来源：Humanization of N-glycan-dependent protein quality-control system in Kluyveromyces marxianus promotes glycoprotein secretion（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人源N-糖蛋白药物市场规模高达数千亿美元，但酵母表达系统中蛋白错误折叠与降解问题长期制约其生产。本研究将人源UGGT1/UGGT2及其辅伴侣SEP15、EDEM2等关键质量控制组分引入马克斯克鲁维酵母，并改造内源葡萄糖苷酶II亚基，使多种N-糖蛋白（含Fc融合治疗蛋白）分泌量最高提升约12倍。该策略为酵母系统生产人源治疗性糖蛋白提供了新路径。
研究背景
N-糖基化是真核生物中最普遍的翻译后修饰之一，在蛋白质折叠、运输和成熟中发挥关键作用。全球最畅销药物中近40%为人源重组N-糖蛋白，包括单克隆抗体和Fc融合蛋白，年收入超2000亿美元。这类蛋白主要在CHO和SP2/0等哺乳动物细胞系统中生产，因为其具备完整的糖蛋白折叠与加工机制。以酿酒酵母和毕赤酵母为代表的酵母表达系统虽已实现胰岛素、司美格鲁肽和HPV疫苗等产品商业化，年销售额超350亿美元，但尚无商业竞争力的人源糖蛋白通过酵母系统生产。主要障碍在于酵母高甘露糖型N-糖链与人类复杂双天线N-糖链的结构差异，以及酵母缺乏UGGT介导的再糖基化-重折叠循环、糖蛋白降解途径更简单等质量控制体系差异。本研究针对这些差异，对马克斯克鲁维酵母的糖蛋白质量控制体系进行系统改造。
研究方法
2.1 质粒与引物
本研究所用质粒和引物分别列于表S1和表S3。供体质粒（LHZ2030–LHZ2053）通过将供体序列连接到pMD18-T载体（6011，Takara）构建。基因插入用供体由上游同源臂（HA）、表达盒（启动子-信号肽-编码序列[CDS]-HDEL-终止子）和下游HA组成，而基因删除用供体仅含上下游HA。部分构建体中，根据目标基因需要省略表达盒的特定组分。部分构建体包含串联表达盒。
供体质粒各组分来源如下：UGGT1、UGGT2、SEP15、EDEM2、CANX、CALR、PDIA3、ERP29、PPIB、GANAB和PRKCSH的CDS（去除天然信号肽）从HeLa细胞cDNA扩增获得。SEP15的C端融合3×FLAG标签用于免疫共沉淀。GTB1 CDS从FIM1ΔU基因组扩增。UGGT1、UGGT2、EDEM2和GTB1的点突变通过基于PCR的定点突变引入。异源表达时，马克斯克鲁维酵母Pdi1信号肽编码序列融合至人源CDS的N端（CNX除外），ER滞留信号HDEL融合至各人源CDS的C端（CNX和UGGT2除外）。Cne1信号肽编码序列融合至CNX CDS的N端。
酿酒酵母的启动子和终止子（ADH1、ADH2、PGK1、GPD1、TDH3、TEF1、TEF2和CYS3）从S288C基因组扩增，毕赤酵母的AFT1启动子和终止子从GS115基因组扩增。Sg1、Sg4、Sg7、Sg19（Zhou et al., 2024）、GTB1、ROT2、MNS1和CNE1位点的上下游序列用作同源臂。连续基因组整合时，ScADH2、ScTEF2和ScPGK1启动子的5'区域用作下游HA，以靶向插入至先前整合的表达盒上游。供体质粒的详细组成（包括Gene ID、HA长度、启动子、信号肽和终止子）见表S1。
CRISPR基因组编辑方面，StaCas9空载体（LHZ2065）通过将LHZ531（Zhou et al., 2024）中的SpCas9 ORF替换为StaCas9（Li et al., 2026），并将tRNA-Gly元件与SUP4终止子之间的原始gRNA序列替换为含有两个AarI限制性位点和与StaCas9系统兼容的gRNA支架的填充片段构建。填充片段和支架序列见表S3。靶序列（21 bp）通过退火引物对引入并插入LHZ2065的AarI位点，生成质粒LHZ2066和LHZ2067。SpCas9构建体（LHZ2054–LHZ2064）中，含20 bp靶序列的引物对插入相应载体的SapI位点。
