0（提升3.4%），香气扩散度亦有所增强。值得注意的是，CK_3中明显的“焦枯气味”在EX_3中未被检出，杂气得分由6.0提升至6.2（提升3.3%）。这表明菌株A15处理不仅促进了香气物质的积累，还有效降解了异味前体物，显著提升了烟气的纯净度。在烟气特征方面，EX_3在细腻度、柔和度和醇和度上均获得6.2分，较CK_3的5.8分提升显著（6.9%）。该结果证实发酵显著改善了烟气的物理特性，使其更加细腻、柔和、醇和、饱满。在口感特征方面，菌株处理的正向效应尤为突出。EX_3的刺激性得分提升至6.0（CK_3为5.8），喉部刺激感明显减轻；回味更加干净，CK_3中存在的口腔残留感消失。此外，甜度得分由5.0显著提升至5.4（提升8.0%），赋予烟叶宜人的淡甜味。干燥度在两组间无差异，表明发酵过程未引入不良口感特征。
【数据】烟气浓度/劲头：6.3→6.0；流畅度/余味感：6.0→6.2（+3.3%）；香气质量/香气量：5.8→6.0（+3.4%）；杂气：6.0→6.2（+3.3%）；细腻度/柔和度/醇和度：5.8→6.2（+6.9%）；刺激性：5.8→6.0；甜度：5.0→5.4（+8.0%）
3.3 蜡状芽孢杆菌A15发酵烟叶挥发性风味组分动态分析
为阐明蜡状芽孢杆菌A15改善烟叶感官品质的化学基础，采用HS-SPME-GC-MS追踪了原料烟叶（BK_0）、蜡状芽孢杆菌A15发酵组（EX_1、EX_2、EX_3）及喷洒无菌水对照组（CK_1、CK_2、CK_3）中挥发性风味化合物的动态变化。共鉴定出68种主要挥发性组分（表S1），包括16种萜烯、10种酮类、10种酸类、8种醇类、8种醛类、7种酯类、3种酚类、3种生物碱及3种其他化合物。在物质含量变化方面（图3A），原料烟叶和对照组中各类风味组分在发酵过程中变化幅度相对较小，而接种菌株A15的EX组则显著增加了烟叶中挥发性组分的含量。具体而言，EX组中萜烯类物质在整个发酵过程中维持较高水平，发酵结束时达2.26 μg/g，明显高于同阶段对照组的1.80 μg/g。同时，醇类、酮类和酸类等香气相关组分在EX组呈现持续累积趋势，各时期含量均显著高于未发酵组和同期CK组。值得注意的是，EX组中生物碱在发酵后期呈爆发式增长，最终含量（5.23 μg/g）远超对照组（3.33 μg/g）。然而，有机酸的同步累积（表S2）可能将尼古丁质子化为非挥发性盐类，减少游离尼古丁，从而降低感知刺激性。这些结果表明，蜡状芽孢杆菌A15处理显著改变了烟叶挥发性风味组分的构成，定向促进了萜烯类、醇类和生物碱等关键香气物质的积累，且这种增香效应在发酵后期尤为突出。
对发酵过程中烟叶风味化合物进行主成分分析（PCA），结果清晰揭示了发酵对烟叶风味组成的影响（图3B）。原料烟叶、对照组和接种菌株A15的实验组沿第一和第二主成分呈现明显分离，表明发酵和菌株接种改变了烟叶的风味轮廓。随后，基于K-means聚类将68种挥发性组分的浓度分布模式分为9个亚簇，主要包括两种模式：菌株诱导富集型和菌株抑制下调型（图3C）。菌株诱导富集型包括亚簇1、2、7和9中的挥发性风味化合物，这些组分在EX组中持续累积并在发酵后期达到峰值。
【数据】鉴定挥发性组分：68种（16萜烯、10酮、10酸、8醇、8醛、7酯、3酚、3生物碱、3其他）；萜烯类：EX组2.26 μg/g vs CK组1.80 μg/g；生物碱：EX组5.23 μg/g vs CK组3.33 μg/g
3.4 代谢组学分析
（注：此节原文未在提供节选中完整呈现，以下内容依据摘要及讨论中的概述性描述进行忠实转述——原文节选未包含3.4节完整方法/结果细节，此处不做推测性补充。）
【数据】原文未详述
3.5 微生物组学分析
（注：此节原文未在提供节选中完整呈现。图6与图7分别对应微生物群落的α多样性/PCoA分析与物种组成/分类聚类分析，具体数值原文节选未详述。）
【数据】原文未详述
3.6 “微生物—代谢物—感官品质”关联网络分析
（注：图8对应微生物、代谢物与香气之间的关联热图及关键代谢物—香气物质—感官指标的网络图。图4与图5分别对应代谢物的多变量统计分析及差异代谢物分析。具体数值原文节选未完整呈现。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究从烟草土著微生物中成功筛选出高产β-葡萄糖苷酶的蜡状芽孢杆菌A15，并系统验证了其在烟叶发酵中的增香效果。感官评价显示该菌株能够全面提升香气质量与香气量，降低杂气与刺激性，增加甜度。HS-SPME-GC-MS分析证实了萜烯类、醇类及生物碱等关键风味组分的定向积累。多组学分析进一步揭示了其作用机制：该菌株通过重塑微生物群落结构，使芽孢杆菌成为优势菌属，并富集隐球菌等有益真菌；同时增强TCA循环、脂质代谢和萜烯骨架生物合成的代谢通量，促进风味前体的高效转化。最终构建的“微生物—代谢物—感官品质”调控网络证实芽孢杆菌是驱动香气合成的核心功能菌属。
编译者解读：该研究的亮点在于将流式单细胞分选与显色筛选相结合，大幅提升了功能菌株的筛选通量与效率——这一策略在食品发酵微生物筛选中具有普适借鉴意义。A15菌株的增香机制并非单一的酶解作用，而是通过重构微生物生态、调动宿主代谢网络的多层级协同实现，体现了合成生物学视角下“菌株—群落—代谢”一体化设计的思维。值得注意的是，生物碱在发酵后期的爆发式增长与有机酸累积之间的平衡关系值得深入探究——若控制不当，可能带来香气与安全性的权衡问题。原文部分组学数据细节未在节选中完整呈现，是其局限性之一。
参考来源
Zhang Y. Integrated metabolomic and microbiomic analysis reveals aroma-enhancing mechanisms of a β-glucosidase-producing Bacillus cereus A15 in tobacco fermentation. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109351
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109351