来源：Deciphering and improving human homogentisate 1,2-dioxygenase function through knowledge gaining directed evolution: implications for alkaptonuria（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人尿黑酸1,2-双加氧酶（HGD）催化酪氨酸降解途径中尿黑酸（HGA）氧化裂解为马来酰乙酰乙酸（MAA）的关键反应。HGD功能缺失导致罕见的常染色体隐性遗传病——褐黄病（AKU），患者体内毒性HGA累积，目前药物尼替西农虽可降低HGA水平却无法恢复酶功能。本研究运用知识获取型定向进化（KnowVolution）策略，系统解析氨基酸替换如何影响人HGD的催化活性与结构完整性。值得注意的是，所有影响活性的替换位点均不在催化口袋内，而主要分布于表面暴露或结构区域——这一发现为理解多聚体酶的远程调控机制提供了新视角。
研究背景
人HGD（EC 1.13.11.5）催化HGA氧化裂解为MAA，是酪氨酸降解途径的关键步骤。HGD功能丧失导致褐黄病（AKU；OMIM #203500），一种罕见的常染色体隐性代谢疾病。AKU由位于染色体3q21-q23的单拷贝HGD基因（含14个外显子）的纯合或复合杂合突变引起。截至2026年1月，已在748名患者中鉴定出259种独特的致病性DNA变异，其中大多数为错义突变。尽管部分变异保留一定酶活性，但通常不足以阻止HGA积累。HGD双等位基因致病性变异导致HGA进行性蓄积，经氧化和聚合形成类黑素样的褐黄素色素，在结缔组织中沉积，产生AKU的标志性临床特征：暗色尿液、软骨/巩膜/皮肤蓝黑色变。严重并发症包括主动脉瓣狭窄、血管钙化、肾结石及早发性致残性关节病。现有疗法如尼替西农（NTBC）虽能降低HGA水平，但无法恢复HGD酶功能，并可能导致高酪氨酸血症。因此，深入研究HGD结构与功能关系对开发修复性疗法具有重要意义。
研究方法
2.1 材料
所用化学品均为分析纯或更高等级，购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH（德国Schnelldorf）。限制性内切酶、PCR预混液和T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific（美国Waltham）。所有PCR反应使用Bio-Rad iCycler热循环仪（Bio-Rad Laboratories，美国Hercules）配合薄壁PCR管（Sapphire PCR管，0.2 mL，聚丙烯；Greiner Bio-One，奥地利Kremsmünster）进行。质粒提取和PCR纯化试剂盒购自Sigma-Aldrich（德国Hamburg）。DNA浓度使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定，600 nm光密度（OD600）使用Eppendorf BioPhotometer D30（德国Hamburg）测定。HGD蛋白表达在96孔锥形底微量滴定板（Greiner Bio-One GmbH，奥地利Kremsmünster）中进行，孵育使用Eppendorf New Brunswick™ Innova 42R摇床。MAA测定的吸光度使用VICTOR 3 1420 Multilabel Counter酶标仪（PerkinElmer，美国Waltham）配合Nunc™ MicroWell™ 96孔微板（Thermo Fisher Scientific）完成。
【数据】试剂等级：分析纯或更高；PCR管规格：0.2 mL聚丙烯；OD600测定仪器：Eppendorf BioPhotometer D30；表达板型：96孔锥形底微板；酶标仪：VICTOR 3 1420
2.2 菌株、质粒、基因克隆与表达载体构建