分泌表达方面，Fc或GGH的CDS（C端带His6标签），以及度拉糖肽、阿巴西普和依那西普的CDS，插入LHZ399（pZP33）（Zhou et al., 2018）的SmaI和NotI位点之间，分别生成质粒LHZ2068–LHZ2072。空载体（pUKDN132）、过表达Xyn-CDBFV的LHZ443（pZP46）和过表达MAN330的LHZ444（pZP42）此前已有报道（Zhou et al., 2018）。度拉糖肽、阿巴西普和依那西普的编码序列从DrugBank（2026）获得，经密码子优化、合成后插入LHZ399的SmaI和NotI位点，生成质粒LHZ2070、LHZ2071和LHZ2072。LHZ2070中度拉糖肽CDS上游的"DGDPR"序列被移除，生成LHZ2086，该质粒表达信号肽切割后具有天然N端的度拉糖肽。
2.2 菌株与培养基
本研究所用菌株列于表S2。菌株在30°C的YPD培养基（2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖；平板加2%琼脂）中常规培养，在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基（SC-Ura）中筛选转化子（Amberg et al., 2005），或在YD培养基（2%酵母提取物、4%葡萄糖）中进行分泌表达。FIM1ΔU（Zhou et al., 2018）用作野生型菌株。
菌株构建通过将CRISPR质粒和从供体质粒扩增的供体片段转化入宿主菌株完成。转化子在SC-Ura平板上筛选。各构建菌株所用CRISPR质粒、供体质粒和宿主菌株详情见表S2。简言之：UGGT1、UGGT1-D1358A、UGGT2、UGGT2-D1333A、SEP15、EDEM2、EDEM2-E117Q、CANX、CALR、ERP57和PPIB-ERP29分别引入FIM1ΔU，生成KMUGGT1、KMU1-D1358A、KMUGGT2、KMU2-D1333A、KMSEP15、KMEDEM2、KME-E117Q、KMCNX、KMCRT、KMp57和KMcypb-p29。UGGT2引入KMUGGT1生成KMU1&2。SEP15引入KMUGGT1、KMUGGT2和KMU1&2，分别生成KMU1-S、KMU2-S和KMU1&2-S。ERP57引入KMCNX和KMCRT，生成KMCNX-p57和KMCRT-p57。PPIB-ERP29引入KMCNX-p57和KMCRT-p57，生成KMCNX-3C和KMCRT-3C。GTB1在FIM1ΔU和KMU1&2-S中敲除，生成KM gtb1Δ和KMU1&2-S-gtb1Δ。GTB1-E110A、GTB1-R629A和GTB1-Y654F引入KM gtb1Δ，生成KMβ-E110A、KMβ-R629A和KMβ-Y654F。GTB1-E110A引入KMU1&2-S-gtb1Δ生成KMU1&2-S-E110A。CNE1在FIM1ΔU和KMUGGT1中敲除，生成KM cne1Δ和KMU1-cne1Δ。ROT2在FIM1ΔU和KM gtb1Δ中敲除，生成KM rot2Δ和KMGIIΔ。GANAB引入KMGIIΔ生成KMhGIIα，PRKCSH引入KMhGIIα生成KMhGII。MNS1在FIM1ΔU中敲除生成KM mns1Δ。EDEM2引入KMU1&2-S和KMU1&2-S-E110A，分别生成KMU1&2-S-EDEM2和KMultra。
【数据】培养基：YPD（2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）/SC-Ura/YD（2%酵母提取物、4%葡萄糖）；温度：30°C；菌株：FIM1ΔU为野生型
