来源：Rhizosphere-derived Pseudomonas putida EU-36 enhances growth and quality-related metabolite accumulation in Eucommia ulmoides leaves（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
杜仲是我国特有的木本药用与工业植物，其叶片富含绿原酸、桃叶珊瑚苷等活性成分，也是天然橡胶原料。然而，如何可持续地提升叶片生物量与品质仍是难题。本研究从杜仲根际土壤中分离出36株可培养细菌，筛选出具有促生潜力的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）EU-36。盆栽试验显示该菌株使杜仲幼苗地上部鲜重达对照的2.53倍；田间接种后，叶片绿原酸相对含量在两次采样时分别达对照的2.63倍和2.37倍。整合转录组与代谢组分析揭示了茉莉酸信号与次生代谢途径的协同响应。
研究背景
杜仲是我国特有的木本植物，兼具重要药用、工业与生态价值。其树皮、叶片、雄花与种子富含黄酮类、酚类、萜类和多糖等生物活性成分，具有抗骨质疏松、抗氧化、抗炎、降血糖及调节肠道菌群等多种药理活性。除药用价值外，杜仲还是少数能合成反式聚异戊二烯（杜仲橡胶）的植物之一，该物质兼具橡胶与塑料特性，耐磨、绝缘、耐酸碱，在航空航天和生物医学等领域具有应用潜力。然而，环剥取皮受限于树木生长周期长、资源可再生性差，难以满足大规模工业需求。相比之下，杜仲叶片资源丰富、年可更新、易采收且富含活性成分，已成为杜仲资源可持续高值化利用的关键替代原料。
研究方法
2.1 植株选择与根际土壤采样
根际土壤采自中国河南省孟州市一处杜仲人工林。共设置5个采样点，每个采样点采集3份重复样品。选取健康植株，小心挖掘至约20 cm深度以暴露细根。去除松散附着土壤后，用无菌毛刷收集紧密附着于根表面约1–2 mm范围内的根际土壤。样品置于无菌管中，冰上运输至实验室，并立即用于细菌分离。
【数据】采样深度：约20 cm；根际土壤范围：根表面1–2 mm；采样点：5个；重复：每点3份
2.2 根际细菌的分离与鉴定
本研究专门针对可培养根际细菌，目的是获得用于后续促生性状筛选和接种试验的细菌分离株；其他微生物类群未予研究。细菌分离时，将10 g新鲜根际土壤悬浮于90 mL含无菌玻璃珠的无菌生理盐水中，180 rpm振荡30 min以释放根际细菌。短暂沉降后，用无菌生理盐水进行系列稀释，取适宜稀释度涂布于LB琼脂平板。平板于30°C培养48–72 h。挑取形态不同的单菌落，在LB琼脂上反复划线直至获得纯培养。纯化菌株于−80°C保存在含50%甘油的LB肉汤中。
提取各分离株基因组DNA进行分子鉴定。使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增近全长16S rRNA基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由上海桑尼生物科技有限公司测序。序列通过BLAST工具与NCBI数据库比对。系统发育分析在MEGA 11中进行，构建1000次自举重复的邻接树以确定分离株的分类地位。
【数据】土壤用量：10 g；悬浮液：90 mL无菌生理盐水；振荡：180 rpm、30 min；培养：30°C、48–72 h；保存：−80°C、50%甘油；引物：27F/1492R；自举重复：1000次
2.3 促生性状的体外筛选
通过检测IAA类化合物产生、无机磷溶解和在无氮培养基上的生长情况来评估推定体外促生性状。IAA类化合物产生筛选：将分离株接种于含0.1% L-色氨酸的LB肉汤中，30°C、180 rpm培养7天。加入Salkowski试剂显色后，记录培养上清液在530 nm处的吸光度。溶磷试验在含Ca₃(PO₄)₂作为不溶性磷源的无机磷培养基上进行，将细菌接种于培养基后30°C培养3天，记录菌落周围透明圈作为溶磷证据。在Ashby无氮培养基上的生长用作推定固氮潜力的初步指标，连续三次传代后仍能稳定生长的分离株记为阳性。
