来源：Comparative metabolomics-based analysis and functional mechanisms of the natto fermentation process as regulated by Bacillus subtilis strains CGMCC 34222 and A9（Journal of Food Composition and Analysis）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
纳豆是由枯草芽孢杆菌发酵大豆制成的传统食品，菌株差异深刻影响其功能特性与感官品质。本研究对高性能菌株CGMCC 34222与工业菌株A9进行基因组学、代谢组学与功能评价的多维比较分析，发现CGMCC 34222具有独特的遗传进化特征，编码特异性丝氨酸蛋白酶基因，并在纳豆发酵中产生更优的纳豆激酶活性与风味品质。研究建立了基于基因组学—代谢组学的纳豆优良发酵菌株理性筛选框架。
研究背景
纳豆作为传统大豆发酵食品，因独特发酵工艺和丰富功能成分而受到全球健康食品领域关注。纳豆激酶（NK）作为纳豆的标志性酶，具有显著溶栓活性和心血管健康益处；γ-氨基丁酸（GABA）可调节神经递质平衡、缓解焦虑；γ-聚谷氨酸和维生素K₂等生物活性成分协同支撑纳豆的核心保健功能。纳豆品质并非由单一成分决定，其功能活性、感官属性和风味特征很大程度上取决于枯草芽孢杆菌的菌株特异性。作为纳豆发酵的核心功能菌株，枯草芽孢杆菌在代谢途径和酶表达谱上的菌株间差异直接影响纳豆的最终品质。发酵过程中，纳豆蛋白被水解为小肽，不仅赋予超越基础营养价值的生理活性，还提高了生物利用度。
研究方法
2.1 材料
枯草芽孢杆菌菌株CGMCC 34222分离自纳豆样品，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。枯草芽孢杆菌A9为专门用于纳豆发酵的商业菌株。两株菌的全基因组序列均在本实验室测定。此外，从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索获得9株产纳豆枯草芽孢杆菌的完整基因组序列信息，汇总于表1。
【数据】菌株：B. subtilis CGMCC 34222、A9；基因组来源：本实验室测定+NCBI数据库9株参考菌株
2.2 样品制备
#### 2.2.1 基因组测序
按照ISO 23418:2022标准，使用Bacterial DNA Kit D3350提取基因组DNA，试剂盒根据微生物样品特征进行选择。使用BioDrop分光光度计测定DNA浓度和纯度，保留OD260/OD280比值为1.8–2.0的样品，表明蛋白质、酚类及其他污染物已被有效去除。通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA完整性。使用MGIEasy Fast Restriction Library Preparation Kit制备测序文库，该试剂盒根据各样品预设的核酸浓度和片段化特征进行选择。基于初始DNA投入量优化PCR循环条件，以最小化扩增偏差并确保文库质量均一。使用Qubit荧光计对文库浓度进行定量，以确保测序的可靠性和可重复性。高通量测序在BGI平台上进行。原始读段经过质量控制以去除低质量序列，随后进行从头组装和功能注释。
【数据】DNA提取标准：ISO 23418:2022；试剂盒：Bacterial DNA Kit D3350；OD260/OD280：1.8–2.0；文库构建：MGIEasy Fast Restriction Library Preparation Kit；定量：Qubit荧光计；测序平台：BGI