2.3 统计分析
定量实验使用三个独立生物学重复（另有说明除外）。数据以平均值±标准差（SD）表示。统计分析使用GraphPad Prism 8软件。两组独立样本间比较采用双尾非配对Student's t检验。P < 0.05认为差异具有统计学意义。具体P值或显著性水平在各图中标注。生长曲线按各图分别采用双因素重复测量ANOVA分析，以菌株为受试者间因素、时间为受试者内因素，随后在各时间点进行双侧Dunnett多重比较检验，将每个工程菌株与WT比较；每个时间点作为一个族，报告多重性校正后的P值。Fc稀释分析和β-乳球蛋白标准曲线使用线性回归，报告决定系数（R²）。
【数据】生物学重复：3次；统计软件：GraphPad Prism 8；显著性阈值：P < 0.05
2.4 人源糖蛋白质量控制蛋白的检测与免疫共沉淀
酵母细胞以初始OD600为0.2接种于50 mL YPD培养基，在30°C培养4–6小时至指数期。收集相当于75 OD600单位的细胞，重悬于5 mL PBS（pH 7.2）中。将一片蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche，04693159001）溶解于10 mL ddH₂O制备蛋白酶抑制剂工作液。PBS重悬的细胞再次离心，所得细胞沉淀用500 μL蛋白酶抑制剂工作液重悬。细胞悬液与500 μL玻璃珠（G8772，Sigma-Aldrich）混合，使用珠磨破碎仪（FastPrep-24，MP）以6 m/s破碎共3分钟，每处理30秒后在冰上冷却2分钟。裂解液在4°C、12,000 rpm离心20分钟，收集上清。上清或沉淀经SDS-PAGE或非变性PAGE（Molecular Cloning…）分析。
【数据】初始OD600：0.2；培养时间：4–6h；温度：30°C；细胞量：75 OD600单位；PBS pH：7.2；破碎速度：6 m/s；破碎时间：3min（每30s冰浴2min）；离心：12,000 rpm，4°C，20min
研究结果
3.1 人源UGGT以催化活性依赖方式促进马克斯克鲁维酵母中糖蛋白的可溶表达与分泌
在哺乳动物ER中，UGGT作为糖蛋白质量控制的守门人，识别错误折叠底物并对其N-糖链进行再糖基化，使其重新进入calnexin/calreticulin折叠循环（Williams et al., 2024）。由于马克斯克鲁维酵母缺乏UGGT同源物，我们引入了人源UGGT1或其催化突变体UGGT1-D1358A（Takeda et al., 2014），生成KMUGGT1和KMU1-D1358A。由于UGGT1表达盒较大（6800 bp），基因组整合使用高效率StaCas9系统（Li et al., 2026）完成。两种蛋白均成功表达（图2A），且未显著影响细胞生长（图S2）。
首先评估人IgG Fc片段——含单个N-糖基化位点。PNGase F处理导致明显的迁移率变化（图S3）。与WT相比，KMUGGT1使胞内可溶性Fc增加57%，不溶性聚集体减少22%，分泌提高55%（图2B–D），表明折叠效率、溶解性和分泌能力均获改善。相反，UGGT1-D1358A无显著效果。条带特异性通过空载体对照验证（图S4）。为排除糖基化异质性的影响，上清液经PNGase F处理后定量预期分子量处条带，结果一致（图S5）。这些结果表明UGGT1以催化活性依赖方式促进Fc生产。
γ-谷氨酰水解酶（GGH）是已知的UGGT底物（Adams et al., 2020），在马克斯克鲁维酵母中也发生糖基化（图S3）。UGGT1使GGH分泌提高38%，而UGGT1-D1358A将其降低至WT的约30%（图2E），可能由于底物捕获效应。PNGase F处理后观察到类似结果（图S5），表明UGGT1广泛促进人源糖蛋白分泌。
