来源：An integrated sensing, adsorption, and recovery platform using engineered Escherichia coli for mercury remediation（Environmental Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
汞是一种具有持久性、生物累积性和高毒性的全球性污染物。本研究基于工程化大肠杆菌构建了集实时监测、高效吸附与磁回收于一体的多功能修复平台：通过表面展示串联汞结合肽将吸附能力提升至对照菌株的近两倍；借助T7 RNA聚合酶信号放大级联实现低至0.001 μM的灵敏检测；进一步与磁性纳米颗粒交联后，在天然水体中实现约90%的汞去除和超过90%的细胞回收。鱼类毒性评估证实该平台可有效降低汞暴露风险。
研究背景
汞因其环境持久性、生物累积性和远距离迁移能力，已成为备受关注的全球性污染物。自工业革命以来，采矿、化石燃料燃烧和工业排放等人类活动显著扰动了汞的自然生物地球化学循环，导致各类水生生态系统中汞浓度持续上升，对生态系统和人类健康构成严重威胁。物理化学修复方法（如吸附、化学沉淀、膜分离）虽有一定效果，但普遍存在成本高、能耗大和二次污染风险。以微生物细胞作为吸附平台的生物修复策略因生长快速、操作简便和环境友好而被视为有前景的绿色方案。然而，天然汞抗性微生物在实际应用中仍面临吸附效率不足、缺乏实时监测能力以及菌体回收困难等瓶颈。
研究方法
2.1 菌株构建与培养条件
本工作构建的载体和菌株列于补充表（表S1）。汞吸附模块构建方面，编码OmpA N端区域（1–477 bp）的DNA片段通过PCR分别与编码Hg²⁺结合肽的序列融合。各融合片段随后克隆至pXMJ19质粒（lac操纵子已删除）。由于pXMJ19衍生质粒携带缺失的lac操纵子，汞结合肽无需异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导即可组成型表达。该设计确保结合肽的持续表面展示，有利于潜在的现场应用。
汞检测模块构建方面，将merR-P_mer片段（源自福氏志贺菌mer操纵子）与绿色荧光蛋白基因（gfp）通过重叠PCR融合，融合产物克隆至pET28a（lac操纵子和T7启动子已删除），生成pET28a-merR-P_mer-gfp。随后，编码AVV降解标签的DNA片段通过PCR分别添加至gfp、merR和T7 RNA聚合酶基因的下游区域。这些构建体分别克隆至pET28a（lac操纵子和T7启动子已删除），生成三种质粒：pET28a-merR-P_mer-gfp-avv、pET28a-gfp-avv-merR-P_mer-T7-avv和pET28a-gfp-avv-merR-avv-P_mer-T7-avv。所有重组载体均转化至大肠杆菌BL21。通过菌落PCR筛选推定阳性转化子。所得菌株在Luria–Bertani（LB）培养基中维持，根据需要添加氯霉素（15 μg/mL）或卡那霉素（25 μg/mL）。
【数据】菌株：大肠杆菌BL21；培养基：LB；抗生素：氯霉素15 μg/mL、卡那霉素25 μg/mL；诱导剂：无需IPTG；载体：pXMJ19、pET28a
2.2 汞生物吸附
为评估工程菌株的汞吸附性能，首先将细菌在LB肉汤中过夜培养。将过夜培养物用新鲜培养基稀释50倍，于37°C培养至早期稳定期（约10 h）。随后收集细胞并重悬于含不同浓度HgCl₂的溶液中，以评估菌株的浓度依赖性吸附能力。为评估pH对吸附效率的影响，将细胞在含50 μM HgCl₂并采用适当缓冲液调节至不同pH值的培养基中孵育。为评估温度的影响，将细胞在含50 μM HgCl₂、pH 7.0的培养体系中于不同温度下孵育。所有吸附实验中，暴露4 h后终止反应，收集细胞进行汞含量测定。细胞吸附的汞量使用AA-7000原子吸收光谱仪（日本岛津）定量。肽分子与汞之间相互作用的构象预测使用Chai Discovery进行。
