来源：Involvement of extracellular DNA (eDNA) in biofilm architecture and extracellular polymeric matrix stabilization in Pseudomonas putida KT2440（Biochimie）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
生物被膜是细菌附着于表面后形成的结构化群落，其胞外聚合物基质中的胞外DNA（eDNA）承担着结构支撑与调控功能。本研究以恶臭假单胞菌KT2440为对象，通过外源eDNA补充与DNase降解两种对立干预，系统考察eDNA对生物被膜结构、细胞形态、细胞骨架基因表达及EPS组成的影响。研究发现外源eDNA可使生物被膜成熟时间提前约12小时，同时抑制细胞分裂基因ftsZ和mreB的表达，促使细胞尺寸缩小、生物被膜更致密。该工作为靶向调控生物被膜提供了eDNA介导机制的新认识。
研究背景
细菌生物被膜常被描述为"微生物之城"——细菌细胞包裹在自身分泌的胞外聚合物基质中，定殖于有生命或无生命表面。生物被膜形成始于可逆附着，依靠弱的范德华力和静电力；随后通过EPS和黏附素的生产进入不可逆附着阶段。细菌通过群体感应沟通形成微菌落，随着生物被膜成熟，微菌落演化为嵌入基质中的稳定结构化群落。条件适宜时，细胞脱离生物被膜回归浮游态，进入分散阶段，定殖新表面。
在EPS的众多组分中，eDNA是一种多功能且不可或缺的元件。它在生物被膜发育各阶段均发挥关键作用——参与表面黏附、结构内聚、微菌落架构、营养循环和分散动力学。生物被膜内的eDNA来源于细胞裂解、自溶、主动分泌和膜囊泡介导的释放。eDNA的数量和片段大小受微生物种类、生物被膜发育阶段及环境条件（营养可用性、胁迫因子、物理因素）等多重因素影响。理解eDNA在生物被膜中的具体作用机制，对于医学和生物技术应用中靶向调控生物被膜具有重要意义。
研究方法
2.1 菌株与化学试剂
本研究所用恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida KT2440 菌株购自德国DSMZ微生物与细胞培养物保藏中心（保藏编号：DSM 6125）。细菌培养基为Luria-Bertani（LB）肉汤（HiMedia，印度）。eDNA提取与可视化所用试剂包括：酚溶液（以10 mM Tris HCl pH 8.0含1 mM EDTA平衡）（HiMedia，印度）、氯仿（Sigma-Aldrich，美国）、异戊醇（HiMedia，印度）、琼脂糖（HiMedia，印度）和溴化乙锭（EtBr）（HiMedia，印度）。CdCl₃（Sigma Aldrich，美国）和D₂O（Sigma Aldrich，美国）用作NMR中溶解碳水化合物和脂质的溶剂。三氯乙酸（HiMedia，印度）、甲醇（HiMedia，印度）、冰醋酸（HiMedia，印度）、(NH₄)₂SO₄（HiMedia，印度）和Tris HCl（HiMedia，印度）用于蛋白质、胞外多糖和脂质的提取。
【数据】菌株：Pseudomonas putida KT2440（DSM 6125）；培养基：LB肉汤；试剂：酚/氯仿/异戊醇、琼脂糖、EtBr、CdCl₃、D₂O、三氯乙酸等；原文未详述用量
2.2 eDNA的提取与定量
