来源：High-performance protease biosynthesis from Aspergillus niger through rice polish valorization and RSM-based optimization（Advances in Biomarker Sciences and Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蛋白酶是工业生物催化领域应用最广的酶类之一，但其经济可持续的生产路径始终是产业化瓶颈。本研究以巴基斯坦当地农业废弃物——米糠为底物，利用黑曲霉固态发酵生产蛋白酶。研究者在六种农业废弃物中筛选出米糠作为最优底物，通过单因素实验和响应面法（RSM）系统优化发酵参数，使蛋白酶活性从基线水平的1.63 U/mL跃升至392.72 U/mL，实现了超240倍的产量提升。部分纯化后的蛋白酶在制革脱毛应用中展现出优于传统化学处理的效果，为农业废弃物高值化利用提供了可行方案。
研究背景
蛋白酶是一类催化蛋白质肽键水解的酶，是工业酶制剂中规模最大、商业价值最高的类别之一，广泛用于洗涤剂、食品加工、制革、制药及废弃物处理等领域。尽管应用广泛，蛋白酶的大规模工业化生产仍面临成本高、工艺稳定性不足和传统方法环境负担重等挑战。微生物来源的蛋白酶凭借生长快、易放大、条件可控等优势主导全球市场，其中丝状真菌因能分泌大量胞外酶、便于下游回收而备受关注。黑曲霉（Aspergillus niger）分泌能力强、遗传稳定性好、适应多种发酵体系，且被公认安全，是工业酶生产的理想宿主。固态发酵（SSF）模拟真菌天然生长环境，可利用廉价农业废弃物为底物，是降低酶生产成本的可行路径。本研究旨在以农业废弃物为底物、通过统计优化策略实现黑曲霉蛋白酶的高效生产，并评估其在皮革脱毛中的应用潜力。
研究方法
2.1 微生物与菌种保藏
本研究所用黑曲霉菌株（BAB株）分离自巴基斯坦古吉拉特大学生物化学与生物技术系保藏的真菌库。菌种按照标准真菌保藏方法接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面，4°C保存并定期传代以维持活力。制备接种物时，将菌种接种至新鲜PDA平板，30°C培养5天以确保均匀致密的产孢。用含0.01%（v/v）吐温80的无菌蒸馏水轻轻冲洗琼脂表面以收集孢子，促进孢子分散。孢子悬液经无菌纱布过滤去除菌丝碎片，血球计数板计数并调整至约1 × 10⁷孢子/mL。每次实验均新鲜制备接种物以最小化生物学变异、确保可重复性。
【数据】菌株：Aspergillus niger BAB株；培养基：PDA；温度：30°C；培养时间：5天；孢子浓度：1 × 10⁷孢子/mL；吐温80浓度：0.01%（v/v）
2.2 农业废弃物的收集与处理
小麦秸秆、玉米芯、米糠、草叶、甘蔗渣和香蕉皮等农业废弃物收集自巴基斯坦旁遮普省古杰兰瓦拉–古吉拉特地区的农田与市场。所有底物用自来水彻底清洗去除灰尘和附着土壤，日光干燥48小时后于60°C烘箱干燥12小时去除残余水分。干燥底物经机械粉碎机研磨并过筛，获得0.5–1.0 mm的均匀粒径。处理后的材料密封保存于室温备用。发酵前，底物经121°C、15 psi高压灭菌30分钟以消除微生物污染。
【数据】干燥条件：日光48h + 60°C烘箱12h；粒径范围：0.5–1.0 mm；灭菌条件：121°C、15 psi、30 min
2.3 固态发酵与底物筛选
蛋白酶生产采用固态发酵方式进行，该方式适合丝状真菌生长且能高效利用固态底物。为筛选最适合黑曲霉产蛋白酶的农业废弃物，进行了初始筛选实验。每个实验中，将5 g灭菌底物置于250 mL锥形瓶中，用基础营养液润湿，营养液成分（每100 mL）为：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.2 g、KH₂PO₄ 0.1 g、MgSO₄·7H₂O 0.05 g、CaCl₂·2H₂O 0.01 g。润湿培养基pH在灭菌前调至6.5。冷却后，每瓶接种3 mL孢子悬液（1 × 10⁷孢子/mL），轻轻混匀确保均匀分布。发酵在37°C静态条件下进行72小时。培养结束后，向每瓶加入50 mL 0.05 M柠檬酸缓冲液（pH 5.0）提取胞外酶，150 rpm振荡30分钟。浆液经Whatman No. 1滤纸过滤，4°C下10,000 rpm离心10分钟，上清液即为粗酶提取物。比较不同底物的蛋白酶活性，米糠获得最高酶活（1.63 ± 0.05 U/mL），据此选定米糠进行后续优化研究。
