来源：1H NMR- and GC–MS-based metabolomics reveal the metabolic response of Pseudomonas granadensis to the presence of Staphylococcus epidermidis（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
土壤微生物间的竞争催生了复杂的化学防御策略。本研究从意大利坎皮佛莱格瑞火山地区分离到一株 Pseudomonas granadensis，发现其仅在与人病原菌表皮葡萄球菌共培养时，才产生抑制后者的活性代谢物。作者整合 1H NMR 与 GC–MS 双平台代谢组学方法，揭示了该菌在竞争压力下的代谢重编程图景——包括糖消耗增强、多种有机酸积累以及脂肪酸生物合成激活。这一发现为挖掘土壤细菌的抗菌潜力提供了新视角。
研究背景
土壤承载着极为复杂的微生物群落，这些微生物在持续变化的生物与非生物条件下演化出独特的生存策略，包括产生具有抗菌活性和植物促生作用的生物活性代谢物。假单胞菌属因基因组变异大、代谢途径多样和表型可塑性强而备受关注，其适应性很大程度上建立在产生抗菌化合物及其他参与种间互作的小分子代谢物的能力之上。尽管科学界对利用土壤假单胞菌的防御策略来应对临床耐药菌问题抱有浓厚兴趣，但土壤微生物组中仍有大量物种的功能潜力尚未被表征。本研究从火山土壤中分离到一株 P. granadensis，并对其在竞争条件下产生的代谢响应进行了系统研究。
研究方法
2.1 细菌菌株
以 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）ATCC 43300 作为标准化参考靶菌株，用于评估分离株的抗菌活性。两株菌均以 15%（v/v）甘油的冻存液保存于 −80 °C。每次实验前，将冻存等份转接至 Mueller-Hinton 琼脂（MHA）平板上，于 37 °C 培养 24/48 小时以获得单菌落。使用新鲜培养物制备标准化菌悬液，用无菌林格氏液将细胞密度调至 0.5 McFarland（约 10⁸ CFU mL⁻¹），确保各批次实验的可重复性。
【数据】保存条件：15% 甘油、−80 °C；培养基：MHA；温度：37 °C；时间：24/48 h；菌悬液浓度：0.5 McFarland（≈10⁸ CFU mL⁻¹）
2.2 土壤采样与细菌分离
土壤样品采自意大利那不勒斯坎皮佛莱格瑞火山区域多个无人居住点位的 10–20 cm 深度处，使用无菌采集套件（刮刀、手套和采集管）进行，尽量避兔操作和运输过程中的污染。为分离环境菌株，将每份 1 g 土壤样品悬浮于 9 mL 无菌林格氏液（等渗盐溶液）中。从该悬浮液制备 1:10 稀释液，随后涂布于添加了 4 mg mL⁻¹ 放线菌酮（抑制真菌生长）的非选择性 R2A 培养基上。平板在室温培养 48 小时，待形态上可区分的细菌菌落出现后，根据表型特征挑取单菌落，转接至新鲜 R2A 平板——平板下方放置参考棋盘格，菌落按数字顺序接种于各象限中心，确保可追溯性。
【数据】土壤深度：10–20 cm；样品量：1 g；稀释液：9 mL 林格氏液；培养基：R2A + 4 mg mL⁻¹ 放线菌酮；温度：室温；时间：48 h
2.3 环境菌株的初步生物活性筛选
采用改良交叉划线法对分离的环境菌落进行初步生物活性筛选，以 S. epidermidis 和 MRSA 为靶菌，使用 MHA 平板。对每种对照菌株，将标准化悬液（0.5 McFarland，林格氏液配制）用无菌棉签均匀涂布于 MHA 平板表面。随后用接种环将环境分离株接种于平板下方棋盘格各象限中心位置。平板于 37 °C 培养 24/48 小时后，检查生长抑制区的形成及大小，据此优先筛选活性菌株进行后续鉴定和代谢组学表征。
【数据】培养基：MHA；靶菌：S. epidermidis、MRSA；接种浓度：0.5 McFarland；温度：37 °C；时间：24/48 h
2.4 环境分离株的鉴定
环境菌株通过 MALDI-TOF 质谱分析进行鉴定。P. granadensis 因 MALDI-TOF 得分不明确而成为本工作研究对象，进一步通过 16S rRNA 基因扩增和测序进行鉴定。采用菌落 PCR 方案，使用通用细菌引物：
- 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
- 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