eDNA提取参照Tang等方法并略作修改。将过夜培养的恶臭假单胞菌KT2440培养物（OD600为0.6，静置条件）转移至无菌5 ml微量离心管中，室温下3500 rpm离心10 min。随后将上清液小心倒入无菌2 ml微量离心管（MCT）中备用。取500 μl上清液重悬于576 μl Tris-EDTA缓冲液中，加入10 μl 5 M NaCl和RNase A，轻轻混匀。加入1体积的24:1氯仿:异戊醇，室温下6000 rpm离心5 min。将上清液转移至新鲜MCT中，向上清液中加入等体积的25:24:1酚:氯仿:异戊醇。混合物室温下6000 rpm离心5 min，向所得上清液中加入0.6 ml预冷异丙醇。轻轻混匀形成微白色DNA沉淀。随后室温下10000 rpm离心10 min，弃上清，DNA以70%冰乙醇洗涤一次。沉淀风干后重悬于Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.5）中。
eDNA浓度与质量通过Nanodrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定260 nm处吸光度（A260）进行定量。A260/A280比值接近1.8视为高纯度eDNA。进一步通过0.8%琼脂糖凝胶电泳（溴化乙锭染色）评估eDNA完整性。每孔上样5 μl DNA样品，凝胶在70 mV下运行约90 min。DNA条带使用ChemiDoc成像系统（Bio-Rad，印度）可视化，相对条带强度使用图像分析软件（ImageJ）定量以进行比较。
【数据】离心：3500 rpm，10 min，室温；第二次离心：6000 rpm，5 min，室温；第三次离心：6000 rpm，5 min，室温；第四次离心：10000 rpm，10 min，室温；上样量：5 μl；电泳：0.8%琼脂糖凝胶，70 mV，约90 min；A260/A280比值：约1.8
2.3 eDNA在恶臭假单胞菌KT2440生存与生物被膜形成中的作用
生长动力学观察参照Rath等方法。将过夜培养的细菌培养物（OD600为0.6）按1:10稀释于含有不同处理条件[对照、eDNA补充（1 μg/ml提取自恶臭假单胞菌KT2440的eDNA）和DNase处理（1 mg/ml DNase）]的LB肉汤培养基中，于37°C持续振荡培养。使用微板分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）每2小时间隔监测OD600至24 h。使用GraphPad Prism 8绘制生长曲线。
生物被膜的定量估算通过计算特异性生物被膜形成（SBF）指数完成，参照Rath和Das方法。简要步骤如下：将20 μl过夜培养的恶臭假单胞菌KT2440培养物（OD 0.6）接种到含有180 μl处理LB肉汤的96孔板中，共设五种不同处理条件（详见表S1）。平板于37°C孵育72 h。孵育后，清洗孔并用0.2%结晶紫染色5 min，用蒸馏水洗去多余染料。随后将染色生物被膜环溶解于30%冰醋酸（GAA）中，测定560 nm处吸光度以确定SBF指数。
SBF指数 =（560 nm处染色生物被膜吸光度 − 560 nm处含未接种培养基的染色对照孔吸光度）/ 600 nm处测得的肉汤中细胞生长OD值。
【数据】稀释比例：1:10；eDNA浓度：1 μg/ml；DNase浓度：1 mg/ml；培养温度：37°C；监测间隔：2 h；监测时长：24 h；接种量：20 μl/孔；孵育：37°C，72 h；结晶紫：0.2%，5 min；GAA：30%；测定波长：560 nm和600 nm
2.4 基于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的生物被膜周期不同阶段eDNA定量