野生型（WT）人HGD cDNA（NM_000187.3），经大肠杆菌密码子优化，由GeneArt（Thermo Scientific）提供，装载于标准pMA克隆质粒中（见补充数据1）。插入片段使用NdeI和EcoRI限制性内切酶亚克隆至pET42b(+)表达载体（Novagen，德国Darmstadt）的多克隆位点，随后进行连接酶介导的克隆。该载体赋予卡那霉素（KANA）抗性，允许在大肠杆菌中进行高水平蛋白表达和纯化。LB培养基（含或不含1%葡萄糖，补充KANA 50 μg/mL）作为标准生长培养基。质粒维持和扩增在大肠杆菌DH5α细胞（Stratagene，美国La Jolla）中进行，蛋白表达在大肠杆菌BL21（DE3）菌株（Agilent Technologies，美国Santa Clara）中完成。通过热激转化大肠杆菌生成空pET42b(+)载体（简称空载体，EV），作为阴性对照信号。质粒使用GenElute™ Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich，美国St. Louis）按制造商说明纯化。质粒序列由Eurofins Genomics（德国）采用TubeSeq Supreme方案进行Sanger测序验证，序列使用BioEdit（版本7.2.5）分析和比对。
【数据】抗生素：卡那霉素 50 μg/mL；培养基：LB（±1%葡萄糖）；宿主菌：DH5α（克隆）、BL21(DE3)（表达）；限制性酶：NdeI/EcoRI
2.3 人HGD的KnowVolution
#### 2.3.1 HGD易错PCR文库的生成
用于扩增HGD插入片段和pET42b(+)质粒骨架的定制引物在5′端含有12个硫代磷酸酯（PTO）修饰（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific）（引物序列见补充数据2）。载体骨架PCR在50 μL反应体系中进行，使用Phusion高保真DNA聚合酶并补充1% DMSO，循环条件为：98°C 3分钟；35个循环的98°C 30秒、58.9°C 30秒、72°C 2.5分钟；最后72°C延伸5分钟。HGD插入片段的易错PCR（epPCR）在50 μL反应体系中进行，使用Taq DNA聚合酶，在MnCl2（终浓度0.05–0.2 mM）存在下生成三个独立突变文库，循环条件为：94°C 3分钟；35个循环的94°C 30秒、53.3°C 30秒、72°C 1.5分钟；最后72°C延伸10分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，并用DpnI消化去除甲基化亲本DNA，载体骨架额外用EcoRI处理以消除残留的亲本模板DNA。消化产物随后使用GenElute™ PCR Clean-Up Kit（Sigma-Aldrich）进行柱纯化。对于硫代磷酸酯-连接酶非依赖性克隆（PLICing），纯化的载体和插入片段稀释至0.03和0.09 pmol/μL（1:3摩尔比），在70°C下用新鲜配制的Tris-HCl、碘乙醇溶液和水（5:3:2 v/v）混合物进行碘裂解15分钟。裂解片段在室温杂交10分钟，柱纯化后转化至化学感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞中进行表达、筛选和选择，具体见2.4.1.1节。设置再连接和DpnI对照以监测背景菌落形成。目标变异体按制造商说明进行质粒纯化，并经Sanger测序鉴定影响位点，随后使用2.4.1.2节所述工作流程进行重新筛选。
【数据】MnCl2浓度：0.05–0.2 mM；载体PCR：98°C/3min + 35×(98°C/30s, 58.9°C/30s, 72°C/2.5min) + 72°C/5min；epPCR：94°C/3min + 35×(94°C/30s, 53.3°C/30s, 72°C/1.5min) + 72°C/10min；PLICing：载体:插入=0.03:0.09 pmol/μL（1:3摩尔比），70°C/15min碘裂解，室温杂交10min
#### 2.3.2 位点饱和突变文库
单位点饱和突变（SSM）采用22c-trick方法，该方法使用三种引物的混合物编码全部20种标准氨基酸，同时最小化密码子冗余。引物混合物包含NDT（12种氨基酸）、VHG（9种氨基酸）和TGG（1种氨基酸）引物，比例为12:9:1（摩尔比），确保氨基酸代表性均匀并减少需筛选的变异体数量。应用三倍过采样因子以达到理论变异空间约95%的覆盖率，每位点需筛选约66个菌落。SSM针对KnowVolution第一阶段鉴定出的八个有益位点（31、54、86、91、150、223、317、354）及基于HGD突变数据库的五个额外催化位点（336、347、359、373、401）进行。突变使用改良的QuikChange™方案在HGD-WT上进行，该方案包含初始单引物延伸步骤以减少引物二聚体形成。