来源：Enhancing the essential oil yield from rosemary leaves by solid-state fermentation: process optimization and preliminary investigation of the release mechanism（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
迷迭香精油（REO）广泛用于食品、日化与医药领域，但传统提取方式产率偏低。本研究构建黑曲霉、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酿酒酵母组成的四菌固态发酵体系，结合响应面法优化工艺条件，使精油产率较对照组提升58%。GC–MS分析显示发酵前后精油主要成分均为萜烯类及其衍生物。研究从关键酶活、纤维素组分含量及微观结构变化三个层面初步揭示了固态发酵促进精油释放的机制，为发酵型迷迭香精油在食品领域的应用提供了化学与理论基础。
研究背景
迷迭香（Salvia rosmarinus Spenn.）为唇形科多年生芳香药用植物，原产于地中海地区，20世纪80年代引入中国后，现已在云南、贵州、四川、广西、湖南、海南等地规模化种植。迷迭香精油富含含氧单萜、单萜烃、倍半萜烃及芳香族化合物等活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗伤害感受及肝保护等多种生物学活性，已成为全球香精、化妆品、制药和食品工业的重要商业产品，市场需求持续增长。然而传统方法提取REO产率偏低，开发高效、环保且可工业化的提取前处理策略具有现实紧迫性。固态发酵（SSF）利用微生物在低水分条件下分解植物细胞壁结构，被认为是一种有前景的绿色前处理手段。
研究方法
2.1 迷迭香精油提取
新鲜迷迭香叶片采自中国河南省洛阳市。叶片置于40°C烘箱中风干至恒重，粉碎后过40目筛。黑曲霉（CGMCC3.15663）、枯草芽孢杆菌（CGMCC1.821）、干酪乳杆菌（CGMCC1.8727）和酿酒酵母（CGMCC2.3973）均购自中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。黑曲霉在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）培养基中28°C培养至少48 h；枯草芽孢杆菌在LB培养基中37°C培养12–18 h；干酪乳杆菌在MRS培养基中37°C培养12–18 h；酿酒酵母在YPD培养基中28°C培养12–18 h。四种菌同时接种。采用配备单向阀的塑料发酵袋（20 cm × 30 cm）。本研究使用水蒸气蒸馏法提取精油：取50 g干燥发酵或未发酵迷迭香叶片粉末，加入1000 mL圆底烧瓶中，水蒸气蒸馏4 h，自然冷却至室温，用正己烷冲洗玻璃壁上残留的精油。油水分离后用无水硫酸钠脱水，正己烷在通风橱中挥发12 h，得到无水精油。提取率（%）按Benabed等（2025）的公式计算：Y = m₁/m₂ × 100，其中Y为精油得率（%），m₁为精油质量（g），m₂为迷迭香叶片质量（g）。
【数据】干燥温度：40°C；筛网：40目；黑曲霉培养：PDB培养基、28°C、≥48 h；枯草芽孢杆菌：LB培养基、37°C、12–18 h；干酪乳杆菌：MRS培养基、37°C、12–18 h；酿酒酵母：YPD培养基、28°C、12–18 h；发酵袋规格：20 cm × 30 cm；蒸馏投料量：50 g；蒸馏时间：4 h；正己烷挥发时间：12 h
2.2 迷迭香精油发酵条件优化
2.2.1 发酵微生物菌株组合的确定
将四种微生物菌株及其等比例混合接种物进行发酵，固液比为1:1，然后按照2.1节方法从迷迭香叶片中提取精油，筛选最佳发酵菌株组合用于后续实验。
【数据】固液比：1:1；接种方式：等比例混合
2.2.2 单因素实验设计
