来源：Multidimensional omics evaluation of the feather hydrolysates produced by Bacillus subtilis natto as a safe and functional feed protein（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
羽毛角蛋白是畜牧业中产量巨大但利用率极低的蛋白质资源。本研究以食品级益生菌——枯草芽孢杆菌纳豆亚种直接水解完整鸡羽毛，在无菌自来水中6天内实现83.5%的降解率。研究者通过重组纳豆激酶证实了其角蛋白水解活性，并对水解产物进行了全面的安全性评估和功能解析。30天小鼠喂养实验结合肠道转录组、蛋白质组及16S rRNA微生物组分析，揭示了该水解物作为功能性饲料蛋白的潜力——不仅安全无毒性，还能增强肠道黏膜免疫、重塑肠道菌群。该策略以水为唯一培养基、无需额外营养补充，为羽毛废弃物的低成本资源化提供了可行路径。
研究背景
随着畜牧业的持续扩张，饲料蛋白质需求激增，而传统蛋白资源日益紧张。羽毛角蛋白作为家禽加工的副产物，年产量达数百万吨，却因其高度抗性结构——强疏水作用、广泛氢键及致密二硫键交联——而难以被常规酶解和加工利用。大量羽毛废弃物在环境中累积，造成严重的生态压力。物理化学方法（如蒸汽水解、碱处理）虽可将角蛋白转化为氨基酸水解物，但条件剧烈、能耗高，且可能破坏必需氨基酸，降低产品的营养价值。微生物降解及其角蛋白酶系统因此成为更具前景的替代路径。本研究考察了食品级益生菌枯草芽孢杆菌纳豆亚种是否能在无额外营养补充的条件下直接水解完整羽毛，并通过多维组学手段系统评估发酵产物作为安全功能性饲料蛋白的可行性。
研究方法
2.1 材料
羽毛购自中国泸州市场。枯草芽孢杆菌纳豆亚种（编号：CICC20639）购自上海微生物菌种保藏中心。偶氮酪蛋白、角蛋白天青及短链脂肪酸（SCFAs）标准品由Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）提供。用于定量免疫球蛋白A（IgA）的商业ELISA试剂盒，以及用于检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽、总胆红素、肌酐、超氧化物歧化酶（SOD）活性的生化检测试剂盒，分别购自Elabscience有限公司（中国武汉）和建成生物工程研究所（中国南京）。用于微生物基因组DNA提取的E.Z.N.A.® Stool DNA Kit为Omega Bio-tek（美国佐治亚州诺克罗斯）产品。靶向紧密连接蛋白（包括zonula occludens-1（ZO-1）、claudin-1和occludin）的一抗，以及荧光素偶联的二抗（FITC或Cy3），购自Servicebio有限公司（中国武汉）和Proteintech Group Inc.（美国伊利诺伊州罗斯蒙特）。除非另有说明，其余所有试剂均为分析纯，购自标准商业渠道。
【数据】菌株：B. subtilis natto CICC20639；试剂来源：Sigma-Aldrich、Elabscience、建成生物工程研究所、Omega Bio-tek、Servicebio、Proteintech；试剂级别：分析纯
2.2 枯草芽孢杆菌纳豆亚种降解羽毛
发酵前，鸡羽毛用自来水彻底清洗以去除可见污染物，再用蒸馏水冲洗、干燥，并经高压灭菌处理。灭菌后的羽毛以完整形态使用，未粉碎为羽毛粉。枯草芽孢杆菌纳豆亚种先在5 mL Luria-Bertani（LB）肉汤中于30°C过夜培养。细胞经离心收集，用无菌水洗涤三次，随后接种至含200 mL高压灭菌自来水并添加5 g完整羽毛的1 L烧瓶中。选择2.5%（w/v）的底物浓度，该浓度常用于微生物角蛋白降解研究，已被证明能有效支持微生物生长和酶活性，同时确保底物在水性体系中完全悬浮。培养物在30°C下持续振荡孵育，直至羽毛降解完成。通过指定时间点在LB琼脂平板上计数菌落形成单位（CFUs）监测含羽毛培养基中的细菌增殖。定量胞外蛋白水解活性前，培养液在4°C下以13,400×g离心15 min，收集无细胞上清液用于分析。蛋白水解活性以偶氮酪蛋白为底物进行定量：100 μL培养上清液与等体积0.5%（w/v）偶氮酪蛋白溶液混合，在50°C孵育30 min。一个蛋白酶活性单位（U）定义为在测定条件下每分钟在335 nm处产生0.01吸光度增加值所需的酶量。发酵结束后，培养液在4°C下以13,400×g离心15 min，将不溶性组分（包括残留羽毛材料、角蛋白来源颗粒和细菌细胞）与可溶性上清液分离。上清液分为两份等分试样。一份用于使用自动氨基酸分析仪（Hitachi，日本）进行游离氨基酸分析。另一份用于LC-MS肽段分析——先经0.22 μm膜过滤，再通过10 kDa分子量截留离心过滤器超滤以富集低分子量肽段，最后用C18固相萃取脱盐。肽段组分以含0.1%甲酸的50%乙腈洗脱，真空离心干燥后复溶于0.1%甲酸，在Thermo Fisher Scientific平台上进行LC-MS分析。不溶性组分经洗涤、冻干，使用扫描电子显微镜（SEM；JEOL，日本）观察。
【数据】底物浓度：2.5%（w/v）完整羽毛；培养基：无菌自来水；温度：30°C；离心条件：13,400×g，15 min，4°C；蛋白酶活性测定：100 μL上清液+等体积0.5%偶氮酪蛋白，50°C，30 min，A335nm；超滤截留：10 kDa；SEM：JEOL
2.3 重组纳豆激酶的制备及角蛋白水解活性测定