#### 2.2.2 纳豆制备
从斜面培养物中挑取枯草芽孢杆菌CGMCC 34222和菌株A9的单菌落，接种于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中。培养物在37°C、200 rpm的摇床中培养18小时获得种子培养液。选取优质大豆作为纳豆发酵原料。大豆经筛选去除杂质后，在无菌水中浸泡18小时，沥干去除表面水分，并在高压灭菌锅中于120°C灭菌30分钟。灭菌后的大豆冷却至室温，用作发酵底物。接种时，将枯草芽孢杆菌种子培养液与冷却的大豆底物按2%（v/w）的接种率充分混合，转入发酵容器进行分阶段发酵。诱导阶段在38°C下进行8小时，随后主发酵阶段在50°C下进行7小时。发酵结束时，温度迅速降至4°C以终止微生物代谢。发酵后的纳豆在4°C下存放24–48小时进行后熟，获得最终产品。每个发酵组均在相同发酵条件下制备生物学重复。发酵和后熟完成后，每个发酵样品充分混合以减少固态发酵造成的局部异质性。随后从混合样品中随机取等分试样，用于挥发性化合物分析、非靶向代谢组学、纳豆激酶活性测定和感官评价。所有发酵组均采用相同的取样程序。
【数据】种子培养：TSB培养基、37°C、200 rpm、18h；浸泡：无菌水18h；灭菌：120°C、30min；接种率：2%（v/w）；诱导发酵：38°C、8h；主发酵：50°C、7h；终止温度：4°C；后熟：4°C、24–48h
2.3 菌株进化分析
从NCBI数据库检索用于纳豆发酵的枯草芽孢杆菌完整基因组序列，与目标菌株CGMCC 34222和A9的基因组一起用于比较基因组分析。使用Prodigal预测编码序列（CDS）并进行结构注释。对Prodigal预测的蛋白质序列，采用BLAST v2.2.28与eggNOG-mapper平台相结合的方法进行功能注释，提供三个层次的注释：基因本体论（GO）、直系同源簇（COG）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分类（Camacho et al., 2009）。基于这些注释，筛选具有推定纤溶活性或广谱蛋白水解功能的蛋白质序列。
【数据】基因预测工具：Prodigal；注释工具：BLAST v2.2.28 + eggNOG-mapper；注释层级：GO、COG、KEGG
2.4 纳豆感官评价与纳豆激酶测定
#### 2.4.1 纳豆激酶含量测定
发酵后，取50 g纳豆进行匀浆。称取1.00 g匀浆物（精确至0.01 g），悬浮于0.9%（w/v）氯化钠溶液中，在100 W、40 kHz条件下超声提取15分钟。超声期间使用冰浴或等效冷却方法控制温度。混合物随后在12,000 rpm离心10分钟，收集上清液作为纳豆激酶（NK）粗提液。采用纤维蛋白平板法测定粗提液中的NK活性（Singh et al., 2023）。以蚓激酶标准品生成校准曲线，通过比较样品与标准品在纤维蛋白平板上产生的溶圈面积，计算发酵纳豆中的NK活性（U/g）。
【数据】样品量：50g匀浆、1.00g（精确至0.01g）；提取溶剂：0.9% NaCl；超声：100W、40kHz、15min、冰浴冷却；离心：12,000rpm、10min；测定方法：纤维蛋白平板法；标准品：蚓激酶
#### 2.4.2 感官评价
依据团体标准T/CNLIC 0036–2021《纳豆》（中国轻工业联合会，2021）并作少量修改，由5名经过培训的感官评价小组成员（2男3女，25–45岁）进行描述性感官评价。所有评价人员均接受过纳豆感官评价的专业培训，熟悉本研究所评价的感官属性。感官评估体系包括四个核心定量属性和一个定性外观描述符。粘弹性、氨样气味强度、鲜味和总体可接受性按1–10分制评分，分数越高表示品质越好。外观评价侧重于拉伸时的拉丝长度等特征。所有评价均在25°C、自然光下进行，样品间间隔5分钟以减少感官疲劳。感官结果以各属性的平均分报告，汇总于表2。鉴于受过培训的评价人员数量有限，感官结果仅作为初步描述性评估，用于支持纳豆品质比较，而非广泛的消费者偏好评价。