随后检测非人源糖蛋白——来自Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶Xyn-CDBFV（Zhou et al., 2018）。UGGT1使其分泌提高70%，而UGGT1-D1358A无显著影响（图2F）。PNGase F处理样品结果一致（图S5），证明UGGT1在马克斯克鲁维酵母中促进多种来源糖蛋白的分泌。
为确定UGGT1是否以糖基化依赖方式增强蛋白分泌，检测了非糖基化蛋白endo-1,4-β-甘露聚糖酶MAN330（Zhou et al., 2025）。UGGT1及其催化突变体均未显著影响MAN330分泌（图S6）。因此，UGGT1并非对蛋白分泌具有普遍增强作用，而是特异性改善糖蛋白的生产。
最后评估第二种异构体UGGT2。UGGT2表达盒（7258 bp）使用StaCas9整合至基因组。UGGT2及其催化突变体UGGT2-D1333A均成功表达（图2A），未显著影响生长（图S2）。UGGT2使Fc分泌提高32%，而UGGT2-D1333A效果减弱（15%）（图2G）。类似地，UGGT2使Xyn-CDBFV分泌提高36%，UGGT2-D1333A仅产生微弱效果（7%）（图2H）。因此，与UGGT1类似，UGGT2以催化活性依赖方式促进糖蛋白分泌，但效率较低，可能由于底物特异性差异。
【数据】UGGT1表达盒：6800bp；UGGT2表达盒：7258bp；Fc分泌：KMUGGT1较WT提高55%；胞内可溶Fc：+57%；不溶性聚集体：-22%；GGH分泌：+38%（UGGT1），UGGT1-D1358A降至WT的30%；Xyn-CDBFV分泌：+70%（UGGT1）；Fc分泌：+32%（UGGT2），+15%（UGGT2-D1333A）；Xyn-CDBFV：+36%（UGGT2），+7%（UGGT2-D1333A）
3.2 辅伴侣SEP15增强UGGT介导的糖蛋白分泌
SEP15是UGGT的辅伴侣，可增强其对糖蛋白底物的活性（Williams et al., 2024）。为评估其效果，将人源SEP15引入WT马克斯克鲁维酵母及表达UGGT1、UGGT2或两者共表达的菌株。SEP15的硫氧还蛋白样结构域含有稀有氨基酸硒代半胱氨酸（Sec），对其功能至关重要（Ren et al., 2018）。由于马克斯克鲁维酵母缺乏Sec掺入机制，Sec被替换为半胱氨酸——该变体保留与野生型SEP15相当的活性（Takeda et al., 2014）。SEP15在WT、含UGGT1和UGGT2的菌株中均成功表达（图3A）。
采用Co-IP实验检测UGGT1/UGGT2与SEP15之间的相互作用（图3B）。将表达FLAG标签SEP15的质粒转化至同时表达UGGT1和UGGT2的KMU1&2细胞。在抗FLAG免疫沉淀物中检测到UGGT1和UGGT2，而在不含SEP15-FLAG质粒的KMU1&2细胞免疫沉淀物中两种蛋白均未检出。这些结果表明UGGT1和UGGT2在马克斯克鲁维酵母细胞中与SEP15相互作用。一致地，非变性PAGE显示SEP15表达后UGGT1和UGGT2条带向上迁移，提示形成SEP15–UGGT1和SEP15–UGGT2复合物（图S7）。
单独表达SEP15或与UGGT1和UGGT2共表达均未显著影响细胞生长（图S2）。SEP15单独表达不增强Fc分泌（图3C）。然而，在表达UGGT1的细胞中，SEP15使Fc分泌从WT的167%提高至199%（图3D）。在表达UGGT2的细胞中，Fc分泌从128%提高至139%（图3E）。在共表达UGGT1和UGGT2的菌株中，SEP15进一步使Fc分泌从207%提高至253%（图3F）。Xyn-CDBFV也观察到类似趋势。SEP15单独表达无效果，但在表达UGGT1的细胞中分泌从157%提高至172%；在表达UGGT2的细胞中从143%提高至162%；在UGGT1/UGGT2共表达菌株中从169%提高至196%（图3G–J）。综上，SEP15在马克斯克鲁维酵母中的表达进一步增强UGGT1和UGGT2介导的多种糖蛋白分泌，可能通过直接相互作用提高UGGT对底物的催化活性。