PCR 反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳验证 16S rRNA 基因的成功扩增。具体地，在 1 × TBE 缓冲液中制备 0.8% 琼脂糖凝胶，以确保约 1500 bp（16S rRNA 基因的预期大小）DNA 片段获得最佳分辨率。凝胶终体积为 20 mL，加入 2 μL SYBR Safe 10,000 × 浓缩液（溶于 DMSO）。电泳分离使用配备集成电泳和蓝光透射照明的 Blue Gel 系统，恒定电压 48 V，运行时间 20 分钟。扩增产物经蓝光照明系统可视化，根据 1 Kb Plus DNA 分子量标准，在约 1500 bp 处呈现绿色荧光条带。PCR 扩增产物随后使用 GeneJET PCR 纯化试剂盒按厂商说明进行纯化。纯化后的 PCR 产物采用基于荧光标记 ddNTP 的 Sanger 技术进行测序。测序数据使用多种生物信息学工具分析——用 SnapGene® 软件 5.3 版通过色谱图检查评估序列质量，全长序列使用 EzBioCloud 平台的 16S 鉴定功能和 BLAST 分析确定最相近的细菌匹配。分析确认该分离株为 P. granadensis。
【数据】引物：27F/1492R；凝胶浓度：0.8% 琼脂糖；缓冲液：1 × TBE；凝胶体积：20 mL；染料：2 μL SYBR Safe 10,000×；电压：48 V；时间：20 min；目标片段：~1500 bp
2.5 抗 S. epidermidis 的无细胞上清液抗菌试验
S. epidermidis ATCC 12228 培养物在 Mueller-Hinton 肉汤中制备，于 37 °C、好氧条件下、200 rpm 振荡培养 24 小时。培养物浊度调至 0.5 McFarland 后按 1:100 稀释（终浓度约 10⁶ CFU mL⁻¹）。P. granadensis F35X 的平行培养物——分别在有或无 S. epidermidis 的条件下——在补充了硫酸镁和 20% 葡萄糖（作为碳源）的 M9 基本培养基中制备，以模拟自然土壤环境中常见的营养限制条件。P. granadensis 的初始接种量约为 1.8 × 10⁶ CFU mL⁻¹，S. epidermidis 约为 9.3 × 10⁴ CFU mL⁻¹。接种物从 0.5 McFarland 菌悬液开始制备。培养物于 37 °C、好氧条件下、200 rpm 振荡培养 48 小时。培养结束后， cultures 以 5,000 ×g 离心 10 分钟沉淀菌体，上清液经过滤获得无细胞上清液。
抗菌试验采用微量肉汤稀释法：将标准化 S. epidermidis 培养物（1.5 × 10⁶ CFU mL⁻¹，MHB 中）与来自 P. granadensis M9 培养物（有或无 S. epidermidis 条件下生长）的 CFS 等体积（1:1）混合。对照孔包括未处理细菌培养物（生长对照）、经相同处理的无菌 M9 培养基（基质对照）和万古霉素（生长抑制阳性对照）。各上清液对 S. epidermidis 生长的效果在 24 小时培养后用酶标仪在 630 nm 波长处进行分光光度测定，活性以与未处理对照孔相比的细菌生长抑制百分比来量化。所有实验设三次重复。
【数据】培养基：MHB（靶菌）、M9 + 硫酸镁 + 20% 葡萄糖（P. granadensis）；温度：37 °C；转速：200 rpm；时间：24 h（靶菌预培养）/48 h（共培养）；初始接种量：P. granadensis ~1.8 × 10⁶ CFU mL⁻¹、S. epidermidis ~9.3 × 10⁴ CFU mL⁻¹；离心：5,000 ×g、10 min；检测波长：630 nm；靶菌终浓度：1.5 × 10⁶ CFU mL⁻¹；混合比例：1:1
2.6 代谢组学分析
#### 2.6.1 用于代谢组学分析的 CFS 制备
为进行代谢组学分析，P. granadensis F35X 与 S. epidermidis ATCC 12228 的单一和混合培养物均在 M9 肉汤中制备。所有培养物于 37 °C、好氧条件下、200 rpm 振荡培养 48 小时。培养结束后，各培养物以 5,000 ×g 离心 10 分钟沉淀菌体，所得上清液经 0.22 μm 膜过滤器过滤以去除残留细胞和碎片。这些澄清的 CFS（仅含胞外代谢物）于 −20 °C 保存，用于后续 1H NMR 和 GC–MS 代谢组学分析。所有实验设三次重复。为监测细菌生长，在实验开始时（t0）和 48 小时后（t1）进行菌落形成单位（CFU）测定。从各培养物中取 100 μL 等份进行系列稀释……
【数据】培养基：M9 肉汤；温度：37 °C；转速：200 rpm；时间：48 h；离心：5,000 ×g、10 min；过滤：0.22 μm 膜；保存：−20 °C；取样时间点：t0、t1（48 h）；取样量：100 μL
研究结果