在三种不同条件[对照、eDNA（1 μg/ml提取自恶臭假单胞菌KT2440的eDNA）和DNase处理（1 mg/ml DNase）]下，于不同时间间隔（12、24、36和48 h）进行基于CLSM的生物被膜定量，以揭示生物被膜基质组成及其在聚集体形成和细菌细胞尺寸决定中的参与。CLSM分析参照Mahto等方法。将过夜培养的细菌培养物（OD600为0.6）按1:10稀释于LB肉汤培养基中，取1 ml该接种物转移至含有预灭菌玻璃片（1 cm × 1 cm）的24孔板中，随后于37°C静置培养。在不同时间间隔取出玻片，以1× PBS冲洗，并用特定荧光染料染色。为可视化基质组分，使用15 mM FITC（495 nm/519 nm）标记蛋白质，1 μg/ml DAPI（358 nm/451 nm）标记核酸。染色样品随后使用配备油浸×63物镜的共聚焦显微镜（Leica DMI8微系统，德国）观察。三维图像堆栈进行COMSTAT 2.1分析。首先，通过将图像像素尺寸与ImageJ中的物理测量值进行比较来校准图像，确定像素和体素值。使用ImageJ将z-stack图像转换为8位并保存为OME-TIFF格式。随后将堆栈阈值设为20，计算多项生物被膜特征参数，包括生物量、最大厚度、平均厚度（生物量）、粗糙系数和表面积与体积比。
【数据】eDNA浓度：1 μg/ml；DNase浓度：1 mg/ml；时间点：12、24、36、48 h；稀释比例：1:10；接种量：1 ml；FITC：15 mM（495 nm/519 nm）；DAPI：1 μg/ml（358 nm/451 nm）；物镜：×63油浸；堆栈阈值：20
2.5 eDNA在生物被膜周期不同阶段形态发生中的参与
基于相差显微镜的细胞尺寸分析参照Dey等方法，在生物被膜形成的不同阶段进行。简要步骤如下：将过夜培养的细菌培养物（OD600为0.6）按1:10稀释于LB肉汤培养基中，加入含有不同处理条件（10 μl接种物；9 μl接种物+1 μl 1 μg/ml eDNA；9.8 μl接种物+0.2 μl 1 mg/ml DNase）的LB肉汤的锥形瓶中。锥形瓶在摇床中250 rpm、37°C孵育24和36 h（浮游相）。同样，制备三块含有上述相同处理条件的LB琼脂平板，在37°C培养箱中静置24和36 h以发育生物被膜。
细菌细胞使用1%琼脂糖垫固定在腔玻片（76 mm × 26 mm × 0.95 mm）上，并以盖玻片覆盖。固定细胞在室温（RT）下5 min内使用配备100×/1.52油浸复消色差物镜和DeltaVision成像系统（GE Healthcare，美国）的倒置显微镜（IX-73，Olympus，东京，日本）成像。相差图像使用Oufti软件分析，从生物被膜菌落的不同区域获取细胞长度测量值（n ≥ 500），使用0.024 μm/像素的缩放因子。
【数据】转速：250 rpm；温度：37°C；时间：24和36 h；接种物：10 μl；eDNA：1 μl（1 μg/ml）；DNase：0.2 μl（1 mg/ml）；琼脂糖垫：1%；细胞计数：n ≥ 500；缩放因子：0.024 μm/像素
2.6 补充eDNA存在下细胞骨架基因的表达分析
与生物被膜形成相关的细胞骨架基因ftsZ和mreB的表达水平使用实时PCR检测系统（CFX96 Bio-Rad，美国）结合SYBR™ Green PCR预混液（Sigma-Aldrich，美国）进行定量，参照Rath和Das方法。从恶臭假单胞菌KT2440培养物中提取总RNA——
【数据】仪器：CF96 Bio-Rad实时PCR系统；试剂：SYBR™ Green PCR预混液；基因：ftsZ、mreB
研究结果
3.1 eDNA在维持细胞活力的同时促进生物被膜结构构建
提取eDNA的质量通过分光光度法确认，吸光度比值约为1.8，琼脂糖凝胶上可见清晰条带（图S1）。琼脂糖凝胶图像的相对条带强度分析显示，基因组DNA表现出更高的信号强度（219605 AU），而eDNA为149497 AU。基因组DNA相对强度更高表明恶臭假单胞菌KT2440中eDNA的释放主要通过受控细胞裂解实现。