【数据】Fc分泌（相对WT%）：UGGT1+SEP15：167%→199%；UGGT2+SEP15：128%→139%；UGGT1&2+SEP15：207%→253%；Xyn-CDBFV分泌（相对WT%）：UGGT1+SEP15：157%→172%；UGGT2+SEP15：143%→162%；UGGT1&2+SEP15：169%→196%
3.3 人源CNX/CRT及其辅因子不能进一步增强UGGT介导的糖蛋白分泌
除UGGT和SEP15外，还检测了人源CNX/CRT循环的其他组分能否增强糖蛋白分泌。马克斯克鲁维酵母含有CNX/CRT同源物Cne1。为避免潜在干扰，首先评估其作用。CNE1敲除未显著影响细胞生长（图S8），但与WT相比Fc分泌出现轻微但显著的下降（图4A），表明内源Cne1部分支持糖蛋白分泌。值得注意的是，在UGGT1背景中敲除CNE1使Fc分泌相对于单独UGGT1降低约9%（图4B），与WT背景中观察到的降低幅度（约7%）相似。这种加性效应提示Cne1和UGGT1通过不同途径发挥作用，与酵母Cne1不参与经典CNX/CRT循环而在其他过程（如β-1,6-葡聚糖合成）中发挥功能的报道一致（Kurita et al., 2012）。
基于此，引入人源CNX、CRT及其辅因子（ERp57、ERp29和CypB）评估其效果。所有蛋白均成功表达（图S9），未显著损害细胞生长（图S8）。单独表达ERp57或CRT对Fc分泌影响极小（图4C和D）。然而，CRT与ERp57共表达使Fc分泌相对WT降低约20%，提示其相互作用损害折叠和分泌（图4D）。该负面效应在UGGT1背景中更为明显——CRT和ERp57共表达使Fc分泌从178%降至135%（图4E）。类似地，CNX与ERp57共表达在WT和UGGT1菌株中均轻微降低Fc分泌，但效应较弱且不显著（图4F和G）。WT中ERp29和CypB共表达对Fc分泌无影响（图4H）。但在UGGT1+CRT+ERp57或UGGT1+CNX+ERp57背景中，ERp29和CypB共表达显著降低Fc分泌（分别从135%降至78%和从144%降至81%）（图4I和J）。这些结果表明ERp29和CypB干扰糖蛋白折叠，不仅消除了UGGT1介导的Fc分泌增强…
【数据】Fc分泌（相对WT%）：cne1Δ：约-7%；UGGT1+cne1Δ：约-9%；CRT+ERp57共表达：-20%；UGGT1+CRT+ERp57：178%→135%；UGGT1+CRT+ERp57+ERp29+CypB：135%→78%；UGGT1+CNX+ERp57+ERp29+CypB：144%→81%
3.4 改造GlsII β亚基改善糖蛋白分泌
（此节原文未完整提供，以下内容基于可获得的原文节选忠实翻译）
在哺乳动物细胞中，葡萄糖苷酶II（GlsII）由催化性α亚基（GANAB）和β亚基（PRKCSH）组成。β亚基对底物识别具有重要作用。本研究对GTB1（编码GlsII β亚基同源物）进行了突变改造。GTB1-E110A突变体（KMβ-E110A）表现出…（原文此处信息不完整，无法完整翻译该段落全部内容。根据可获得原文，该节涉及将人源GANAB和PRKCSH引入KMGIIΔ菌株（该菌株为GTB1和ROT2双敲除背景），生成KMhGIIα（仅GANAB）和KMhGII（GANAB+PRKCSH），并检测其对Fc分泌的影响。）
【数据】原文未完整提供该节全部数据。
3.5 人源EDEM2延缓糖蛋白降解并增强分泌
（此节原文未完整提供，以下内容基于可获得原文节选忠实翻译）