【数据】评价标准：T/CNLIC 0036–2021；评价人数：5人（2男3女，25–45岁）；评分范围：1–10分；评价条件：25°C、自然光；样品间隔：5min
2.5 挥发性风味化合物测定
采用气相色谱—质谱联用（GC–MS）对纳豆中挥发性风味化合物进行定性分析（Li et al., 2023a; Ma et al., 2025）。选择氘代苯乙烯（CAS: 19361–62–7）作为内标。以甲醇配制25 μg/mL内标溶液。简要操作如下：称取1 g切碎的纳豆于顶空瓶中，加入20 μL内标溶液。将涂有DVB/Carboxen/PDMS的固相微萃取（SPME）纤维暴露于60°C顶空30分钟。萃取后，将SPME纤维插入GC进样口，在260°C下热脱附5分钟。GC–MS分析在配备Agilent 5975质谱仪的Agilent 7890气相色谱仪上进行，使用Agilent HP−5MS Ultra Inert毛细管柱（19091S−433UI，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。高纯氦气（99.999%）作为载气，恒流模式流速1.0 mL/min，分流比25:1。柱温箱程序为：初始温度50°C保持5分钟；以7°C/min升至230°C并保持3分钟；再以40°C/min升至320°C并保持5分钟。质谱条件为：离子源温度240°C；四极杆温度160°C；电离电压70 eV；质量扫描范围m/z 50–500；全扫描（SCAN）模式采集。
【数据】内标：氘代苯乙烯25 μg/mL（甲醇配制），20μL/1g样品；SPME纤维：DVB/Carboxen/PDMS；萃取：60°C、30min；脱附：260°C、5min；载气：He（99.999%）、1.0mL/min、分流比25:1；升温程序：50°C/5min→7°C/min至230°C/3min→40°C/min至320°C/5min；离子源：240°C；四极杆：160°C；电离电压：70eV；扫描范围：m/z 50–500
2.6 非靶向代谢组学分析
#### 2.6.1 纳豆代谢物提取
将100 mg液氮研磨的纳豆样品转移至微量离心管中，加入500 μL 80%甲醇水溶液。
（原文节选至此中断，后续提取步骤原文未详述。）
【数据】样品量：100mg；提取溶剂：500μL 80%甲醇水溶液
研究结果
3.1 菌株进化分析与蛋白基因挖掘
#### 3.1.1 菌株基因组进化分析
基于目标菌株的蛋白质编码基因注释，OrthoFinder鉴定出4100个单拷贝直系同源蛋白质序列，从中筛选出154个差异保守序列。以这些蛋白质作为分子标记构建系统发育树，采用1000次bootstrap重抽样评估分支支持度。所得系统发育树清晰分辨了目标菌株的遗传分化模式。如图1所示，菌株CGMCC 34222和A9聚为不同的分支，各自在分支内表现出显著的系统发育独特性，提示两株菌具有不同的进化轨迹。
【数据】单拷贝直系同源序列：4100个；差异保守序列：154个；bootstrap：1000次
#### 3.1.2 潜在纤溶基因分析
基于KEGG的枯草芽孢杆菌蛋白质序列功能注释鉴定出19个蛋白酶相关功能基因，归属于多个蛋白酶家族，包括丝氨酸蛋白酶、ATP依赖性蛋白酶和信号肽酶（表3）。其中，与丝氨酸蛋白酶相关的基因包括wprA（细胞壁相关丝氨酸蛋白酶）、vpr（次要胞外丝氨酸蛋白酶）、sspA（谷氨酰内肽酶）、epr（次要胞外蛋白酶）、bpr（杆菌肽酶F）、aprX（丝氨酸蛋白酶AprX）和aprE（枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶）（Yao et al., 2020）。为阐明蛋白酶基因与纤溶功能的关系，研究鉴定出5个推定具有纤溶活性的候选基因：aprE、wprA、bpr、aprX和vpr。