这些试验仅提供初步体外指标；植物体内固氮能力和杜仲内源IAA浓度未予测定。
【数据】L-色氨酸浓度：0.1%；培养条件：30°C、180 rpm、7天；检测波长：530 nm；溶磷培养：30°C、3天；传代次数：3次
2.4 盆栽试验与接种处理
盆栽试验于2025年2月至4月在河南大学进行，旨在评估所选细菌分离株对杜仲幼苗的促生效果。杜仲品种'华仲10号'种子经表面消毒后催芽。苗床培育20天后，选取长势一致的幼苗，单株移栽至装有灭菌蛭石与泥炭混合物（2:1，v/v）的塑料盆中。盆直径15 cm、高10 cm，每盆1株。
共设6个处理：CK、EU-2、EU-7、EU-12、EU-28和EU-36。细菌处理组每株浇灌50 mL菌悬液，OD600调至约1.0（约1×10⁸ CFU mL⁻¹），施于根区周围。接种浓度和用量根据预实验确定。CK组浇灌等量无菌水。每个处理设5个独立生物学重复，每盆1株为1个生物学重复，所有盆完全随机排列。接种60天后收获幼苗，测定植株生长、根系形态和生理性状。
【数据】盆栽基质：蛭石:泥炭=2:1（v/v）；盆规格：直径15 cm、高10 cm；接种量：50 mL/株；OD600≈1.0（约1×10⁸ CFU mL⁻¹）；处理数：6个；生物学重复：5个；收获时间：接种后60天
2.5 植株生物量、根系形态与光合参数测定
细菌接种60天后，收获各处理幼苗，测定生物量、根系形态、相对叶绿素含量和光合参数。将地上部与根部分离，用蒸馏水轻轻冲洗、吸干后称重，获得地上部与根部鲜重。将洗净的根系均匀铺展于盛水的透明托盘中以减少重叠，用Epson Expression 12000XL根系扫描仪扫描。使用WinRHIZO 2013e软件计算总根长和总根表面积。相对叶绿素含量用SPAD叶绿素仪测定。气体交换参数于晴天9:00–11:00在第四片完全展开叶上使用LI-6800便携式光合测定系统（LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA）记录，包括净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO₂浓度。
【数据】测定时间：晴天9:00–11:00；叶片位置：第四片完全展开叶；仪器：Epson Expression 12000XL、WinRHIZO 2013e、SPAD叶绿素仪、LI-6800
2.6 田间接种试验与叶片样品采集
田间接种试验于2025年5月至10月在河南省原阳试验基地进行，旨在评估田间条件下的细菌接种效果。采用随机完全区组设计，设3个区组。每区组含1个P. putida EU-36处理小区和1个对照小区，处理在区组内随机分配，共3个处理小区和3个对照小区。
接种处理中，将P. putida EU-36菌悬液（1×10⁸ CFU mL⁻¹）与500 g有机肥混合后施用；对照处理施入等量有机肥与等体积无菌水的混合物。小区间设0.5 m缓冲带以减少交叉污染。菌肥混合物按每株1 kg施于植株滴灌线周围。田间试验期间未施用除草剂和化学肥料。
分别于接种后90天和120天（对应2025年9月的T1和10月的T2）采集叶片样品。组学样品编号中，CG和EG分别代表对照组和P. putida EU-36接种组；CG-1和EG-1对应T1，CG-2和EG-2对应T2。单个样品编号（如CG-1–1）中末位数字（1–3）表示生物学重复。每个采样阶段从每个小区随机选取1株植株。因此，每个处理含3个生物学重复，每个重复来自独立试验小区。每株取自枝梢起的第四和第五片完全展开叶，立即用液氮冷冻，干冰运输至实验室，分装为转录组和代谢组分析亚样品，−80°C保存备用。