参照Adnan等（2017）的方法并稍作修改，考察不同参数对REO产率的影响。分别考察初始微生物浓度（1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸和1×10⁹ CFU/mL）、pH（4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，用0.1 mol/L氢氧化钠和盐酸溶液调节）、发酵时间（3、5、7、9和11天）和发酵温度（27、30、33、36和39°C）对REO产率的影响，每次只改变一个变量。
【数据】微生物浓度梯度：1×10⁷–1×10⁹ CFU/mL；pH梯度：4.0–8.0（0.1 mol/L NaOH/HCl调节）；发酵时间梯度：3–11天；发酵温度梯度：27–39°C
2.2.3 响应面法优化发酵条件
在单因素实验基础上，根据Li, Wei等（2024）和Li, Zhang等（2024）的方法，使用Design Expert 13软件通过RSM优化工艺变量。采用三因素三水平Box-Behnken设计，确定发酵时间（A）、发酵温度（B）和发酵pH（C）为影响发酵结果的三个重要因素。变量及水平详见表S1。共进行17次实验以拟合二阶多项式模型，多项式方程形式如下：Y = α₀ + α₁A + α₂B + α₃C + α₁₁A² + α₂₂B² + α₃₃C² + α₁₂AB + α₁₃AC + α₂₃BC，其中Y为预测响应值（REO产率），α₀为截距，α₁、α₂、α₃为线性系数，α₁₁、α₂₂、α₃₃为平方系数，α₁₂、α₁₃、α₂₃为交互系数，A、B、C为自变量。
【数据】Box-Behnken设计：三因素三水平；实验次数：17次
2.3 GC–MS化学成分分析
REO的定性分析采用气相色谱–质谱联用仪（Nexis GC-2030 coupled with GCMS-TQ8040 NX，日本岛津），参照Formica等（2024）所述方法并稍作修改。样品干燥后，用正己烷按50:1比例稀释，经0.22 μm有机滤膜过滤后转移至棕色进样瓶。色谱柱为SH-I-5Sil MS（30.0 m × 250 μm，0.25 μm）。起始温度50°C保持2 min，以4°C/min升至150°C保持2 min，再以10°C/min升至250°C保持5 min。气化室温度280°C，传输线温度300°C。氦气为流动相，流速0.96 mL/min。进样量1.0 μL，分流比100:1。EI离子源温度恒定为200°C，四极杆温度150°C。质谱采集时间35 min，溶剂延迟3 min，扫描范围35–550 m/z，电离能量70.0 eV。采用面积归一化法计算相对含量，公式为：Cᵢ = Aᵢ/(A₁ + A₂ + … + Aᵢ + … + Aₙ) × 100，其中Cᵢ为某鉴定组分的相对含量（%），Aᵢ为该组分对应的峰面积，n为鉴定组分总数。化合物鉴定通过将获得的质谱与NIST 23质谱数据库比对完成。各组分保留指数（RI）使用正构烷烃（C9–C33）按下式计算：RI = 100n + 100(tR_X − tR_n)/(tR_(n+1) − tR_n)，其中tR为保留时间，X为待分析化合物，n和n+1为待分析物峰前后两种正构烷烃的碳原子数，即tR(n) < tR(x) < tR(n+1)。
【数据】稀释比例：正己烷50:1；滤膜：0.22 μm；色谱柱：SH-I-5Sil MS（30.0 m × 250 μm，0.25 μm）；升温程序：50°C保持2 min→4°C/min升至150°C保持2 min→10°C/min升至250°C保持5 min；气化室：280°C；传输线：300°C；流速：0.96 mL/min；进样量：1.0 μL；分流比：100:1；离子源：200°C；四极杆：150°C；扫描范围：35–550 m/z；电离能量：70.0 eV；溶剂延迟：3 min
2.4 发酵迷迭香酶学实验
2.4.1 发酵迷迭香叶片粗酶液提取
使用乙酸-乙酸钠缓冲液（0.05 mol/L，pH 4.0）、磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.0）和硼酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 10.0）提取9种不同酶。发酵迷迭香叶粉末与缓冲液按1:10（W/V）比例混合，置于恒温摇床中180 r/min、30°C提取1 h。随后提取液在4°C、11,180g条件下离心20 min，上清液即为粗酶液，于−20°C保存备用。