【数据】菌株：工程大肠杆菌；HgCl₂浓度：50 μM（pH/温度实验）、不同浓度（浓度依赖性实验）；温度：37°C；时间：约10 h培养至早期稳定期、4 h吸附反应；稀释倍数：50倍；仪器：AA-7000原子吸收光谱仪（岛津）
2.3 汞生物检测
将生物传感器菌株培养至早期稳定期，离心收集并重悬于新鲜培养基中。随后将其暴露于不同浓度（10⁻⁴ μM至10 μM）的Hg²⁺溶液中，于37°C诱导4 h。使用荧光酶标仪（美国Thermo Scientific）测量荧光强度，激发和发射波长分别为485 nm和520 nm。为评估生物传感器的特异性，在细菌悬浮液中分别添加Hg²⁺或其他单一金属离子（Zn²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Pb²⁺），终浓度为0.05 μM或0.1 μM。在相同条件下诱导4 h后测量荧光。为评估共存金属离子的干扰，在含0.05 μM Hg²⁺的细菌悬浮液中进一步添加0.1 μM的其他各金属离子。混合诱导4 h后测量荧光强度。为表征荧光响应动力学，将菌株分别添加到含0.1 μM或0.05 μM Hg²⁺的培养基中，于37°C孵育，在不同时间点取样测量荧光，绘制荧光强度-时间曲线。动态荧光响应实验中，菌株首先用0.05 μM Hg²⁺预诱导4 h，离心收集细胞，重悬于含0.1 μM Hg²⁺的新鲜培养基中继续培养并随时间监测荧光强度。反之，菌株用0.1 μM Hg²⁺预诱导4 h后转移至含0.05 μM Hg²⁺的培养基中，同样记录荧光强度随时间的变化。
【数据】Hg²⁺浓度范围：10⁻⁴–10 μM；诱导温度：37°C；诱导时间：4 h；激发/发射波长：485/520 nm；单一金属离子终浓度：0.05或0.1 μM；共存离子干扰实验：0.05 μM Hg²⁺ + 0.1 μM其他金属离子；动力学实验Hg²⁺浓度：0.1或0.05 μM；预诱导浓度：0.05或0.1 μM，4 h
2.4 工程菌回收及磁性复合物的制备与表征
氨基修饰的磁性纳米颗粒（MNPs，直径200 nm，BeyoMag™ Amine Magnetic Beads，中国碧云天）按照制造商说明进行活化。随后，将1 mL携带质粒pXMJ19-ompA-HG6和pET28a-gfp-avv-merR-P_mer-T7-avv的HG-GFP菌株（OD600 = 1）与不同量（10、20、30、40、50 μg）的活化MNPs混合。孵育混合物使其发生交联。交联后，所得MNPs-细菌偶联物（命名为HG-GFP@MNP）通过5000 rpm离心5 min收集。将HG-GFP@MNP复合物重悬于PBS溶液中，随后使用外加磁场收获该复合物。取一份HG-GFP@MNP复合物，用2.5%戊二醛于4°C固定4 h，经梯度乙醇系列（50%、60%、70%、80%、90%和100%）脱水，在扫描电子显微镜（日本日立S-4800）下观察复合物的微观形貌。含未结合细菌的剩余上清液经梯度稀释后涂布于含15 μg/mL氯霉素和25 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板，孵育后进行菌落计数。细胞回收率根据初始菌落形成单位计算。