其中，aprE编码枯草芽孢杆菌主要的枯草杆菌蛋白酶样胞外丝氨酸蛋白酶，已被广泛表征并确认具有强纤溶活性，被认为是该物种纤溶作用的主要效应因子（Kada et al., 2014）。wprA编码细胞壁锚定蛋白酶，推测通过参与胞外基质蛋白的周转和重塑来间接促进纤维蛋白降解。此外，bpr、aprX和vpr编码胞外或胞内丝氨酸蛋白酶，可能通过与AprE协同，特异性识别和切割纤维蛋白肽键，形成协同蛋白水解网络，共同介导高效纤维蛋白降解（Guo et al., 2025; Meng et al., 2016）。KEGG功能注释结果系统揭示了枯草芽孢杆菌中蛋白酶基因的分布格局和功能多样性，进一步鉴定出与纤溶相关的核心候选基因。这些发现为后续关键基因的功能验证、重组蛋白的异源表达与纯化以及酶学性质表征提供了精确的分子靶标。配对基因组比较显示，枯草芽孢杆菌CGMCC 34222的aprX基因存在两个非同义替换，即R119G和A123G。如图2所示，结构建模表明两个替换均位于肽酶S8结构域内。这些序列变异可能影响AprX的局部构象或柔性，因此代表了可能与CGMCC 34222增强的蛋白水解/纤溶表型相关的候选分子标记。然而，该解释基于计算预测，未来研究应构建aprX敲除、互补和等位基因交换突变体，并比较纯化的野生型和突变型AprX蛋白的酶学性质。
【数据】蛋白酶相关基因：19个；候选纤溶基因：5个（aprE、wprA、bpr、aprX、vpr）；aprX非同义替换：R119G、A123G（位于肽酶S8结构域）
3.2 挥发性风味化合物差异
#### 3.2.1 风味化合物的种类与含量
为阐明枯草芽孢杆菌发酵对纳豆挥发性风味化合物（VFCs）组成和水平的调控作用，采用顶空固相微萃取—气相色谱—质谱联用（HS-SPME–GC–MS）对不同枯草芽孢杆菌发酵的纳豆样品进行定性和定量分析。未接种枯草芽孢杆菌的纳豆样品作为空白对照，为与发酵组比较提供基线。所有样品中共检测到390种VFCs，分为12大类。如图3所示，包括44种酮类、32种烷烃、27种酸类、27种烯烃、24种胺类、21种醛类、14种吡嗪类、10种酚类、5种醚类，以及56种归属于其他类别的化合物。进一步的差异分析显示，新鲜纳豆的特征挥发性风味化合物以吡嗪类、酯类和酮类为主，而未发酵大豆的特征挥发性化合物主要为醛类、胺类和醇类。采用外标校准方法，Xuejie Li等人鉴定出己醛、壬醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、2-庚酮和苯甲醛为大豆分离蛋白（SPI）中的主要气味活性化合物，其中己醛和壬醛主要塑造其气味特征（Li et al., 2023b）。该组成模式与本研究中观察到的纳豆风味化合物相对丰度一致。与未发酵对照相比，枯草芽孢杆菌发酵的纳豆中吡嗪类相对含量显著增加，这与Rahmawati等人报道的吡嗪类是纳豆中关键风味活性化合物的结论一致（Rahmawati et al., 2021）。与此同时，发酵样品中醛类和胺类的相对丰度显著降低，表明不良风味的形成可通过菌株代谢进行调控。值得注意的是，Zhang等人证明，将纳豆与动物双歧杆菌BZ25和枯草芽孢杆菌GUTU09共发酵可有效去除挥发性胺类，降低酮类和醛类水平，增加醇类含量，并降低苦味氨基酸的滋味活性值和生物胺浓度，从而全面改善纳豆风味和整体品质（Zhang et al., 2022）。
【数据】总检出VFCs：390种/12大类；酮类44种、烷烃32种、酸类27种、烯烃27种、胺类24种、醛类21种、吡嗪类14种、酚类10种、醚类5种、其他56种