【数据】接种浓度：1×10⁸ CFU mL⁻¹；有机肥用量：500 g/处理；缓冲带：0.5 m；施用量：1 kg/株；采样时间：接种后90天（T1）和120天（T2）；生物学重复：3个；叶片位置：第四、五片完全展开叶
2.7 RNA提取、文库构建与转录组测序
杜仲叶片样品总RNA用RNAprep Pure Plant Kit（天根，北京）提取，RNA浓度、纯度和完整性经评估后进行后续分析（原文方法部分在此处截断，后续步骤原文未完整呈现）。
【数据】RNA提取试剂盒：RNAprep Pure Plant Kit（天根，北京）；原文未详述后续建库与测序具体参数
研究结果
3.1 根际细菌分离株的促生性状差异
从健康杜仲植株根际土壤中共获得36个细菌菌落，经分子鉴定得到11个代表性分离株。基于16S rRNA基因测序的分子鉴定显示，这些分离株属于多个细菌属，包括不动杆菌属（Acinetobacter）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、弗兰克菌属（Franconibacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）和肠杆菌属（Enterobacter）。
EU-36的16S rRNA基因片段长度为1450 bp，与P. putida的序列相似性为99.99%。系统发育分析将EU-36置于P. putida分支内（图S1）。因此，菌株EU-36被鉴定为恶臭假单胞菌，以下简称为P. putida EU-36。
在分离株中，5株表现出至少一种推定体外促生性状，包括Salkowski阳性反应（IAA类化合物）、无氮培养基生长或无机磷溶解。EU-2和EU-7呈Salkowski阳性反应并具有溶磷能力；EU-12能在无氮培养基上生长并具有溶磷能力；EU-28能在无氮培养基上生长；P. putida EU-36呈Salkowski阳性反应并能在无氮培养基上稳定生长。
【数据】分离菌落数：36个；代表性分离株：11个；EU-36的16S rRNA片段：1450 bp；与P. putida相似性：99.99%；具促生性状菌株数：5株
3.2 细菌接种影响杜仲幼苗生长
在盆栽条件下，经体外筛选选出的5株细菌在杜仲幼苗上产生了不同的生长反应（图2A）。与CK相比，所有接种处理均提高了地上部鲜重，其中P. putida EU-36处理的效果最为显著。该处理的地上部鲜重为1.09 g，是CK值0.43 g的2.53倍（P < 0.05）。根部鲜重在接种后也呈增加趋势；但仅P. putida EU-36处理与CK差异显著，达到0.57 g，增幅为62.86%（P < 0.05）（图2B、C）。
细菌接种还改变了SPAD值和光合参数。与CK相比，5个接种处理的SPAD值均升高，增幅为19.11%至30.52%；P. putida EU-36处理下SPAD值从27.52升至35.92。各接种处理的净光合速率为CK值的1.40–2.07倍，其中P. putida EU-36接种下最高（6.39对3.09 μmol m⁻² s⁻¹）。P. putida EU-36处理下的气孔导度为0.047 mol m⁻² s⁻¹，增幅51.61%（图2D–H）。
根系形态在接种处理间也存在差异。所有接种幼苗的总根长均高于CK。P. putida EU-36接种下的响应最大，总根长达241.99 cm，是CK值105.63 cm的2.29倍。总根表面积呈现相似趋势。P. putida EU-36接种下总根表面积达14.20 cm²，是CK值7.49 cm²的1.90倍。EU-12也显著增加了根表面积，但响应弱于P. putida EU-36。
基于其整体体外筛选特征和优异的盆栽表现，选择P. putida EU-36进行后续田间接种和多组学分析（图2I、J）。