正向和反向引物延伸反应分别制备，每个反应包含HGD-WT模板、22c-trick引物混合物、含1% DMSO的Phusion高保真聚合酶和缓冲液。引物序列和位点特异性退火温度列于补充表S2。反应进行三轮循环（98°C 10秒，位点特异性温度退火30秒，72°C 60秒）。然后将正向和反向引物反应等体积混合进行第二次PCR扩增，进行15个循环（98°C 10秒，相同温度退火30秒，72°C 60秒），最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，DpnI消化去除甲基化亲本DNA，并热灭活。所得产物连同HGD-WT和EV对照转化至化学感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞中进行表达、筛选和选择，见2.4.1.1节。显示活性提高的变异体经质粒纯化和Sanger测序鉴定有益替换，随后使用2.4.1.2节所述工作流程重新筛选。
【数据】22c-trick引物比例：NDT:VHG:TGG = 12:9:1（摩尔比）；筛选覆盖度：~95%（66菌落/位点）；SSM位点：8个Phase I位点+5个数据库位点；PCR方案：3轮(98°C/10s, 退火/30s, 72°C/60s) + 15轮(98°C/10s, 退火/30s, 72°C/60s) + 72°C/10min
#### 2.3.3 计算机辅助结构分析
基于预测的对HGD稳定性和催化活性的影响，选择五个残基（Asn31、Ser54、Asp86、Gln354、Pro359）进行计算机模拟SSM。CompassR策略通过分析突变体（mut）与WT酶之间的相对折叠自由能变化（ΔΔGfold = ΔGfold,mut − ΔGfold,WT）来指导选择与改善酶性能相容的替换。ΔΔGfold正值表示稳定性降低，ΔΔGfold ≤ 0.36 kcal/mol的替换被认为可能有益。HGD-WT的晶体结构（PDB ID: 1EYB，链A，1.9 Å分辨率）使用YASARA的“RepairObject”进行旋转异构化和能量最小化以校正非标准扭转角。ΔΔGfold值使用YASARA中的FoldX（v5）计算，进行五次独立运行，条件为298 K、pH 7、离子强度0.05 M。对每个残基，PositionScan系统性地替换全部19种替代氨基酸……
【数据】PDB结构：1EYB（链A，1.9 Å）；ΔΔGfold阈值：≤0.36 kcal/mol；计算条件：298 K、pH 7、0.05 M离子强度；运行次数：5次独立运行
研究结果
AKU源于HGD缺陷，尽管NTBC提供姑息性代谢控制，但无法恢复HGD酶活性，因此需要进一步研究HGD结构-功能关系以开发修复性疗法。为此，KnowVolution被用作一种受控方法，以识别改善酶稳定性和催化效率的替换，同时深入了解结构-功能关系，为AKU的精准医学方法提供潜在附加值。该策略将随机和靶向突变与计算分析和理性重组相结合，以高效探索蛋白质序列空间，揭示残基间的协同效应，并获得传统定向蛋白进化（DPE）经常忽略的机制见解（图2）。
为确保变异体活性评估的可靠性，在文库筛选前对高通量HGD活性测定进行了优化和稳健性评估。测定优化和稳健性细节（包括板均匀性和性能指标）分别见补充结果S1和S2，汇总于表S1。
在KnowVolution的Phase I中，重点是识别有助于催化性能同时保持整体酶功能的氨基酸位置，保留HGD-WT活性至少85%的变异体被选为后续优化的起点。在Phase I工作流程中，通过epPCR进行随机突变，生成三个MnCl2浓度递增（0.05、0.1和0.2 mM）的文库，分别产生440、528和352个克隆，共1320个变异体。在这些条件下，活性克隆的比例随突变率增加而降低：0.05、0.1和0.2 mM文库中分别有92.3 ± 2.2%、80.1 ± 11.6%和71.6 ± 14.8%保持活性，表明更高的突变率减少了功能性变异体，同时增加了序列多样性。在初步筛选中，0.05 mM文库中的24个克隆、0.1 mM文库中的6个克隆和0.2 mM文库中的8个克隆表现出达到或超过HGD-WT相对活性85%阈值的活性。对活性变异体的重新筛选得到16个克隆，代表八个独特的氨基酸位置。其相对活性（平均值±标准差）从N31S的88.1 ± 9.4%到N223D/S54N的108.3 ± 4.5%不等，其他变异体如I317V（104.5 ± 10.3%）、D86G（104.9 ± 2.4%）、Q354R（95.5 ± 16.6%）、D91G（102.2 ± 3.0%）和S150I（99.7 ± 3.4%）的活性介于这些极值之间（图3a）。