【数据】底物量：5 g/250 mL锥形瓶；接种量：3 mL孢子悬液；发酵条件：37°C、72h、静态；提取缓冲液：50 mL 0.05 M柠檬酸缓冲液（pH 5.0）；振荡提取：150 rpm、30 min；离心：10,000 rpm、10 min、4°C；米糠最高酶活：1.63 ± 0.05 U/mL
2.4 蛋白酶活性测定与蛋白定量
蛋白酶活性采用基于Folin–Ciocalteu法的酪蛋白水解测定法，参照标准方案略作修改。简要流程：1 mL酶提取物与4 mL 1%（w/v）酪蛋白溶液（以0.05 M柠檬酸缓冲液pH 5.0配制）混合，37°C孵育60分钟。加入5 mL 5%（w/v）三氯乙酸终止反应，10,000 rpm离心10分钟去除沉淀蛋白。上清液与0.4 M碳酸钠及Folin–Ciocalteu试剂反应，显色30分钟后于660 nm处用紫外–可见分光光度计测定吸光度。一个蛋白酶活性单位定义为在测定条件下每分钟释放1 μg酪氨酸所需的酶量。总蛋白浓度采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白为标准品。
【数据】底物：1%（w/v）酪蛋白；缓冲液：0.05 M柠檬酸缓冲液（pH 5.0）；反应条件：37°C、60 min；终止剂：5%（w/v）三氯乙酸5 mL；显色时间：30 min；检测波长：660 nm；酶活单位定义：每分钟释放1 μg酪氨酸
2.5 单因素法初步优化
采用单因素法对蛋白酶生产进行初步优化，以确定关键工艺参数。分别独立评估培养时间、温度和初始pH，其他变量保持恒定。发酵时长研究为期5天，每24小时取样。蛋白酶活性逐渐升高，72小时达最大值，之后出现下降。温度优化在25–45°C范围内进行，37°C时酶产量最高。初始pH的影响通过将润湿培养基pH调至4.0–8.0来考察，pH 6.5时获得最高蛋白酶活性。上述条件被选作后续统计优化的基线参数。
【数据】发酵时长范围：0–5天；最适发酵时间：72h；温度范围：25–45°C；最适温度：37°C；pH范围：4.0–8.0；最适pH：6.5
2.6 响应面法统计优化
采用响应面法评估关键变量对蛋白酶生产的联合效应。使用Design-Expert软件（版本13，Stat-Ease Inc.，美国）设计四因素中心复合设计。自变量包括生物量、接种量、Mg²⁺浓度和含水量，每个变量在设定实验范围内研究五个水平。共生成15组实验方案，以蛋白酶活性为响应变量。实验数据拟合二阶多项式模型，通过方差分析、决定系数（R²）和失拟检验评估模型充分性。生成响应面和等高线图以可视化变量间的交互作用。模型预测的最优条件在相同发酵条件下进行实验验证。
【数据】设计类型：四因素中心复合设计；实验组数：15组；自变量范围：生物量3–7 g、接种量1.5–3.5 mL、Mg²⁺浓度0.25–0.55 g、含水量40–60%
2.7 蛋白酶的部分纯化
优化条件下获得的粗酶液经硫酸铵沉淀进行浓缩和部分纯化。分别评价20%、40%、60%和70%的饱和度水平。沉淀蛋白经4°C、10,000 rpm离心15分钟收集，重新溶解于0.05 M柠檬酸缓冲液（pH 5.0）。酶液对同种缓冲液透析过夜以去除多余盐分。每个纯化步骤后测定蛋白酶活性和蛋白含量，相对粗酶提取物计算纯化倍数和回收率。
【数据】硫酸铵饱和度：20%、40%、60%、70%；离心：10,000 rpm、15 min、4°C；缓冲液：0.05 M柠檬酸缓冲液（pH 5.0）；透析时间：过夜
2.8 酶学性质表征