【数据】MNPs直径：200 nm；菌液量：1 mL（OD600 = 1）；MNPs用量：10–50 μg；离心：5000 rpm，5 min；固定：2.5%戊二醛，4°C，4 h；乙醇梯度：50%、60%、70%、80%、90%、100%；SEM：日立S-4800；抗生素平板：15 μg/mL氯霉素 + 25 μg/mL卡那霉素
2.5 环境水样中的汞生物吸附与检测
本研究使用环境水样，包括河水（采集自中国南昌赣江）、湖水（采集自南昌艾溪湖）和生活污水（采集自南昌市政下水道）。各水样经0.22 μm滤膜过滤去除颗粒物后，加标0.2 μM Hg²⁺备用。将HG-GFP菌株（OD600 = 1）重悬于上述加标水体中，于37°C孵育4 h。孵育后取样测量细胞荧光强度，同时测定溶液中残余汞浓度，以评估HG-GFP在环境水样中的吸附效率和检测响应。将HG-GFP@MNP复合物重悬于加标水体中，于37°C孵育4 h。随后用外加磁场回收复合物，收集上清液测定残余汞浓度。
【数据】水样来源：赣江河水、艾溪湖湖水、南昌市政污水；过滤膜孔径：0.22 μm；Hg²⁺加标浓度：0.2 μM；菌株OD600：1；孵育条件：37°C，4 h；检测指标：细胞荧光强度、溶液中残余汞浓度
2.6 鱼类毒性评估
健康的麦穗鱼（Pseudorasbora parva，体长2–3 cm）在实验室条件下驯化7天。驯化期间水温维持在22 ± 2°C，每天投喂商业鱼饲料两次。每天更换部分曝气自来水。驯化结束后，将鱼随机分为四组（每组30尾）。空白对照组（RW）暴露于未添加汞的河水中；汞污染组（Hg-RW）暴露于含0.1 μM Hg²⁺的河水中。单次处理组（Hg-RW + MNP-1T）暴露于经汞加标的河水（初始Hg²⁺浓度0.1 μM）中，该河水此前已经……（原文节选在此处截断）
【数据】实验鱼：麦穗鱼，体长2–3 cm；驯化时间：7天；水温：22 ± 2°C；饲喂频率：每日2次；分组：4组，每组30尾；Hg²⁺暴露浓度：0.1 μM
研究结果
3.1 展示结合肽的工程菌株对汞离子的生物吸附
本研究构建了三种展示不同汞结合肽的工程大肠杆菌菌株：HG1（展示CSGCSGCSGC）、HG2（展示CTGCTGCTGC）和HG3（展示CAACAACAAC）。仅展示OmpA的菌株（OMP）作为对照（图2a）。
如图2c所示，各菌株吸附的汞量随溶液中Hg²⁺浓度升高而增加。三种展示肽的菌株均表现出显著高于对照菌株的吸附能力。值得注意的是，HG3菌株表现出最高的汞吸附能力，在200 μM Hg²⁺溶液中超过52 μmol/g DCW，几乎是对照菌株的两倍。半胱氨酸残基的巯基对Hg²⁺具有高亲和力。结构模拟结果（图2b）表明，Hg²⁺主要与肽链内的半胱氨酸残基配位。在三种肽中，HG3展示的肽（CAACAACAAC）具有最高的预测置信度，pTM值为0.1029，提示其与汞形成最稳定的复合物。
为进一步提升吸附性能，本研究采用了Ravikumar等人（2011）描述的串联肽展示策略。构建了HG4菌株，在细胞表面展示由柔性接头（CGSGSGS）连接的两个串联CAACAACAAC单元。如图2a所示，HG4菌株的汞吸附能力显著提高，尤其在较高汞浓度下更为明显，表明串联肽增加了单位面积的有效结合位点数量，从而增强了吸附能力。
此外，本研究系统评估了环境因素对HG4吸附性能的影响。如图2c所示，汞吸附量随pH降低而逐渐下降。温度方面（图2d），吸附量在18–42°C范围内相对稳定，但在低于18°C或高于42°C时显著下降。进一步考察了HG4的吸附选择性。在单一金属测试（50 μM）中，HG4不仅吸附Hg²⁺，还能吸附Pb²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Ni²⁺，显示出广谱结合能力。在含全部六种金属的混合体系中，Hg²⁺吸附被抑制了10–30%（图S3）。这表明富含巯基的表面肽即使在竞争条件下仍对Hg²⁺具有高亲和力，使HG4适用于多金属废水处理，但可能需要调整投加量以优化Hg²⁺去除效果。