在结构映射之前，将Boltz-2预测的HGD-WT单体与实验确定的人HGD结构PDB 1EYB和1EY2进行交叉验证（图S4）。与脱辅基结构1EYB比对，405对修剪的Cα原子对的RMSD为0.677 Å，全部419对对齐对的RMSD为0.918 Å。与含Fe2+的结构1EY2比对，413对修剪的Cα原子对的RMSD为0.483 Å，全部419对对齐对的RMSD为0.740 Å。这些低RMSD值表明预测与实验单体结构高度一致。随后将鉴定出的位置映射到HGD的三维单体结构上以获得结构和机制见解。四个残基位于蛋白质核心内（Asn54、Ser150、Asn223和Ile317），四个位于表面（Gln354、Asp86、Asp91和Asn31）。值得注意的是，鉴定的位置均不位于催化口袋内（图3b）。
【数据】文库规模：440（0.05 mM）、528（0.1 mM）、352（0.2 mM），共1320个变异体；活性克隆比例：92.3±2.2%（0.05 mM）、80.1±11.6%（0.1 mM）、71.6±14.8%（0.2 mM）；初筛阳性克隆数：24（0.05 mM）、6（0.1 mM）、8（0.2 mM）；复筛后克隆数：16个（8个独特AA位点）；相对活性范围：88.1±9.4%（N31S）至108.3±4.5%（N223D/S54N）；RMSD：0.677 Å（1EYB，405对）、0.918 Å（1EYB，419对）、0.483 Å（1EY2，413对）、0.740 Å（1EY2，419对）
在Phase I鉴定出影响位点的基础上，Phase II系统评估了可能影响HGD活性的位点处的氨基酸替换。Phase I的八个位置（31、54、86、91、150、223、317和354）以及来自HGD突变数据库的五个额外位置（336、347、359、373和401）被作为SSM靶点。纳入这些患者来源的热点区域使我们能够在已知影响AKU的位点获得实验进化数据，从而探索可增强或调节催化功能的替代替换。共使用22c-trick策略生成13个SSM文库，每个文库筛选66个克隆以达到约95%的理论覆盖率。显示活性提高（≥HGD-WT的100%）的变异体被重新筛选以确认可重复性。在13个靶向位置中，五个位点（Asn31、Ser54、Asp86、Gln354和Pro359）的替换产生了相对HGD-WT活性增加的变异体。在Asp86位点鉴定出三个有益替换（D86H、D86A、D86Q），Gln354获得三个替换（Q354P、Q354V、Q354H），Pro359获得两个替换（P359E、P359M）。相应的平均相对活性（平均值±标准差）为：N31S，105.9 ± 9.0%；S54D，111.9 ± 13.9%；D86H，107.0 ± 2.8%；D86A，103.3 ± 6.3%；D86Q，102.1 ± 8.7%；Q354P，100.2 ± 7.9%；Q354V，108.0 ± 10.2%；Q354H，113.7 ± 5.4%；P359E，119.9 ± 9.5%；P359M，106.0 ± 12.2%。其中四个变异体（S54D、D86H、Q354H和P359E）的活性增加与HGD-WT相比具有统计学显著性（S54D，p = 0.0079；D86H，p = 0.0423；Q354H，p = 0.0109；P359E，p = 0.0001）（图4a）。
为将这些活性改善置于结构背景中，将鉴定出的位置映射到HGD的三维单体结构上（图4b）。值得注意的是，有益替换分布于HGD的结构不同区域：Asn31是N末端环上的溶剂暴露残基，Asp86在N末端结构域的柔性77–114环内表面暴露，Ser54在构成结构β-三明治的N末端β-折叠中适度溶剂可及，Gln354在C末端β-折叠中表面暴露，Pro359埋在C末端β-折叠的核心中。重要的是，鉴定的位置均不位于催化口袋内，表明它们对酶活性的影响是间接的，而非直接参与催化。其中几个位置是溶剂暴露的，支持其功能影响更可能与结构稳定化或亚基相互作用相关的观点。