3.1 P. granadensis 的分离、鉴定与生物活性
在对采自意大利那不勒斯坎皮佛莱格瑞火山区域土壤样品进行筛选的过程中，分离到大量形态各异的细菌菌落，并采用改良交叉划线法测试了它们抑制 S. epidermidis 和 MRSA 生长的能力。显示抑制活性的分离株被选用于 MALDI-TOF 质谱鉴定。其中，分离株 F35X 因对 S. epidermidis 表现出最显著的抑制效果而被优先进行深入研究。MALDI-TOF 质谱的初步鉴定结果不明确——尽管返回的最接近匹配为 Pseudomonas koreensis，但得分低于可接受的可信阈值（2.0），提示可能为错误鉴定。为解决这一不确定性，采用 Sanger 技术进行了 16S rRNA 基因测序。序列生物信息学分析显示与 P. granadensis 的 16S rRNA 基因序列具有 100% 一致性。
琼脂平板上的初步抗菌研究表明，P. granadensis 抑制 S. epidermidis 的生长但对 MRSA 无效果。然而，当通过微量肉汤稀释法评估活性时发现：来自 P. granadensis 单独在 M9 培养基中生长的无细胞上清液对在 Mueller-Hinton 肉汤（最适培养基）中生长的 S. epidermidis 无活性（0% 抑制）；相反，来自 P. granadensis 与 S. epidermidis 在 M9 基本培养基中共培养的无细胞上清液在添加到 MHB 中的 S. epidermidis 培养物时表现出完全（100%）抑制。这表明抑制性化合物并非由 P. granadensis 组成型产生，而是由 S. epidermidis 的存在特异性诱导产生——尽管 M9 培养基不适合 S. epidermidis 生长，且在 t1 时混合培养物中 S. epidermidis 的 CFU 减少了约一个数量级（图1）。
【数据】16S rRNA 一致性：100%（P. granadensis）；单培养 CFS 抑制率：0%；共培养 CFS 抑制率：100%；MALDI-TOF 得分：<2.0（不可靠）；t1 时 S. epidermidis CFU 降幅：约一个数量级
3.2 CFS 的代谢组学分析
为研究 P. granadensis 对 S. epidermidis 存在的代谢响应，按照材料与方法部分的详细描述，通过 1H NMR 波谱和 GC–MS 分析了无细胞上清液和培养肉汤（M9）。下文将 P. granadensis 在 S. epidermidis 存在下的培养物称为混合培养物。因此，分析样品定义了四个类别：1-CTRL（培养基）、2-MIX、3-S. epidermidis 和 4-P. granadensis。
在共享 ppm 网格上进行波谱对齐并归一化至总波谱强度后，使用单因素方差分析（以类别为因子）对 4 × 3 个 1H NMR 波谱（四个类别各三个生物学重复）进行逐峰比较，以识别具有统计学显著差异的峰。所得图（图2A）以粉色和灰色 x 线分别标记 p 值 ≤0.001 和 ≤0.05 的峰，白色区域表示各类别间无显著差异的波谱区域。为便于视觉比较，将各类别内的重复波谱取平均，生成各类别的代表性 1H NMR 谱图。这些类别平均谱图呈现在图2B 的堆叠图中，突出显示了特征性代谢物信号，便于直接检查各条件下波谱的变异。
所有 1H NMR 波谱在碳水化合物区域（δ 4.20–3.20 ppm）呈现强烈的重叠信号。正如预期，这些信号在培养肉汤的 1H NMR 波谱中最为突出——肉汤中添加了葡萄糖作为微生物生长的主要碳源和能源。与 S. epidermidis 在 M9 培养基中生长极少相一致，3-S. epidermidis 类别的碳水化合物信号与 1-CTRL 类别非常相似。在 P. granadensis 培养物中，葡萄糖信号显著减少，其中 2-MIX 类别观察到的消耗最为强烈，表明碳消耗增强。
各类别间的其他差异出现在波谱的高场区域。该区域在 δ 1.30 ppm 处显示一个突出的双峰，可归属于乳酸的甲基。这是 P. granadensis 和混合培养物中一个可观的信号，但不存在于对照肉汤或 S. epidermidis 培养物中。同样，在 P. granadensis 和混合培养物的 1H NMR 波谱中均可观察到 δ ≈ 1.90 ppm 处的宽单峰，表明相应 CFS 中可能存在乙酸。尽管该信号的微弱痕迹也出现在培养基和 S. epidermidis 培养物的波谱中，但它仍是 P. granadensis 和混合培养物的主要特征。P. granadensis 和混合培养物波谱的 δ 4.20–4.00 ppm 区域显示与葡萄糖酸的次甲基质子相容的宽多重峰。然而，δ 3.9–3.3 ppm 之间严重的信号拥挤阻碍了明确归属。这一模糊性后来通过 GC–MS 分析得以解决，确认了葡萄糖酸的存在（图3）。