【数据】地上部鲜重：EU-36处理1.09 g vs CK 0.43 g（2.53倍，P<0.05）；根部鲜重：0.57 g（+62.86%，P<0.05）；SPAD增幅：19.11%–30.52%（EU-36：27.52→35.92）；净光合速率：6.39 vs 3.09 μmol m⁻² s⁻¹（1.40–2.07倍）；气孔导度：0.047 mol m⁻² s⁻¹（+51.61%）；总根长：241.99 cm vs 105.63 cm（2.29倍）；总根表面积：14.20 cm² vs 7.49 cm²（1.90倍）
3.3 *P. putida* EU-36接种与叶片代谢组变化相关
田间条件下，P. putida EU-36接种组与对照组的叶片代谢组谱存在差异。PCA将两组分开，PC1和PC2分别解释总变异的36.70%和25.47%（图3A）。OPLS-DA在两个采样阶段均显示出类似的分离模式（图3B、C），表明EU-36接种与叶片代谢组变化相关。
根据预设筛选标准，在EG-1 vs CG-1（T1）中检测到808个差异积累代谢物，其中408个相对含量升高，400个相对含量降低。在EG-2 vs CG-2（T2）中检测到853个差异积累代谢物，其中403个相对含量升高，450个相对含量降低（图3D–F）。这些代谢物主要归属于脂质、萜类、碳水化合物、黄酮类、香豆素类、生物碱、多酚及相关衍生物（图3H、I）。
在品质相关代谢物中，绿原酸、桃叶珊瑚苷、香叶醇和茉莉酸（JA）在P. putida EU-36接种后相对含量升高，但变化幅度因采样阶段而异。绿原酸相对含量在T1和T2分别为对照的2.628倍和2.366倍；桃叶珊瑚苷分别为对照的1.416倍和1.165倍。香叶醇相对含量在T1和T2分别为对照的2.942倍和1.411倍；JA分别为对照的2.682倍和1.794倍。
KEGG通路富集分析将差异积累代谢物关联到芳香族氨基酸生物合成、苯丙烷生物合成、单萜生物合成、黄酮生物合成和甘油磷脂代谢（图3J、K）。
【数据】PCA：PC1=36.70%，PC2=25.47%；T1差异代谢物：808个（408升高/400降低）；T2差异代谢物：853个（403升高/450降低）；绿原酸相对含量：T1为对照2.628倍、T2为2.366倍；桃叶珊瑚苷：T1为1.416倍、T2为1.165倍；香叶醇：T1为2.942倍、T2为1.411倍；JA：T1为2.682倍、T2为1.794倍
3.4 *P. putida* EU-36接种与叶片转录组变化相关
利用RNA测序检测杜仲叶片对P. putida EU-36接种的转录响应。12个叶片样品共产生80.19 Gb的clean data，每个样品为5.965–7.680 Gb（表S2）。12个文库的Q20值为98.96%至99.18%，Q30值为95.16%至96.12%，GC含量为46.16%至46.77%。此外，93.58%–94.75%的clean reads比对到杜仲参考基因组。
样品相关性分析和PCA支持生物学重复的一致性，并显示各采样阶段内P. putida EU-36接种组与对照组分离（图4A）。差异表达分析在EG-1 vs CG-1中检测到1733个差异表达基因，其中1228个上调、505个下调。在EG-2 vs CG-2中检测到1688个差异表达基因，其中925个上调、763个下调。两个比较共有482个差异表达基因（图4B–D）。
功能富集分析表明，这些差异表达基因主要与激素信号、次生代谢、光响应、氧化还原代谢、细胞壁相关过程以及与植物-微生物互作相关的通路有关。第一个采样阶段富集的GO条目包括茉莉酸响应、细胞壁生物合成、木葡聚糖代谢过程和茉莉酸生物合成过程（图4E）。第二个采样阶段富集的GO条目包括光响应、叶绿素生物合成过程调控、氧化还原酶活性、单加氧酶活性和细胞壁相关功能（图4F）。
KEGG通路富集分析表明，差异表达基因富集于植物激素信号转导、苯丙烷生物合成、黄酮生物合成、单萜生物合成、ABC转运蛋白以及淀粉和蔗糖代谢（图4G、H）。