人HGD组装成六聚体复合物，由亚基间β-折叠接触、疏水相互作用和确定的环定位稳定。晶体结构进一步表明，这种六聚体组装代表了溶液状态，因为晶格接触主要是水介导的，且溶剂含量高（约68%）。因此，正确的六聚体形成对酶功能至关重要，因为准确的亚基方向和环定位是维持活性位点几何结构所必需的。相应地，几个导致AKU的突变发生在表面或界面位置，破坏寡聚组装。为进一步评估鉴定出的位置在亚基相互作用中的参与，使用PDBePISA对HGD生物组装体进行了界面分析。在产生有益替换的五个位置中，Asn31和Asp86显示出可测量的界面贡献。Asn31的溶剂可及表面积（ASA = 95.70 Ų）、复合物形成时的埋藏表面积（BSA = 89.87 Ų）和有利的自由能贡献（ΔG = −0.24 kcal/mol）与其在亚基界面的稳定作用一致。Asp86显示出高溶剂暴露（ASA = 139.29 Ų）和中等埋藏（BSA = 40.81 Ų），具有稳定贡献（ΔG = −0.19 kcal/mol）。在结构上，Asp86与Lys126形成一个氢键和两个盐桥，涉及Asp86的OD1和OD2原子以及Lys126的NZ原子，距离分别为2.88和3.68 Å，突显其在稳定寡聚体中的潜在作用。尽管Ser54显示出相当大的溶剂暴露（ASA = 95.08 Ų），但在PDB中未检测到可测量的BSA或ΔG贡献……
【数据】SSM文库数：13个；筛选克隆数：66/文库；有益位点数：5个（Asn31、Ser54、Asp86、Gln354、Pro359）；相对活性：N31S 105.9±9.0%、S54D 111.9±13.9%、D86H 107.0±2.8%、D86A 103.3±6.3%、D86Q 102.1±8.7%、Q354P 100.2±7.9%、Q354V 108.0±10.2%、Q354H 113.7±5.4%、P359E 119.9±9.5%、P359M 106.0±12.2%；p值：S54D p=0.0079、D86H p=0.0423、Q354H p=0.0109、P359E p=0.0001；ASA/BSA：Asn31 ASA=95.70 Ų/BSA=89.87 Ų/ΔG=−0.24 kcal/mol；Asp86 ASA=139.29 Ų/BSA=40.81 Ų/ΔG=−0.19 kcal/mol；氢键/盐桥距离：2.88 Å和3.68 Å
讨论与解读
本研究运用KnowVolution策略系统探索了人HGD的结构-功能关系——一种缺陷导致AKU的酶。通过将随机和靶向突变与计算分析和理性重组相结合，我们鉴定了在不直接影响催化口袋的情况下调节催化活性的氨基酸位置。在流程的所有阶段，有益替换始终位于表面暴露或结构区域，突显了间接机制在调节HGD功能中的重要性。结构映射和界面分析表明，某些位置（如Asn31和Asp86）直接有助于六聚体稳定化，而结构检查还提示Ser54在二聚体界面的亚基间相互作用中发挥作用。相比之下，Gln354和Pro359的替换可能通过对Gly347-Gly355环周围区域的局部结构动力学产生微妙影响来调节活性，该环充当活性位点口袋上的动态盖子。这些发现表明，远端和界面残基在调节HGD催化性能中发挥重要作用，可能代表多聚体酶的一个更广泛的设计原则。尽管观察到的活性改善幅度适中，但它们强调了工程化多聚体酶的复杂性——突变可同时影响催化功能和寡聚体稳定性。
编译者解读
本文的价值在于用KnowVolution策略系统性地证明了多聚体酶的"远程调控"逻辑：影响催化活性的关键残基可以完全位于催化口袋之外，通过稳定六聚体组装或重塑口袋几何来发挥作用。方法上，epPCR加22c-trick饱和突变再加CompassR计算筛选的组合拳，为其他多聚体酶的工程改造提供了可复制的范式。从合成生物学应用角度看，这一策略有望用于设计更稳定的HGD变异体作为酶替代疗法的候选——但需注意，本研究中活性提升幅度有限（最高约120%），距离治疗性应用仍有距离。此外，患者数据库中致病突变与实验有益突变在相同位点的重叠，为基因型-表型关联提供了新的解释维度。
参考来源
Lequeue S. Deciphering and improving human homogentisate 1,2-dioxygenase function through knowledge gaining directed evolution: implications for alkaptonuria. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154223
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.154223