pH对酶稳定性的影响：将部分纯化的蛋白酶在pH 4.0–9.0的缓冲液中于37°C孵育60分钟后测定残余活性。热稳定性评价：将酶样品在25–50°C温度范围内预孵育60分钟，然后在标准测定条件下测定残余酶活，以初始活性的百分比表示。
【数据】pH稳定性范围：pH 4.0–9.0、37°C、60 min；热稳定性范围：25–50°C、60 min
2.9 蛋白酶在酶法脱毛中的应用
蛋白酶应用评价使用取自当地屠宰场的山羊皮进行。本研究未使用活体动物，未进行任何动物处理或实验干预，因此无需机构动物伦理批准。皮肤样品在受控实验室条件下用部分纯化酶处理，目测评估脱毛效率。处理皮革的力学性能采用标准制革检测方法评价。
【数据】原料：山羊皮；来源：当地屠宰场；处理方式：部分纯化酶液
2.10 统计分析
所有实验均进行三次重复，结果以平均值 ± 标准差表示。
【数据】重复次数：3次（三次重复）；数据表示：均值 ± 标准差
研究结果
3.1 农业废弃物底物筛选
六种农业废弃物作为黑曲霉固态发酵产蛋白酶的底物进行了评价。不同底物间的蛋白酶活性差异显著（p < 0.05），表明底物组成强烈影响酶生物合成。米糠支持的最高蛋白酶活性为1.63 ± 0.05 U/mL，其次为草叶（1.42 ± 0.06 U/mL）。玉米芯产生中等活性，而小麦秸秆的酶产量最低。香蕉皮和甘蔗渣表现出相对较低但可测得的蛋白酶产量。上述差异反映了营养可利用性和底物结构的差异。米糠始终优于其他底物——其较高的蛋白含量和均衡的营养组成有利于真菌生长和酶分泌；此外，米糠的细小粒径和多孔结构有利于固态条件下氧气的扩散。基于上述观察，米糠被选作后续优化研究的底物。表1总结了所有测试底物的性能比较，图1展示了相同发酵条件下的相对蛋白酶活性。
【数据】米糠最高酶活：1.63 ± 0.05 U/mL；草叶：1.42 ± 0.06 U/mL；统计差异：p < 0.05
3.2 单因素法优化蛋白酶生产
#### 3.2.1 培养时间的影响
在五天时间内考察了发酵时长对蛋白酶生产的影响。酶活在发酵早期阶段逐渐上升，72小时后达到最大值，记录到的最高活性为2.87 ± 0.08 U/mL，较早期时间点有明显提升。72小时后酶活出现下降，可能与长期培养过程中营养耗尽和代谢副产物积累有关。结果表明，在测试条件下3天发酵期是蛋白酶生产的最佳时长（图1-a）。
【数据】最高酶活：2.87 ± 0.08 U/mL（72h）；发酵周期：5天
#### 3.2.2 初始pH的影响
初始培养基pH显著影响蛋白酶产量。酶活从pH 4.0到pH 6.5稳步上升，在pH 6.5时观察到最大活性16.72 ± 0.11 U/mL。pH进一步升高导致酶产量逐渐下降。强酸性和强碱性条件均降低蛋白酶产量，该响应反映了黑曲霉偏好微酸性环境的特点。基于上述结果，pH 6.5被选为后续实验的最适值（图1-e）。
【数据】最适pH：6.5；最大酶活：16.72 ± 0.11 U/mL；pH范围：4.0–8.0
#### 3.2.3 温度的影响
温度对蛋白酶生物合成有显著影响。酶活随温度升高而增加，37°C时达到最大值，蛋白酶活性达18.62 ± 0.12 U/mL。超过37°C后，酶产量急剧下降。较高温度下活性降低可能与应激诱导的真菌代谢抑制及酶稳定性部分丧失有关。结果确认37°C是黑曲霉固态发酵产蛋白酶的最适温度（图1-c）。
【数据】最适温度：37°C；最大酶活：18.62 ± 0.12 U/mL；温度范围：25–45°C
3.3 响应面法统计优化
采用响应面法评估生物量、接种量、镁离子浓度和含水量对蛋白酶生产的联合效应。使用中心复合设计，实验结果拟合二次回归模型。方差分析表明模型具有统计学显著性（p < 0.0001）。决定系数（R² = 0.9873）表明预测值与实验值高度一致。失拟检验不显著，确认了模型的充分性。含水量和镁浓度对蛋白酶生产影响最强，生物量和接种量表现出中等但显著的影响。多个交互项也显著，说明酶生产受多变量联合效应而非单一因素独立支配。模型预测优化条件下最大蛋白酶活性为396.15 U/mL，实验验证值为392.72 ± 0.14 U/mL，与预测值偏差极小，证实了统计模型的可靠性（表2）。
