来源：Computationally assisted combinatorial rational design of xylanase with improved thermostability and catalytic performance for lignocellulosic biomass hydrolysis（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素生物质因结构复杂而利用率低，高耐热、高活性的木聚糖酶是破解这一瓶颈的关键。本研究以黑曲霉来源GH11木聚糖酶XynB为模型，在毕赤酵母GS115中整合信号肽优化、二硫键工程、ΔΔG指导的多位点突变、发酵放大及生物质应用评估，获得工程变体9K-XynB2。该变体在60℃下半衰期延长约11倍，催化效率提升7.7倍，5-L发酵产酶活力达约8.2×10³ U/mL，与商业纤维素酶联用时协同指数最高达1.95。
研究背景
木质纤维素生物质是自然界最丰富的可再生碳资源之一，但纤维素、半纤维素与木质素交联形成的致密基质严重阻碍其高效解构与增值利用。随着生物炼制向更绿色、更高效的方向发展，酶水解已成为提升生物质利用率的关键策略。木聚糖酶作为重要的辅助酶，通过切割半纤维素木聚糖主链中的β-1,4-糖苷键，改善底物可及性并增强多酶体系的协同糖化能力。依据CAZy数据库，木聚糖酶主要归属于GH10和GH11家族。GH11木聚糖酶具有相对保守的催化支架，有利于阐明结构元件与酶稳定性之间的关系，适合作为基于结构的理性改造靶标。在真菌木聚糖酶中，黑曲霉来源的酶因分泌表达潜力大、催化活性高且与酵母表达系统兼容性好而被选为改造对象。热稳定性是制约木聚糖酶实际应用的关键属性——高温水解不仅可降低底物黏度、提高传质效率，还能减少微生物污染风险，因此提升热稳定性一直是木聚糖酶工程的核心目标。
研究方法
2.1 材料
大肠杆菌Top10（Takara，中国大连）用于质粒构建与扩增；实验室保藏的毕赤酵母GS115作为XynB表达宿主。pPIC9K（用于木聚糖酶表达）与pPICZA（用于分子伴侣表达）购自Takara。2×Phanta Max Master Mix与ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit购自Vazyme Biotech（中国南京）；限制性内切酶与核酸提取/纯化试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司（中国北京）。木质纤维素生物质由连云港苏瑞秸秆加工厂提供。除非另有说明，其他分析级化学品购自Sangon Biotech（中国上海）或Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。大肠杆菌Top10在LB或添加Zeocin、卡那霉素或氨苄青霉素（各50 μg/mL）的LB培养基中培养。毕赤酵母GS115在BMD、YPD、YPD-G418（2000 μg/mL）、YPD-Zeo（100 μg/mL）、BMGY、BMMY或BSM培养基中培养（均购自Sangon Biotech）。
【数据】抗生素浓度：Zeocin/卡那霉素/氨苄青霉素各50 μg/mL；G418：2000 μg/mL；Zeocin（YPD-Zeo）：100 μg/mL
2.2 质粒与菌株构建
编码野生型木聚糖酶（XP_001388522.1）的基因xynB从黑曲霉中扩增，通过同源重组插入pPIC9K载体，获得重组质粒pPIC9K-xynB。重组质粒经SalI线性化后电转化至毕赤酵母GS115，转化子在MD平板上筛选。3天后，将单菌落划线至YPD-G418平板（2000 μg/mL）。30℃培养2天后，通过PCR确认重组菌株（命名为9K-XynB），对应酶称为野生型XynB。为评估XynB的N-糖基化状态，酶经PNGase F处理后用SDS-PAGE分析。分别使用NetNGlyc 1.0与NetOGlyc 4.0预测 putative N-和O-糖基化位点（默认设置；分值阈值0.5）。PNGase F处理前后表观分子量的迁移差异用于估算N-去糖基化程度。