【数据】HG3吸附量：>52 μmol/g DCW（200 μM Hg²⁺溶液）；pTM值：0.1029；对照倍数：近2倍；pH影响：吸附量随pH降低逐渐下降；温度范围：18–42°C内稳定；单金属测试浓度：50 μM；混合金属体系中Hg²⁺吸附抑制：10–30%
3.2 基于荧光信号放大遗传电路的汞检测
首先，将汞诱导型启动子P_merR与荧光蛋白基因融合（图3a），构建基础生物传感器（GFP1菌株）。为进一步提高灵敏度，使用P_merR驱动T7 RNA聚合酶的表达，后者进而激活T7启动子表达GFP，从而建立信号级联放大系统（GFP2菌株）。
如图3b所示，在0.001–10 μM的Hg²⁺浓度范围内，GFP1和GFP2均表现出显著高于对照（GFP0）的荧光信号。然而，当汞浓度超过0.5 μM时，两种传感器的荧光强度均下降，推测是高浓度汞对细胞生长和蛋白质合成的毒性作用所致。在0.005–0.1 μM Hg²⁺范围内，GFP1的荧光强度与汞浓度的对数呈线性关系。相比之下，GFP2凭借其信号放大电路，将线性检测范围扩展至0.001–0.1 μM（图S1）。在所有测试浓度下，GFP2的荧光信号均显著强于GFP1，表明T7级联放大系统有效增强了传感器的信号输出和检测灵敏度。
为评估GFP2的特异性，将0.05 μM Hg²⁺与0.1 μM的其他金属离子（Zn²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Cr³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Pb²⁺）混合检测。结果显示，其他金属的存在未显著影响荧光信号（图3c），证实GFP2对汞具有良好的特异性。进一步测试对单一金属离子的响应，发现仅在Hg²⁺存在时出现明显的荧光增强（图3d），证明该传感器具有高选择性。与其他同样基于MerR的全细胞检测器（检出限范围0.01–6.25 μM）相比，GFP2实现了低至0.001 μM的检出限，展现出优异的灵敏度。此外，与Yin等人（2016）开发的基于表面展示羧酸酯酶E2活性抑制的传感器（检出限0.5 μM）相比，GFP2的灵敏度提高了两个数量级。重要的是，其基于转录的检测机制避免了酶活性易受pH和温度等环境因素干扰的固有局限，因而具有更好的稳定性和可靠性。GFP2传感器成功将灵敏检测范围扩展至与环境背景相关的纳摩尔水平，为监测饮用水和地表水等场景中的低浓度汞污染提供了显著优势。
【数据】Hg²⁺检测范围：0.001–10 μM（GFP1和GFP2）；信号下降阈值：>0.5 μM；GFP1线性范围：0.005–0.1 μM；GFP2线性范围：0.001–0.1 μM；GFP2检出限：0.001 μM；干扰实验：0.05 μM Hg²⁺ + 0.1 μM其他金属离子；对比文献检出限：0.01–6.25 μM（Wang等，2020；Zhang等，2021）、0.5 μM（Yin等，2016）
3.3 汞的实时动态监测
实时追踪分析物浓度波动是环境生物传感的关键挑战。水生系统中的汞水平高度动态，受排放事件、降雨和水流等因素影响。传统全细胞生物传感器通常依赖长半衰期的荧光蛋白，积累的报告蛋白掩盖了分析物浓度的实时变化，导致信号转换缓慢和时间分辨率差。降解标签提供了一种便捷的翻译后调控策略，带有降解序列的蛋白质被细胞蛋白酶识别并降解，从而加速蛋白质周转。