【数据】模型显著性：p < 0.0001；R² = 0.9873；预测最大酶活：396.15 U/mL；实验验证值：392.72 ± 0.14 U/mL
3.4 部分纯化与产量分析
优化发酵条件下获得的粗酶经硫酸铵沉淀进行部分纯化。酶活和比活随饱和度增加而升高，在70%饱和度时达到最大。70%硫酸铵组分的比活最高，被选作进一步分析。该步骤使比活提高2.8倍，相对粗酶的回收率为46%。透析通过去除残余盐分进一步改善了酶稳定性（表3）。
【数据】最适硫酸铵饱和度：70%；纯化倍数：2.8倍；回收率：46%
3.5 pH和温度对酶活性及稳定性的影响
部分纯化的蛋白酶在pH 6.5时显示最适活性，在pH 5.5–7.0之间保持80%以上活性。碱性条件下活性逐渐下降，表明该酶具有中等pH敏感性。温度谱显示37°C时酶活性最大。该蛋白酶在40°C以下保持较高活性，但在更高温度下活性明显丧失。结果表明该酶为中温酶且具有中等热稳定性（图2）。
【数据】最适pH：6.5；pH 5.5–7.0范围残余活性：>80%；最适温度：37°C；活性保持上限：40°C
3.6 蛋白酶在酶法脱毛中的应用
#### 3.6.1 脱毛效率与表面形态
使用山羊皮酶法脱毛评价了蛋白酶的应用潜力。在优化条件下，90分钟内实现完全脱毛。相比之下，传统化学脱毛需要更长的处理时间。酶处理后的皮肤毛发去除干净且粒面结构保存完好。显微镜检查显示胶原纤维完整、毛囊开口清晰，表明毛相关蛋白被选择性降解（图3-c & d）。
【数据】完全脱毛时间：90 min
#### 3.6.2 处理皮革的物理性能
力学测试表明，与化学处理样品相比，酶处理皮革的拉伸强度、伸长率和粒面紧实度均有改善。收缩温度保持不变，表明对热稳定性无不良影响。扫描电镜图像（图3-a & b）显示酶处理样品中纤维排列均匀，而化学处理皮革出现纤维膨胀和部分断裂。
【数据】收缩温度：与化学处理相比无变化（原文未详述具体数值）
#### 3.6.3 工艺相关性与性能评估
酶法脱毛工艺减少了化学品用量和处理时间。废水分析表明，与传统方法相比污染物负荷更低。该蛋白酶在短期储存期间保持足够活性，支持其操作稳定性。结果表明，利用米糠生产的黑曲霉蛋白酶在受控实验室条件下功能有效，支持该酶在环境友好型皮革加工中的进一步评价。
【数据】化学品用量：较化学法减少（原文未详述具体数值）；储存稳定性：短期储存活性保持（原文未详述具体数值）
讨论与解读
固态发酵中蛋白酶产量受底物组成、物理结构和发酵参数的强烈影响。米糠之所以优于其他废弃物，在于其适中的蛋白含量和易代谢碳水化合物同时支持真菌生长和酶分泌；细小粒径和多孔结构则改善了发酵基质中的氧气传递和水分分布。小麦秸秆和甘蔗渣因高木质纤维素含量和有限的氮源可利用性导致酶产量偏低。单因素实验为工艺优化提供了清晰基线，而响应面法揭示含水量和镁离子浓度是影响产酶的最关键因素——这提示固态发酵中水分管理比传统认知更为重要。2.8倍纯化与46%回收率的组合，以及酶在中温范围内的良好稳定性，支撑了该酶在制革等场景的应用潜力。
编译者解读：本研究最亮眼之处在于将"废弃物"与"高值酶"直接挂钩——米糠这种被低估的农副产物经响应面优化后实现了超240倍的产量跃升，为固态发酵的工业化放大提供了极具说服力的成本优势论证。选择黑曲霉这一GRAS级宿主也为后续食品级应用铺平了道路。不过，从实验室规模到工业发酵罐之间仍存在传质与放大效应等不确定性，米糠的批次差异也未深入讨论。若能补充廉价碳氮源的替代实验与连续批次验证，将进一步提升该工艺的产业可信度。
参考来源
Javed HM. High-performance protease biosynthesis from Aspergillus niger through rice polish valorization and RSM-based optimization. Advances in Biomarker Sciences and Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.abst.2026.01.008
DOI: 10.1016/j.abst.2026.01.008