【数据】缓冲液：乙酸-乙酸钠（0.05 mol/L，pH 4.0）、磷酸盐（0.2 mol/L，pH 7.0）、硼酸（0.05 mol/L，pH 10.0）；料液比：1:10（W/V）；转速：180 r/min；提取温度：30°C；提取时间：1 h；离心：4°C、11,180g、20 min；保存：−20°C
2.4.2 纤维素酶活性测定
参照Agarwal等（2002）的方法，以Avicel和木质纤维素为底物测定纤维素酶活性。首先将1 mL缓冲液（pH 7.0）与1 mL稀释粗酶液混合，在50°C恒温水浴中孵育1 h，然后室温下7155g离心5 min。最后向上清液中加入2 mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS），沸水浴5 min，用多功能酶标仪（Infinite E Plex，Tecan，瑞士）在540 nm处测定吸光度。
【数据】底物：Avicel和木质纤维素；缓冲液pH：7.0；孵育：50°C、1 h；离心：室温、7155g、5 min；DNS用量：2 mL；沸水浴：5 min；检测波长：540 nm
2.4.3 木聚糖酶活性测定
参照Wang等（2019）的方法测定木聚糖酶活性。首先用缓冲液（pH 7.0）稀释粗酶液，与1%木聚糖混合，混合反应液在50°C孵育30 min，立即加入DNS试剂终止反应。随后将所有反应样品煮沸10 min，最后在540 nm处测定吸光度值。
【数据】底物：1%木聚糖；缓冲液pH：7.0；反应温度：50°C；反应时间：30 min；煮沸：10 min；检测波长：540 nm
2.4.4 β-半乳糖苷酶活性测定
参照Kishore和Kayastha（2012）的方法并稍作修改测定β-半乳糖苷酶活性。首先将300 μL粗酶液与300 μL 2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（原文截断，后续操作参数原文未详述）。
【数据】粗酶液用量：300 μL；底物：2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（后续参数原文未详述）
研究结果
3.1 发酵微生物菌株组合的确定
本研究选取黑曲霉、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母对迷迭香叶片进行前处理。这些菌株的功能特性在文献中有充分记载。黑曲霉以丰富的酶系统著称，尤其能胞外分泌纤维素酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶、木聚糖酶、果胶酶和葡糖淀粉酶等，在生物质降解、食品加工和饲料添加剂领域有广泛应用。枯草芽孢杆菌可产生β-葡萄糖苷酶、果胶酶、纤维素酶、酯酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种水解酶，能有效降解植物细胞壁中的多糖、蛋白质和脂质等复杂生物大分子，促进细胞内容物释放，从而提高次生代谢产物和多肽等天然产物的溶出与可及性。干酪乳杆菌能够发酵碳水化合物并产生乳酸、乙酸和丙酸，同时可分泌纤维素酶和果胶酶等酶类，破坏植物细胞壁结构并释放内部活性成分，且具有显著的抗氧化和抗菌活性。酿酒酵母以高蛋白质含量（可达干重的50%）著称，能显著提升发酵底物的营养价值，可产生酯酶、脂肪酶和醇酶等。
图1显示了黑曲霉、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母及其组合对迷迭香叶片精油产率的影响。所有发酵组的REO产率均高于未发酵对照组。枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、干酪乳杆菌和黑曲霉分别使REO产率提高了13.04 ± 1.39%、19.57 ± 4.12%、26.09 ± 3.78%和41.30 ± 4.24%。四菌联合组（黑曲霉、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母）获得了最高的REO含量，较对照组提高50 ± 4.51%，因此选择这四种微生物的组合进行后续实验。