据此，本研究将降解标签分别融合至GFP、T7 RNA聚合酶和MerR，构建了GFP3、GFP4和GFP5菌株（图4a）。虽然GFP降解可能降低荧光强度和检测灵敏度，但T7 RNA聚合酶信号放大级联的引入在一定程度上缓解了这一缺陷。GFP3和GFP4均保持了对0.001–0.1 μM范围内Hg²⁺浓度的检测灵敏度（图4b），且在此浓度范围内，其荧光强度与汞浓度的对数呈线性关系（图S2）。然而，在GFP5中，MerR融合降解标签后，其快速降解导致T7 RNA聚合酶翻译水平下降，从而降低了检测灵敏度。
为评估菌株对汞的响应时间，将GFP2（对照）、GFP3和GFP4分别添加到含0.1 μM汞的培养基中。结果显示，GFP3的荧光强度在150 min后趋于稳定，而GFP2需要180 min；GFP4达到稳定状态最快，仅需120 min（图4c）。在含0.05 μM汞的培养基中，GFP2再次需要180 min才能稳定，而GFP3和GFP4均在80 min内稳定（图4d）。进一步研究了菌株对汞浓度变化的动态响应。当菌株先在含0.05 μM汞的培养基中培养，然后转移至含0.1 μM汞的培养基中时（图4e），GFP2和GFP3的荧光强度持续增加120 min，而GFP4在90 min内即达到稳定。相反，当菌株从0.1 μM汞培养基转移至0.05 μM汞培养基时……（原文节选在此处截断）
【数据】响应稳定时间（0.1 μM Hg²⁺）：GFP3为150 min、GFP2为180 min、GFP4为120 min；响应稳定时间（0.05 μM Hg²⁺）：GFP2为180 min、GFP3和GFP4均为80 min；动态响应（0.05→0.1 μM）：GFP2和GFP3持续增加120 min、GFP4在90 min内稳定；检测范围：0.001–0.1 μM
讨论与解读
本研究成功构建了集汞离子实时监测、高效吸附和磁回收于一体的多功能平台。表面展示的串联汞结合肽显著增强了Hg²⁺吸附能力，HG4菌株达到超过52 μmol/g DCW，几乎是对照的两倍，并在中性pH和18–42°C条件下保持稳定性能。利用T7 RNA聚合酶级联和降解标签开发了高灵敏度生物传感器，改善了动态响应。HG-GFP菌株中吸附与检测模块的共表达实现了汞的同步监测与去除。与磁性纳米颗粒交联获得的HG-GFP@MNP复合物在天然水体中实现了>90%的细胞回收率和约90%的汞去除率。利用麦穗鱼的生态安全评估表明，经两轮HG-GFP@MNP处理后，汞加标河水未导致鱼组织汞积累或肝脏氧化应激标志物与对照组产生显著差异，两项参数均恢复至对照水平，证实了有效的解毒效果。这种集成的“感知—吸附—回收”平台为重金属污染物的生物修复提供了可迁移的技术策略。
编译者解读
该研究的核心价值在于将三个独立功能——灵敏检测、高效吸附和便捷回收——整合进单一工程菌平台，且各模块间实现了功能兼容而非相互干扰。串联肽展示策略与T7信号放大电路的结合体现了合成生物学中“模块化—系统集成”的设计理念。磁性纳米颗粒交联方案巧妙规避了工程菌环境释放的生态风险争议，使“生物修复+物理回收”形成闭环。值得关注的是，作者以麦穗鱼为模型验证了处理水体的实际解毒效果，而非仅停留在水质数据层面，这为后续工程化应用提供了更有说服力的生态安全证据。局限在于目前仍处于实验室规模验证阶段，实际水体中复杂微生物竞争和长期运行稳定性有待进一步考察。
参考来源
Huang M. An integrated sensing, adsorption, and recovery platform using engineered Escherichia coli for mercury remediation. Environmental Research, 2026. DOI: 10.1016/j.envres.2026.125152
DOI: 10.1016/j.envres.2026.125152