【数据】总clean data：80.19 Gb；每样品：5.965–7.680 Gb；Q20：98.96%–99.18%；Q30：95.16%–96.12%；GC含量：46.16%–46.77%；比对率：93.58%–94.75%；T1差异表达基因：1733个（1228上调/505下调）；T2差异表达基因：1688个（925上调/763下调）；共有差异基因：482个
3.5 实时荧光定量PCR验证显示与RNA测序一致的表达趋势
选取8个代表性差异表达基因EUC01091、EUC05360、EUC07306、EUC07780、EUC08780、EUC11329、EUC12181和EUC16024进行qRT-PCR验证。将qRT-PCR获得的表达模式与转录组FPKM谱在4个样品组（CG-1、EG-1、CG-2和EG-2）间进行比较。7个基因在两个采样阶段的EU-36接种样品中普遍表现出较高表达，而EUC11329表现出较低表达。总体而言，qRT-PCR结果与RNA-seq数据一致。
【数据】验证基因数：8个；qRT-PCR与RNA-seq一致基因数：8个（7个上调趋势一致、1个下调趋势一致）；原文未详述具体引物序列与PCR条件
3.6 讨论
有益根际微生物可通过改变养分有效性、根系发育、生理状态和次生代谢来影响植物表现。对药用和工业作物而言，这种双重效应至关重要——生物量生产和代谢物积累共同决定原料价值。例如，Ma等（2025b）报道，含解淀粉芽孢杆菌SQR9和哈茨木霉NJAU4742的生物有机肥显著改善了梨树根际微环境，两种处理下梨树总生物量较普通有机肥对照分别增加了68%和84%。这些发现说明有益微生物接种剂在改善多年生木本作物表现方面具有潜力。
本研究结果显示，P. putida EU-36接种增强了杜仲幼苗生长，并与多种品质相关叶片代谢物相对含量升高相关，同时伴随协调的转录和代谢变化。本研究的创新之处在于将本地细菌筛选、盆栽生长评估、田间接种、代谢组分析和转录组分析相结合，系统考察细菌接种对多年生木本药用与工业植物生长和叶片品质的影响。以往研究主要侧重于促生、养分获取或胁迫耐受。
【数据】引用文献中梨树生物量增幅：68%和84%；本研究中地上部鲜重倍数：2.53；绿原酸相对含量倍数：2.628（T1）和2.366（T2）
讨论与解读
讨论要点
P. putida EU-36接种对杜仲生长与品质相关代谢物的双重促进作用，可能源于细菌对植物激素信号和次生代谢途径的系统性调控。茉莉酸相关基因表达、茉莉酸含量与次生代谢谱的同步变化提示，茉莉酸信号通路可能在介导P. putida EU-36诱导的代谢重编程中发挥枢纽作用。苯丙烷、黄酮和单萜生物合成途径的协同富集，与绿原酸、桃叶珊瑚苷和香叶醇等品质相关代谢物的积累相呼应。这些发现支持将EU-36进一步开发为可持续杜仲叶片生产和品质提升的微生物接种剂。
编译者解读
本研究的方法学链条值得借鉴：从根际分离到体外性状筛选，再到盆栽验证和田间确认，最后用多组学解析机制，逻辑完整。将绿原酸、桃叶珊瑚苷等药效成分与茉莉酸信号联系起来，为"促生菌如何影响药用植物次生代谢"提供了可参考的分子证据。局限在于：茉莉酸含量与基因表达变化的因果关系尚需突变体或抑制剂实验验证；菌株在复杂土壤生态系统中的定殖动态与长期效果也有待跟踪。从合成生物学视角看，EU-36中负责IAA合成和定殖的关键基因若被解析，未来或可工程化改造为广谱木本植物促生底盘菌株。
参考来源
Geng, J. (2026). Rhizosphere-derived Pseudomonas putida EU-36 enhances growth and quality-related metabolite accumulation in Eucommia ulmoides leaves. Industrial Crops and Products. DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124269
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124269