添加eDNA（0.5-1 μg/ml）与对照相比，细菌生长出现非显著性降低（图S2），表明eDNA不影响生长。相反，蛋白酶K处理显著降低了细菌生长，说明蛋白质在细菌生存中发挥重要作用。
进一步，恶臭假单胞菌KT2440在不同条件（对照、eDNA补充、DNase处理和阴性对照）下的生物被膜形成时间动态显示，生物被膜形成随时间稳步增加，在36 h达到峰值。然而，补充外源eDNA加速了生物被膜发育，在24 h观察到最大生物被膜形成，表明与对照相比成熟时间提前了约12 h。此外，DNase处理在所有时间点均显示生物被膜形成减少，证实了eDNA在维持生物被膜完整性中的结构重要性（表S3）。
CLSM显微照片分析显示，生物被膜形成始于12 h，在外源eDNA存在下观察到增强的生物被膜形成，而DNase处理导致生物被膜发育减少。在24 h时，eDNA显著促进生物被膜生长，DNase导致生物被膜减少和细胞形态伸长。到36 h时，生物被膜达到成熟状态，eDNA处理条件下基质致密，而DNase处理则形成更薄的结构并伴有链状细胞形成。在48 h时，生物被膜生物量明显减少，表明分散阶段开始（图S3）。
COMSTAT分析（表1）显示，eDNA处理组在24 h时生物量最大（12.9 ± 9.4 μm³/μm²），而对照组在36 h时为8.9 ± 1.3 μm³/μm²，表明外源eDNA使恶臭假单胞菌KT2440的生物被膜成熟加速约12 h。
【数据】A260/A280比值：约1.8；基因组DNA信号强度：219605 AU；eDNA信号强度：149497 AU；eDNA添加浓度：0.5-1 μg/ml；最大生物量（eDNA组）：12.9 ± 9.4 μm³/μm²（24 h）；最大生物量（对照组）：8.9 ± 1.3 μm³/μm²（36 h）；成熟时间提前：约12 h
3.2 eDNA调节恶臭假单胞菌KT2440生物被膜基质内的细胞尺寸分布
使用Oufti软件对相差显微照片进行细胞尺寸分析，在浮游和生物被膜两种生长模式下，24 h和36 h的对照、eDNA补充和DNase处理条件下各定量约500个细胞（图1 I）。
在浮游相中，DNase处理细胞在24 h和36 h呈现伸长表型，主要被两种不同细菌亚群主导——24 h细胞长度为2.29 μm和2.78 μm，36 h为2.08 μm和2.66 μm；而外源eDNA处理则使分布偏向更短的细胞长度，两个主导亚群在24 h为1.54 μm和1.87 μm，36 h为1.57 μm和1.89 μm。
类似地，在生物被膜相中，eDNA处理样品显示细胞尺寸减小，24 h两个主导亚群细胞长度为1.702 μm和1.94 μm，36 h为0.98 μm和1.74 μm；而DNase处理样品则呈现三个亚群，分布更宽，平均长度更大——24 h为1.49 μm、2.07 μm和2.38 μm，36 h为1.82 μm、2.13 μm和2.43 μm。
然而，eDNA处理下36 h的生物被膜细胞表现出异质性尺寸分布，可能指示一个同时经历成熟和分散的混合群体。DNase条件持续表现出更长的细胞表型和更大的变异性，支持eDNA在维持紧凑的生物被膜相关细胞形态中的作用。结果表明eDNA影响生物被膜结构以及单个细胞的形态。
【数据】浮游相DNase处理亚群（24 h）：2.29 μm和2.78 μm；（36 h）：2.08 μm和2.66 μm；浮游相eDNA处理亚群（24 h）：1.54 μm和1.87 μm；（36 h）：1.57 μm和1.89 μm；生物被膜相eDNA处理亚群（24 h）：1.702 μm和1.94 μm；（36 h）：0.98 μm和1.74 μm；生物被膜相DNase处理亚群（24 h）：1.49 μm、2.07 μm和2.38 μm；（36 h）：1.82 μm、2.13 μm和2.43 μm；计数：约500个细胞/条件