在哺乳动物ER中，EDEM2是ERAD途径的限速酶之一，负责识别和提取错误折叠的糖蛋白。本研究将人源EDEM2及其催化突变体EDEM2-E117Q引入马克斯克鲁维酵母，生成KMEDEM2和KME-E117Q。EDEM2的过表达…（原文此处信息不完整。根据可获得信息，EDEM2在UGGT1&2-S背景中表达后进一步增强了Fc分泌，且EDEM2-E117Q催化突变体的效果弱于野生型EDEM2，表明EDEM2的催化活性对其促进分泌的功能具有重要作用。）
【数据】原文未完整提供该节全部数据。
3.6 糖蛋白质量控制通路组合工程显著增强分泌
（此节原文未完整提供，以下内容基于可获得原文节选忠实翻译）
将上述策略进行组合。GTB1-E110A突变（β亚基突变以减少GlsII对N-糖链的修剪）与EDEM2表达分别或共同叠加至UGGT1&2-SEP15背景中。GTB1-E110A引入KMU1&2-S-gtb1Δ生成KMU1&2-S-E110A，EDEM2引入KMU1&2-S和KMU1&2-S-E110A分别生成KMU1&2-S-EDEM2和KMultra。KMultra菌株综合了UGGT1&2、SEP15、GTB1-E110A和EDEM2四种改造。在KMultra中，多种N-糖蛋白的分泌产量获得进一步提升，包括Fc、GGH、真菌木聚糖酶和Fc融合治疗蛋白，最高提升约12倍。
【数据】最高提升倍数：约12倍（原文未完整提供各蛋白具体数值）
3.7 人源化马克斯克鲁维酵母高效生产Fc融合治疗蛋白
（此节原文未完整提供，以下内容基于可获得原文节选忠实翻译）
在WT和KMultra（Ultra）菌株中分别表达三种Fc融合治疗蛋白——度拉糖肽（dulaglutide）、阿巴西普（abatacept）和依那西普（etanercept）。KMultra菌株中三种治疗蛋白的产量均显著高于WT菌株。所生产的重组糖蛋白具有功能性。
【数据】原文未完整提供该节具体产量数值。
讨论与解读
与酵母相比，人源糖蛋白QC系统有两个关键特征——通过CNX/CRT循环进行迭代折叠，以及严格调控ERAD进入——延长了ER滞留时间，通过反复与ER伴侣和折叠酶相互作用提高正确折叠的概率。本研究将人源UGGT及其辅伴侣、人源ERAD限速酶引入马克斯克鲁维酵母，同时改造内源GIIβ修剪突变体。这些改造可能通过延长ER滞留时间，将简化的酵母QC系统重塑为更接近人类的网络，增强糖蛋白折叠和分泌。
生长方面，除KMSEP15外，所有突变体在24小时的OD600值与WT无显著差异或略高。KMSEP15在24小时仅比WT低约10%。补料分批发酵中WT和KMultra的细胞干重相当。这表明在N-糖蛋白QC系统工程化过程中马克斯克鲁维酵母保持稳健，部分归因于摇瓶培养使用的富营养YPD培养基和发酵过程中充足的营养供给。
【编译者解读】该研究巧妙借鉴人源QC系统的"迭代折叠"逻辑，而非简单过表达单一分子伴侣——引入UGGT催化循环并搭配辅伴侣SEP15，同时用EDEM2延缓降解，形成"延长折叠窗口+延缓清除"的双向策略。12倍的分泌提升幅度在酵母糖蛋白生产中相当可观。局限在于：人源QC组分在酵母中的底物谱尚不完全清楚，且GlsII β亚基突变的机制解析仍需深化。未来若能将此策略与糖链人源化改造（如删除高甘露糖型修饰）联用，有望进一步逼近商业化的治疗性糖蛋白酵母生产平台。
参考来源
Ai Y. Humanization of N-glycan-dependent protein quality-control system in Kluyveromyces marxianus promotes glycoprotein secretion. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102519
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102519