【数据】线性化酶：SalI；筛选平板：MD、YPD-G418（2000 μg/mL）；培养温度：30℃；培养时间：2天；糖基化预测阈值：0.5
2.3 信号肽优化重组菌株的构建
信号肽是蛋白质分泌所必需的N端短氨基酸序列。为评估酿酒酵母α-交配因子（α-MF）分泌信号与毕赤酵母内源信号肽对XynB分泌的影响，选取3个内源信号肽、3个α-MF衍生信号肽及1个杂合信号肽进行优化。这些信号肽的编码序列由General Biol Co., Ltd.（中国安徽）合成，克隆至pPIC9K-xynB的BamHI和EcoRI限制性位点，使信号肽与xynB编码序列保持同一开放阅读框。携带优化信号肽的重组菌株以与亲本菌株9K-XynB相同的方式通过电转化构建。
【数据】克隆位点：BamHI/EcoRI；信号肽数量：7种（3内源+3α-MF衍生+1杂合）
2.4 二硫键突变重组菌株的构建
以PDB 8B8E为模板构建XynB同源模型。使用DBD2和Discovery Studio 2.0预测二硫键位点；候选残基对通过B因子总和（>30）筛选，并检查结构可行性。共选择8对残基替换为半胱氨酸。以信号肽优化步骤所得xynB表达质粒为模板，通过重叠延伸PCR和同源重组构建二硫键突变质粒，在大肠杆菌Top10中扩增后电转化至毕赤酵母GS115。评估突变体的催化活性与热稳定性。二硫键形成通过基于DTNB的自由巯基定量进行评估。在非还原条件下及经50 mM TCEP预还原后测定412 nm吸光度；扣除空白后，巯基差值用于估算可还原的二硫键数量。
【数据】建模模板：PDB 8B8E；B因子筛选阈值：>30；TCEP浓度：50 mM；检测波长：412 nm
2.5 基于ΔΔG的氨基酸替换设计、菌株构建与分子动力学模拟
使用FireProt设计XynB的稳定化突变。排除催化残基与底物结合残基后，其余位置通过基于FoldX的饱和突变扫描；单突变体按Rosetta预测的ΔΔG排序。选择ΔΔG < 0的位点并迭代组合。突变通过含突变特异性引物的PCR引入，突变体按2.2节所述方法表达。分子动力学（MD）模拟：使用GROMACS对野生型XynB（9K-XynB）与工程变体9K-XynB2进行100 ns全原子显式水MD模拟。每个蛋白质置于周期性模拟盒中，以与所选力场一致的水模型溶剂化，添加抗衡离子中和系统。能量最小化后，系统在NVT与NPT系综下平衡，随后进行100 ns生产运行。轨迹使用GROMACS内置工具分析。整体构象漂移以RMSD评估，残基级柔韧性以逐残基RMSF评估，分子内氢键以蛋白质-蛋白质氢键数评估。除非另有说明，氢键分析使用GROMACS默认几何标准。每条轨迹的最后50 ns（50-100 ns）作为平台窗口计算均值与标准差。
【数据】MD模拟时长：100 ns；分析窗口：50-100 ns；ΔΔG筛选标准：<0
2.6 分子伴侣共表达重组菌株的构建
为增强早期分泌途径并减轻宿主负担，分别将3个分子伴侣与木聚糖酶共表达。HAC1（XM_002489994.1，996 bp）、CPR5（XM_002489874.1，669 bp）与PDI1（XM_002489761.1，1110 bp）的编码序列从NCBI获取，以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板PCR扩增。pPICZA载体经NotI和EcoRI酶切，伴侣片段通过同源重组组装生成pPICZA-HAC1、pPICZA-CPR5与pPICZA-PDI1。质粒按2.2节方法电转化至选定突变菌株，Zeocin抗性克隆作为共表达菌株筛选。