3.3 eDNA调控细胞骨架基因表达影响生物被膜紧密度
在对照、eDNA补充和DNase处理条件下，24 h和36 h时观察了恶臭假单胞菌KT2440中两个关键细胞骨架基因ftsZ和mreB的相对表达水平（图1 II）。
ftsZ——细菌细胞分裂的关键基因——在eDNA存在下表达下调（24 h约0.15倍，36 h约0.31倍），表明细胞分裂受到抑制。而DNase处理在36 h导致ftsZ表达显著上调（约1.23倍），表明在没有eDNA的情况下存在细胞增殖的代偿机制。
类似地，mreB——维持杆状形态的关键基因——在eDNA处理下表达下调（24 h约0.22倍，36 h约0.39倍），而DNase处理细胞在36 h表现出显著上调（约3.32倍）。
这些发现表明eDNA负向调控细胞骨架基因，从而促进生物被膜结构和稳定性的建立。
【数据】ftsZ表达（eDNA处理）：24 h约0.15倍下调，36 h约0.31倍下调；ftsZ表达（DNase处理）：36 h约1.23倍上调；mreB表达（eDNA处理）：24 h约0.22倍下调，36 h约0.39倍下调；mreB表达（DNase处理）：36 h约3.32倍上调
3.4 eDNA影响恶臭假单胞菌KT2440生物被膜的EPS产量与组成
分析了不同条件（对照、eDNA补充和DNase处理）下恶臭假单胞菌KT2440的EPS组成（图2）。eDNA补充条件下EPS产量最高（505.3 ± 12.9 mg/l），其次是对照条件（454.7 ± 32.3 mg/l），而DNase处理导致总EPS产量显著降低（368.3 ± 10.4 mg/l；P < 0.01）。
碳水化合物含量在对照（155.3 ± 9.3 mg/g）和eDNA处理（149.8 ± 4.8 mg/g）条件下几乎相似，但在DNase处理中显著降低（145.9 ± 4.2 mg/g；P < 0.05）。然而，蛋白质含量在DNase处理样品中最高（146.1 ± 8.7 mg/g；P < 0.01），表明这是对eDNA降解的一种代偿机制。
此外，eDNA组分在eDNA补充条件下增加（21.3 ± 1.5 mg/g），在DNase处理条件下显著减少（3.7 ± 2.1 mg/g；P < 0.01），验证了处理效果。因此，外源eDNA被发现能增强EPS产生和基质复杂性，而DNase处理通过增加蛋白质水平改变组成，可能是在缺乏结构性eDNA时维持基质稳定性的代偿机制。
【数据】EPS产量（eDNA组）：505.3 ± 12.9 mg/l；EPS产量（对照组）：454.7 ± 32.3 mg/l；EPS产量（DNase组）：368.3 ± 10.4 mg/l（P < 0.01）；碳水化合物（对照）：155.3 ± 9.3 mg/g；（eDNA组）：149.8 ± 4.8 mg/g；（DNase组）：145.9 ± 4.2 mg/g（P < 0.05）；蛋白质（DNase组）：146.1 ± 8.7 mg/g（P < 0.01）；eDNA组分（eDNA组）：21.3 ± 1.5 mg/g；（DNase组）：3.7 ± 2.1 mg/g（P < 0.01）
3.5 补充eDNA存在下生物被膜蛋白质的结构重组
原始EPS（对照）的FTIR光谱透射峰揭示了多种官能团的存在。光谱中每个峰代表某个官能团键的伸缩或弯曲振动。在eDNA补充和DNase处理条件下获得的EPS的FTIR光谱显示峰型发生了改变（图3 I）。代表羟基的峰强度在DNase处理的EPS中降低，而随eDNA添加而增加。在蛋白质区域（1800 cm⁻¹至1200 cm⁻¹）观察到最大程度的弯曲和伸缩峰变化，响应于eDNA添加和DNase处理，表明生物被膜EPS中蛋白质发生了结构重组。