【数据】单菌提升率：枯草芽孢杆菌13.04 ± 1.39%；酿酒酵母19.57 ± 4.12%；干酪乳杆菌26.09 ± 3.78%；黑曲霉41.30 ± 4.24%；四菌联合提升率：50 ± 4.51%
3.2 单因素实验
3.2.1 微生物浓度对REO产率的影响
如图2A所示，随着微生物浓度的增加，REO产率呈先升后降的趋势，在浓度为1×10⁸ CFU/mL时达到最大值，较对照组提高30.87 ± 3.28%。这主要归因于迷迭香底物与微生物生长代谢之间的动态平衡。发酵初期营养充足、环境适宜，菌株快速增殖，浓度升高，分泌更多酶系统以分解细胞壁。然而，微生物浓度过高会加剧营养竞争，导致底物不足，降低精油产量。
【数据】最佳微生物浓度：1×10⁸ CFU/mL；提升率：30.87 ± 3.28%（vs 对照）
3.2.2 pH对REO产率的影响
如图2B所示，pH从4.0升至8.0的过程中，REO产率先增后减，在pH 6.0时达到最大值，较对照组提高41.30 ± 2.29%。低pH酸性环境可抑制大多数微生物的生长，而过高的pH碱性环境可能破坏酶的空间构象，导致关键酶活性降低甚至失活，从而改变挥发物的释放。
【数据】最佳pH：6.0；提升率：41.30 ± 2.29%（vs 对照）
3.2.3 发酵时间对REO产率的影响
如图2C所示，REO总产率在3至9天期间持续上升，第11天略有下降。第3、5、7、9和11天分别较对照组提高19.57 ± 3.59%、26.09 ± 4.43%、30.43 ± 4.58%、41.30 ± 4.95%和39.13 ± 4.50%，第9天达到峰值。发酵初期微生物活动逐渐增强，不断分解原料中的多糖、酯类等大分子物质，转化并释放精油组分。当发酵周期超过最佳周期后，原料中可利用底物逐渐耗尽，微生物活性下降。
【数据】最佳发酵时间：9天；各时间点提升率：第3天19.57 ± 3.59%、第5天26.09 ± 4.43%、第7天30.43 ± 4.58%、第9天41.30 ± 4.95%、第11天39.13 ± 4.50%
3.2.4 发酵温度对REO产率的影响
如图2D所示，随着发酵温度升高，REO总产率先升后降，在33°C时达到峰值，较对照组提高40 ± 5.60%。在适宜温度范围内，温度升高会增强微生物体内酶的活性，加速代谢速率，促进原料细胞壁分解，优化发酵体系的传质效率，使精油更易释放。当温度超过最佳阈值时，过高温度会破坏微生物体内酶的空间结构，导致酶失活，抑制微生物的正常生长和繁殖。
【数据】最佳发酵温度：33°C；提升率：40 ± 5.60%（vs 对照）
3.3 响应面法优化实验
3.3.1 响应面设计与结果
响应面法作为一种统计与数学工具，已被广泛用于研究生物分子提取参数对响应变量的影响并同时优化工艺条件。设计矩阵及对应结果见表S2，响应面试样的方差分析结果见表S3。拟合模型的F值为81.4，P值<0.0001，表明回归模型高度显著，对预测精油产率（Y）与各因素变量之间的关系具有统计学意义。响应面模型的相关系数R²为0.9905，表明拟合模型不存在显著欠拟合现象。校正决定系数Adj R²为0.9784，高于0.9且接近R²，表明模型显著性高，模型中的大部分数据与预测数据高度相关。拟合模型的失拟项P值大于0.05，表明该模型能准确预测精油产率。精密度（Adeq Precision）为24.4055（>4），表明模型具有良好的信噪比。拟合模型的变异系数（CV）为2.94，表明模型可靠且精确。根据响应面试验方差分析表，各因素对REO产率的影响顺序为：发酵温度（B）> 发酵时间（A）> 发酵pH（C）。通过Design-Expert分析获得以REO产率为目标的二次回归模型方程：Y = 0.7920 + 0.025A − 0.0275B + 0.0025C + 0.0025AB + 0.0075AC + 0.0225BC − 0.1073A² − 0.1073B² − 0.1573C²。