【数据】HAC1：996 bp；CPR5：669 bp；PDI1：1110 bp；酶切位点：NotI/EcoRI
2.7 摇瓶培养与补料分批发酵
XynB的摇瓶表达参照Dou等（2025）的方法进行。重组毕赤酵母在YPD中培养（30℃，12 h），转接至BMGY（2 mL接种至1-L瓶中300 mL培养基，48 h），然后转至BMMY（100 mL）并以甲醇诱导（每24 h添加1% v/v，持续168 h）。上清液通过SDS-PAGE与木聚糖酶活性测定分析。补料分批发酵参照Song等（2025）的方法，在含2 L BSM的5-L生物反应器中进行，接种200 mL BMGY种子培养物。甘油批次阶段在30℃、pH 5.0、400 rpm、1.0 vvm、DO > 30%条件下运行；18-24 h后，甘油耗尽（DO尖峰）触发补料，流加50%（w/v）甘油加PTM1（12 mL/L）。温度降至28℃，以0.5%（v/v）甲醇脉冲启动诱导，30 min后以0.1 mL/min连续流加100%甲醇+PTM1。5-L补料分批发酵的甲醇诱导阶段持续168 h。每24 h取样测定XynB活性、上清蛋白与干细胞重。5-L补料分批发酵主要用于评估工程菌株在已报道补料方案下的放大可行性与生产性能。体积产率（Qp）按Qp = P/t计算，表观比产率（qp）按qp = 1000P/(X×t)计算，其中P为...
【数据】摇瓶：YPD 30℃ 12 h→BMGY 48 h→BMMY 100 mL；甲醇诱导：1% v/v每24 h，168 h；5-L发酵：2 L BSM，30℃（甘油批次）/28℃（诱导），pH 5.0，400 rpm，1.0 vvm，DO>30%；甘油补料：50% w/v+PTM1 12 mL/L；甲醇流加：0.1 mL/min；诱导时间：168 h
研究结果
3.1 XynB在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定
在黑曲霉天然宿主中，XynB分泌量低（<0.4 U/mL），限制了后续表征与应用。为提高产量，构建pPIC9K-xynB并在毕赤酵母GS115中表达，获得菌株9K-XynB。如电子补充材料所示，培养上清的SDS-PAGE显示约22-25 kDa处有两条主要条带，提示存在异质性翻译后修饰（不同糖型）。NetNGlyc 1.0未预测到可靠的N-糖基化位点（分值<0.5），而NetOGlyc 4.0提示多个N端Ser/Thr残基具有较高的O-糖基化倾向；与此一致，变性条件下PNGase F处理未引起迁移率变化，表明该异质性并非由N-连接糖基化导致。蛋白质身份通过切取条带进行胶内胰蛋白酶消化与LC-MS/MS确认。如电子补充材料所示，最高匹配为黑曲霉内切-1,4-β-木聚糖酶（登录号Q9C1G6），序列覆盖度32.0%，确认重组蛋白为XynB。重组XynB在40℃和pH 5.0条件下显示最大活性，达346.6 ± 1.43 U/mL，与已报道的其他系统中产生的黑曲霉木聚糖酶相比具有竞争力。总体而言，毕赤酵母在弱酸性和中等温度条件下实现了活性XynB的高效分泌，但分泌水平与热稳定性仍有进一步提升空间。
【数据】野生型XynB在黑曲霉中分泌量：<0.4 U/mL；SDS-PAGE条带：约22-25 kDa；LC-MS/MS序列覆盖度：32.0%；最适温度：40℃；最适pH：5.0；最高活性：346.6 ± 1.43 U/mL
3.2 信号肽工程提升XynB分泌