图3A 的解读与图2A 密切相关，但涉及的是 4 × 3 个 GC–MS 色谱图的比较——这些色谱图先前已归一化并对齐至萘内标信号和保留时间。与图2A 相同，粉色和灰色 x 线分别标记 ANOVA p 值 ≤0.001 和 ≤0.05 的峰，突出显示对类别间差异贡献最大的色谱区域。图3A 在图3B 所示的堆叠图中展开，呈现了通过对各类别内重复取平均获得的四个类别平均色谱图。这种表示方式最大限度地减少了重叠，便于跨类别视觉识别区分特征。
值得注意的是，2-MIX 和 4-P. granadensis 类别的色谱图均在 13.50 分钟处显示一个明显峰，对应于葡萄糖酸的 6TMS 衍生物，支持了先前基于 NMR 的假设。与 2-MIX 和 4-P. granadensis 类别相关的色谱图在约 5.00 分钟处显示一个强峰，被鉴定为乳酸（2TMS），证实了 1H NMR 的发现。如预期，CFS 中乙酸的最终存在无法被确认——由于其分子小且挥发性高（RI = 719），通常在程序化溶剂延迟窗口期间与溶剂共洗脱。在图3 的所有色谱图中，衍生化葡萄糖的重叠强信号出现在约 13.00 分钟处。另一个在所有类别中均存在的突出峰出现在 7.90 分钟处，被轻松鉴定为磷酸盐（3TMS）。事实上，培养肉汤用磷酸二氢钾缓冲至最终 pH ≈7。
图2 和图3 综合来看，可以得出结论：P. granadensis 在暴露于 S. epidermidis 时发生了显著的代谢变化。为进一步支持和强调这一结论，分别收集在 NMR Matrix 和 TIC Matrix 中的 1H NMR 和 GC–MS 数据集被提交至主成分分析（PCA）——该方法通过将大量变量缩减为少数几个主成分，非常适合评估和可视化四个实验类别间的整体代谢变异。如图4A 的得分图所示，1H NMR 数据的主成分分析将观测值聚类为四个不同的组，每组对应一个定义的类别。由于 PCA 是一种无监督聚类技术，它提供了各类别内观测值的无偏且自然的归组，确认了不同类别间的代谢物谱存在差异。
前两个主成分捕获了总变异性的 74% 以上，表明数据集高度代表了类别间的代谢变异。各类别内的重复紧密聚集，且完全位于 95% 置信水平椭圆内，表明生物学重复性和分析重复性极佳。
【数据】ANOVA 显著性阈值：p ≤ 0.001、p ≤ 0.05；乳酸信号：δ 1.30 ppm（双峰）；乙酸信号：δ ≈ 1.90 ppm（宽单峰）；葡萄糖酸 GC–MS 峰：13.50 min（6TMS 衍生物）；乳酸 GC–MS 峰：~5.00 min（2TMS）；磷酸盐峰：7.90 min（3TMS）；乙酸 RI：719；葡萄糖峰：~13.00 min；PCA 前两主成分捕获变异：>74%；pH ≈ 7
讨论与解读
在筛选土壤生物活性微生物的过程中，我们从意大利那不勒斯坎皮佛莱格瑞火山区域的热液土壤中分离并鉴定了一株 P. granadensis。该火山口区域拥有动态且化学异质的生态系统——微生物经常经历温度波动、营养可利用性变化以及富含金属基质的暴露。这些环境压力已知会选择具有增强代谢灵活性和竞争策略的微生物谱系。本研究中 P. granadensis 在与 S. epidermidis 共培养期间观察到的代谢重编程可能反映了其原生栖息地塑造的适应性特征，与假单胞菌属生态适应性广受记录的特性一致。本研究中，S. epidermidis 扮演了生态竞争者的角色，触发了 P. granadensis 的防御性代谢响应。
【编译者解读】这项研究的巧妙之处在于发现了"条件性抗菌"现象——抗菌代谢物并非组成型产生，而是由竞争者存在特异性诱导。从合成生物学应用角度看，这一机制提示了挖掘微生物天然产物的新策略：在筛选抗菌活性菌株时，单一培养可能遗漏大量依赖种间互作才激活的隐性代谢途径。双平台代谢组学（NMR + GC–MS）的联用有效互补了各自的分析盲区。不过，研究尚未鉴定出具体的抗菌活性分子，这可能是后续天然产物化学研究的重要方向。
参考来源
Salvatore, M. M. 1H NMR- and GC–MS-based metabolomics reveal the metabolic response of Pseudomonas granadensis to the presence of Staphylococcus epidermidis. Bioorganic Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.110418
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.110418