进一步通过分析酰胺I区的曲线拟合结果确定与EPS相关的蛋白质二级结构。不同二级蛋白质结构在酰胺I区的峰归属列于表S4。三种曲线拟合的残差数据图和统计参数已添加到补充数据文件中。不同条件（对照、eDNA补充和DNase）下蛋白质结构中α-螺旋/无规卷曲、β-折叠和β-转角的比例由峰的位置和面积确定（图3 II）。蛋白质各二级结构（α-螺旋、β-折叠、转角和无规卷曲）相对面积百分比的改变列于表2。
在对照样品（原始EPS）中，重叠峰（图谱未完整显示）——
【数据】FTIR波数范围：1800 cm⁻¹至1200 cm⁻¹（蛋白质区域）；原文未完整显示各二级结构百分比数值
讨论与解读
细菌生物被膜是包裹在自产胞外基质中的结构化群落，基质主要由EPS组成，包括多糖、蛋白质、脂质和核酸。其中eDNA已成为增强基质稳定性和内聚力的关键组分。本研究探讨了eDNA在塑造恶臭假单胞菌KT2440生物被膜结构中的多重作用。
信号强度比较显示基因组DNA信号强于提取的eDNA，表明恶臭假单胞菌KT2440中eDNA的释放通过受控细胞裂解实现——多项研究也报道了革兰氏阴性菌中细胞裂解介导的eDNA释放。本研究中eDNA补充对恶臭假单胞菌KT2440的生长动力学无显著影响，表明其在浮游模式下营养贡献极小。时间动态分析显示外源eDNA补充显著加速了生物被膜发育——eDNA补充条件下生物被膜生物量在24 h即达峰值，而对照需36 h，成熟阶段提前约12 h。这表明eDNA作为结构支架增强早期表面定殖并稳定EPS，促进从可逆附着到不可逆附着的快速转变。相反，DNase处理减少了生物被膜——eDNA的酶促降解破坏了这一结构框架。
细胞尺寸分析揭示了eDNA对形态的显著影响。eDNA补充促使形成更致密的生物被膜，细胞更小；DNase处理则产生伸长的链状细胞。基因表达数据显示eDNA下调ftsZ和mreB——这两个基因分别控制细胞分裂和杆状形态维持。DNase处理则使二者显著上调，提示缺乏eDNA时细胞通过增强分裂进行代偿。EPS组成分析中，eDNA补充使EPS产量达到最高（505.3 ± 12.9 mg/l），而DNase处理下蛋白质含量最高（146.1 ± 8.7 mg/g），表明基质在缺少eDNA时通过增加蛋白质进行结构代偿。FTIR酰胺I区分析显示β-折叠比例下降、β-转角比例上升，CD光谱部分佐证了这一构象变化。
编译者解读
该研究以"补充eDNA"与"酶解除去eDNA"的双向干预策略，清晰展示了eDNA在生物被膜中兼具结构骨架与信号调控的双重角色——既能物理交联EPS组分，又能通过下调ftsZ/mreB影响细胞分裂与形态，进而改变群落堆积密度。方法上，CLSM-COMSTAT定量与单细胞尺寸分析（n≥500）的结合为生物被膜研究提供了可复用的分析范式。值得思考的是，eDNA对细胞骨架基因的负调控是否通过直接信号传导还是间接物理胁迫实现，原文未完全阐明。从应用角度看，DNase处理导致的基质蛋白代偿性增加提示：单一靶向eDNA的酶学清除策略可能不足以彻底瓦解生物被膜，需联合蛋白酶或多糖降解酶协同作用。此外，eDNA加速成熟12小时这一发现，对生物技术中利用生物被膜加速发酵或污染物降解具有时间成本上的实际价值。
参考来源
Rath S. Involvement of extracellular DNA (eDNA) in biofilm architecture and extracellular polymeric matrix stabilization in Pseudomonas putida KT2440. Biochimie, 2026. DOI: 10.1016/j.biochi.2026.05.012
DOI: 10.1016/j.biochi.2026.05.012