在毕赤酵母中，异源蛋白的分泌效率通常受信号肽的识别、转运与加工影响。多数宿主特异性信号肽仅含前肽区（pre-region），主要介导低分子量蛋白质的分泌。常用的酿酒酵母α-因子信号肽（α-MF）包含前序列（pre-region）与前导序列（pro-region）。前导序列促进外源蛋白在内质网中的正确折叠与分泌，使多种外源蛋白得以高效分泌。前期研究表明，不同来源的α-MF信号肽与内源信号肽对毕赤酵母外源蛋白分泌效率有显著影响。为优化XynB分泌水平，本研究筛选并比较了三类信号肽：（1）来自不同酵母的α-MF信号肽（W. ci、K. la、K. ph）；（2）内源信号肽（MF4I、Dse4、HFBI）；（3）杂合信号肽FS（由FragB-0048-pre与酿酒酵母α-MF-pro串联融合组成）。所有信号肽序列均以毕赤酵母偏好密码子优化并融合至XynB阅读框。值得注意的是，含α-MF-pro的信号肽保留了Kex2（KR）切割位点以确保正确加工。通过基因替换构建了7株重组菌株：9K-W.ci-XynB、9K-K.la-XynB、9K-K.ph-XynB、9K-FS-XynB、9K-MF4I-XynB、9K-Dse4-XynB与9K-HFBI-XynB。结果表明，除杂合信号肽FS外，所有信号肽均成功介导了木聚糖酶分泌（图1）。其中，HFBI信号肽的分泌效率最高，达到原始α-因子信号肽的1.42倍。K. la与Dse4次之，分泌量分别提高1.27倍与1.24倍。W. ci与K. ph信号肽的增强效果有限，而MF4I无显著效果。酶活性测定与SDS-PAGE分析一致：9K-HFBI-XynB的活性达554.60 ± 4.99 U/mL，较对照菌株提高1.60倍，其后依次为K. la（458.21 ± 9.37 U/mL）与Dse4（405.10 ± 10.90 U/mL）。这一结果可能与信号肽对木聚糖酶这一异源蛋白的识别与兼容性差异有关。前期研究指出，α-MF信号肽在介导外源蛋白分泌方面并不总是优于内源信号肽。例如，α-MF信号肽Sα-factor、Sost1-proα、SLysozyme与内源信号肽Smsb2在甜蛋白brazzein的分泌表达中效果相当。此外，HFBI与α-MF-pre具有相似的长度与序列特征，在β-半乳糖苷酶分泌中表现出相当的效率。在β-甘露糖苷酶分泌表达研究中，HFBI的分泌率比α-MF高1.2倍。同一课题组的数据也证实了蛋白质对不同信号肽的适应性存在显著差异。与此一致，本研究中HFBI为XynB提供了最高的胞外活性。因此，后续实验选用HFBI信号肽。
【数据】HFBI分泌效率：α-因子信号肽的1.42倍；K. la：1.27倍；Dse4：1.24倍；9K-HFBI-XynB活性：554.60 ± 4.99 U/mL（对照的1.60倍）；K. la活性：458.21 ± 9.37 U/mL；Dse4活性：405.10 ± 10.90 U/mL
3.3 二硫键工程提升XynB热稳定性
二硫键是重要的结构稳定因子，可增加构象刚性，从而减少热失活过程中的构象松弛与非活性聚集。因此，二硫键工程被广泛用于提高酶的热稳定性。本研究使用SWISS-MODEL服务器（模板PDB代码：8B8E）构建XynB同源模型。如电子补充材料所示，模型分析提示XynB包含两个α-螺旋、十四个β-链及若干环/卷曲区域。β-折叠片由环与α-螺旋连接，形成两个反向平行的β-折叠层，类似右手的"手指"与"手掌"。这些折叠片向一侧弯曲形成容纳底物进行催化的活性口袋。在该口袋中，Glu103与Glu194分别被预测为催化亲核试剂与催化酸/碱。为识别潜在的二硫键工程位点，使用DBD2与Discovery Studio 2.0分析β-折叠或环/卷曲区域中的相邻残基。选择具有高柔韧性、合理几何构象与低能量的残基对。为避免多个替换导致意外二硫键形成，每轮仅引入一对半胱氨酸。以携带HFBI信号肽的质粒为平台，构建了8个突变体：N28C/N47C、T37C/F63C、A52C/T205C、N70C/Y188C、P85C/G111C、L101C/F151C、V125C/A175C与S127C/N171C。三维结构分析（图2a）展示了8个工程二硫键的位置。