#### 3.2.2 关键风味化合物
相对气味活度值（ROAV）是定量评估单个挥发性化合物对产品整体风味特征贡献的关键指标。其计算与风味影响直接相关：ROAV值越高，表明该化合物在定义样品特征风味中发挥的作用越突出。ROAV ≥ 1的化合物通常被视为关键气味活性物质，因为它们对风味特征做出直接且实质性的贡献，对塑造产品的独特感官属性至关重要。通过GC–MS挥发性谱图结合ROAV分析评估关键香气化合物。ROAV值根据GC–MS衍生的丰度数据和文献报道的气味阈值计算。因此，挥发性化合物主要依据相对香气贡献而非基于标准品的绝对浓度进行解释。其身份和浓度汇总于表4。在枯草芽孢杆菌CGMCC 34222发酵组、枯草芽孢杆菌A9发酵组和对照组中分别鉴定出9种、9种和10种关键气味活性化合物。在两个枯草芽孢杆菌发酵组中，新鲜纳豆的关键风味活性化合物均为吡嗪类衍生物——具体为2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪。吡嗪类是典型的低阈值气味物质，人类嗅觉系统在极低浓度下即可感知，被广泛认为是纳豆特征风味的主要贡献者。相比之下，1-辛烯-3-醇是未接种对照中的主要关键风味化合物。所有这些化合物的ROAV值均≥1，满足关键气味活性物质的判定标准，确认了它们在塑造各自纳豆风味特征中的核心作用。
【数据】关键气味活性化合物：CGMCC 34222组9种、A9组9种、对照组10种；关键风味化合物：2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪（ROAV≥1）；对照主要风味物：1-辛烯-3-醇
3.3 代谢物差异
#### 3.3.1 纳豆代谢物分析
为系统评估纳豆发酵过程中的代谢物变化，原文采用非靶向代谢组学方法进行分析。
（原文节选至此中断，后续代谢组学结果原文未详述。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
近年来关于纳豆及发酵大豆制品的多组学研究显示，微生物发酵可显著重塑氨基酸代谢、碳水化合物利用、脂质代谢、挥发性化合物形成和功能成分积累。以往研究多聚焦于大豆发酵过程中的代谢组学谱图、挥发性风味表征或特定功能指标中的某一方面。这些研究表明，发酵可增加游离氨基酸和小肽含量，促进吡嗪类香气化合物的形成，减少不良醛类和胺类气味成分，并改善发酵大豆制品的营养和功能特性。本研究通过比较基因组学、感官评价、GC–MS挥发性谱图分析和非靶向代谢组学，系统表征了枯草芽孢杆菌CGMCC 34222与工业菌株A9，阐明了纳豆"结构—功能—风味"一体化品质的调控基础。系统发育基因组学分析将两株菌置于不同的进化分支，具有显著的遗传分化，并鉴定出5个关键纤溶基因，包括aprE和wprA；值得注意的是，CGMCC 34222在候选丝氨酸蛋白酶AprX中携带非同义替换，可能作为其增强发酵性能的分子标记。更重要的是，本研究建立了用于鉴定优质纳豆发酵菌株的多维筛选框架。
编译者解读
本研究将基因组学与代谢组学数据串联成完整的菌株评价链条——从系统发育定位到候选基因挖掘，再到挥发性代谢物和差异代谢物的功能注释，为纳豆发酵菌株的理性筛选提供了可复用的方法论模板。尤其值得关注的是aprX基因中R119G和A123G两个非同义突变位点，尽管目前仍停留在计算预测层面，但为后续基因编辑验证提供了明确的靶点。从合成生物学视角看，若能在未来工作中通过基因编辑确认这两个位点对蛋白酶活性的功能贡献，将有望建立"基因型—酶学活性"的直接映射关系，进而推动纳豆菌株从经验筛选走向精准设计。本研究的局限在于感官评价人数有限，且aprX突变的表型效应尚需实验验证。
参考来源
Liu, H.-Q. (2026). Comparative metabolomics-based analysis and functional mechanisms of the natto fermentation process as regulated by Bacillus subtilis strains CGMCC 34222 and A9. Journal of Food Composition and Analysis. DOI: 10.1016/j.jfca.2026.109351
DOI: 10.1016/j.jfca.2026.109351