【数据】模型F值：81.4；P值：<0.0001；R²：0.9905；Adj R²：0.9784；失拟项P值：>0.05；Adeq Precision：24.4055；CV：2.94；因素影响排序：B（温度）> A（时间）> C（pH）
3.3.2 影响因素间交互作用分析
二维等高线图和三维响应面图（图3A–C）直观展示了因素交互对REO产率的影响。响应面曲线的斜率与等高线椭圆的偏心率正相关，两者均可作为交互效应强度的定量指标。B与C之间的交互作用对REO产率有显著影响（P < 0.05），而A与B之间的协同效应（原文截断，后续内容原文未详述）。
【数据】BC交互：P < 0.05（显著）；AB交互：原文未详述
3.4 发酵过程中酶活变化与精油释放机制
图4显示了发酵迷迭香叶片酶活性的变化。固态发酵过程中，微生物分泌的多种水解酶协同作用于植物细胞壁组分，破坏其结构完整性，为游离单萜的释放创造了有利条件。
图5显示了发酵迷迭香叶片的粗纤维素含量变化。经不同菌株发酵后，粗纤维素含量较未发酵对照组显著降低，表明微生物发酵有效降解了纤维素类细胞壁结构物质。
【数据】粗纤维素含量变化：原文未详述（图5展示具体数值）
图6为扫描电子显微镜（SEM）观察的迷迭香叶片发酵前（A）和发酵后（B）的微观结构。图中每个小分格代表10 μm，10个分格对应总长100 μm。SEM图像显示，发酵后迷迭香叶片的内部结构受到深度破坏，细胞壁完整性明显丧失，这种结构损伤有利于精油成分的释放。
【数据】SEM标尺：每小格10 μm，10格共100 μm
3.5 GC–MS成分分析
GC–MS分析结果表明，发酵后REO的主要成分为萜烯类及其衍生物，与未发酵对照组的主要成分一致，主要包括桉叶油醇、龙脑、α-松油醇、α-蒎烯、D-樟脑和香叶醇等。
【数据】主要成分：桉叶油醇、龙脑、α-松油醇、α-蒎烯、D-樟脑、香叶醇
讨论与解读
本研究证实，采用黑曲霉、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母组成的四菌固态发酵体系对迷迭香原料进行前处理，可显著提高迷迭香精油的提取产率。经RSM优化后，REO产率较对照组提高58%。GC–MS分析表明，发酵过程的主要成分与未发酵迷迭香精油相似，均为桉叶油醇、龙脑、α-松油醇、α-蒎烯、D-樟脑和香叶醇等萜烯类化合物。四种微生物通过分泌不同的水解酶协同作用，破坏细胞壁结构，降低粗纤维素、半纤维素和木质素含量，深度损伤迷迭香叶片的内部结构，最终促进精油释放。后续研究将聚焦于固态发酵迷迭香精油的生物活性及其在食品保鲜中的实际应用。
编译者解读：该研究以"菌株组合筛选—单因素考察—响应面优化—机制初探"为主线，逻辑完整，数据链清晰。四菌联合发酵使REO产率提升58%，效果优于任何单一菌株，体现了微生物间酶系互补的协同优势。从合成生物学视角看，若能在菌株层面引入定向改造的工程菌株——如过表达特定细胞壁降解酶的底盘菌——有望进一步缩短发酵周期并提高精油回收效率。此外，该策略不仅适用于迷迭香，对其他挥发油含量低、细胞壁致密的芳香植物可能具有普适性。但当前机制研究仍停留在酶活与结构表征层面，对关键酶的种类鉴定和定量贡献尚缺乏深入解析，值得后续探索。
参考来源
Wang, W. (2026). Enhancing the essential oil yield from rosemary leaves by solid-state fermentation: process optimization and preliminary investigation of the release mechanism. Food Chemistry. DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.150467
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.150467