总体而言，这些位点远离催化口袋中心，预期不会直接影响底物结合或催化残基功能。其中，L101C/F151C、V125C/A175C与S127C/N171C位于C端拇指区域，在β-折叠片间形成二硫键，可能阻碍层间滑动。N28C/N47C位于N端柔性区域，可能限制表面环的运动。A52C/T205C跨越N端柔性区域与下游区段，可能限制整体结构域的开启与闭合运动。N70C/Y188C与P85C/G111C替换了原有柔性转角，可能进一步增强局部刚性。如图2b所示，多个成功表达的突变体保持了高酶活性。P85C/G111C的活性与9K-XynB相当，而V125C/A175C与S127C/N171C的活性分别为9K-XynB的1.84倍与1.92倍。A52C/T205C突变体的活性显著增加，达775.63 ± 9.99 U/mL——为9K-XynB的2.16倍、9K-HFBI-XynB的1.39倍。其余4个突变体中，T37C/F63C与N70C/Y188C虽成功表达但活性较低，而未检测到可检测的表达产物...
【数据】A52C/T205C活性：775.63 ± 9.99 U/mL（9K-XynB的2.16倍，9K-HFBI-XynB的1.39倍）；V125C/A175C活性：9K-XynB的1.84倍；S127C/N171C活性：9K-XynB的1.92倍；P85C/G111C活性：与9K-XynB相当
3.4 图3相关内容
【数据】原文未详述（该图对应分子动力学模拟与氨基酸替换突变体的结构映射及酶学性质分析）
3.5 图4相关内容
【数据】原文未详述（该图对应组合优化菌株9K-XynB2的高细胞密度发酵，含不同诱导时间的SDS-PAGE分析）
3.6 图5相关内容
【数据】原文未详述（该图对应XynB在不同添加量下对碱预处理木质纤维素底物的糖化及与商业纤维素酶的协同水解）
讨论与解读
本研究以黑曲霉GH11木聚糖酶XynB为模型，开发并验证了一套整合信号肽筛选、二硫键工程、ΔΔG指导的多位点突变、放大发酵与协同糖化评估的组合理性工程工作流。该策略获得工程变体9K-XynB2，同时改善了分泌水平与耐热性。9K-XynB2在大规模发酵中表现出稳健性能，并展示了在木质纤维素生物质解构中的实际应用潜力。该策略为木聚糖酶及其他糖苷水解酶的工业相关定向工程提供了一条可扩展的路径。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，这项工作的亮点在于"组合"二字——不是单一改造，而是将信号肽筛选、二硫键设计与计算辅助多点突变串联成一条完整流水线，每一环节都有明确的筛选指标与数据支撑。HFBI信号肽带来的分泌提升与A52C/T205C二硫键的热稳定贡献被有效叠加，最终在5-L发酵规模上获得8.2×10³ U/mL的活力，说明该策略具备从实验室到中试的衔接潜力。与商业纤维素酶的协同指数达1.95，也提示工程木聚糖酶在实际生物质解构中不是替代者而是增效者。局限在于，部分突变体（如T37C/F63C）表达成功但活性低下，说明计算预测与实验验证之间仍有差距——理性设计的效率虽高，但并非每一步都能命中靶心。未来若能将高通量筛选与机器学习闭环结合，或许能进一步压缩"设计-验证"周期。
参考来源
Zou Y. Computationally assisted combinatorial rational design of xylanase with improved thermostability and catalytic performance for lignocellulosic biomass hydrolysis. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134883
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134883