通过菌落PCR从枯草芽孢杆菌纳豆亚种基因组中分离纳豆激酶编码序列，连接至pET22b表达载体的NdeI和XhoI限制性酶切位点之间。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行重组蛋白表达。转化细胞在含50 μg/mL氨苄青霉素的LB肉汤中于37°C培养。当OD600达到0.8时，加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.4 mM诱导表达，随后在20°C下孵育30 h。收获细胞后重悬于磷酸盐缓冲液（pH 7.2），在冰上超声裂解。为便于纯化，澄清上清液先在50°C热处理1 h，使重组蛋白酶降解宿主自身蛋白。目标蛋白随后用Ni²⁺-螯合Sepharose Fast Flow柱（GE Healthcare，瑞典乌普萨拉）纯化。经50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）透析去除咪唑后，通过SDS-PAGE评估重组纳豆激酶的纯度。评估纯化重组纳豆激酶降解天然羽毛角蛋白的能力。该测定涉及将完整羽毛与酶在37°C、含0.5% β-巯基乙醇（β-ME）的溶液中孵育。水解过程中羽毛的逐步结构破坏用Nikon数码相机拍照记录。
【数据】表达载体：pET22b；宿主菌：E. coli BL21(DE3)；氨苄青霉素：50 μg/mL；诱导：0.4 mM IPTG，20°C，30 h；热纯化：50°C，1 h；纯化：Ni²⁺柱；缓冲液：50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）；酶解条件：37°C，0.5% β-ME
2.4 动物与饲养实验
4周龄雄性C57BL/6J小鼠购自腾鑫生物技术有限公司（中国重庆），适应期一周，可自由获取标准饲料（泸州科阳生物技术有限公司）和水。饲养条件维持在24 ± 1°C、相对湿度55 ± 10%、12小时明暗循环。所有操作均在西南医科大学动物中心（中国泸州）进行。适应期结束后，动物随机分为三组（每组n = 9）：对照组（Ctrl）喂食标准饲料；低剂量组（FH-L）喂食添加0.25%（w/w）羽毛水解物的饲料；高剂量组（FH-H）喂食添加2.5%（w/w）羽毛水解物的饲料。补充饲料的配制方法为：将完全降解羽毛的发酵培养基冻干制成水解物粉末，再掺入标准饲料中。各饲料蛋白质含量经相应调整，使总蛋白水平与对照饲料一致。30天饲养方案结束后，采集新鲜粪便样本用于微生物组分析。随后通过麻醉过量处死小鼠，收集血清和主要器官用于生化检测和组织学评估。
【数据】小鼠品系：C57BL/6J；周龄：4周龄；性别：雄性；饲养条件：24 ± 1°C，湿度55 ± 10%，12 h光暗循环；分组：Ctrl / FH-L（0.25% w/w）/ FH-H（2.5% w/w）；每组n = 9；喂养周期：30天
2.5 生化因子测定
IgA、总胆红素、MDA、肌酐和GSH的浓度，以及SOD和ALT的酶活性，均使用市售检测试剂盒严格按照制造商方案进行定量。
【数据】检测指标：IgA、总胆红素、MDA、肌酐、GSH、SOD、ALT；方法：市售试剂盒
2.6 苏木精-伊红染色
组织学评估中，样本用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切成4 μm厚切片。苏木精-伊红（H&E）染色后，使用Motic BA210数码显微镜系统（中国）评估并记录组织形态。
【数据】切片厚度：4 μm；固定：10%中性缓冲福尔马林；观察：Motic BA210
2.7 免疫荧光分析
免疫荧光染色用于表征紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1和occludin的空间分布和表达，按照既有方案进行。简言之，组织切片经多聚甲醛固定、乙醇冲洗并处理进行抗原修复。为减少非特异性结合，样本用牛血清白蛋白封闭……
【数据】检测蛋白：ZO-1、claudin-1、occludin；方法：免疫荧光染色；封闭：牛血清白蛋白
研究结果
3.1 枯草芽孢杆菌纳豆亚种在羽毛降解中的角蛋白水解性能
为获得无需提取、纯化或灭菌等额外加工步骤即可直接应用于饲料工业的羽毛水解物，本研究考察了枯草芽孢杆菌纳豆亚种在无菌自来水中对完整羽毛的角蛋白水解潜力。如图1A所示，接种枯草芽孢杆菌纳豆亚种后羽毛发生显著降解。除羽根和羽轴外，其余羽毛结构在6天内完全降解。在无菌自来水中，枯草芽孢杆菌纳豆亚种对完整羽毛的降解率达83.5%，高于LB培养基中的59.9%（数据未显示）。降解过程中，细菌生物量增加，CFU计数反映该菌能以羽毛为唯一碳源和氮源（图1B）。在含羽毛的水中细菌生长过程中，胞外蛋白水解活性稳步上升。
纳豆激酶（NK）是枯草芽孢杆菌纳豆亚种分泌的主要胞外蛋白酶之一。其纤溶活性已被充分表征，但该酶在该菌株羽毛角蛋白降解中的潜在贡献尚不清楚。为此，本研究在分子水平上考察NK——在大肠杆菌中异源表达并纯化重组酶至表观均一（图1C）。以角蛋白天青为底物，重组NK表现出明显的角蛋白水解活性（图1D）。在还原剂β-巯基乙醇（β-ME）存在下，重组NK在24 h内完全降解了完整羽毛（图1E）。综上，这些结果表明枯草芽孢杆菌纳豆亚种是一种角蛋白分解菌，其编码的NK具有显著的角蛋白水解活性。
【数据】降解率：无菌自来水83.5%，LB培养基59.9%；降解时间：6天（完整羽毛）；重组NK+β-ME完全降解时间：24 h；底物：完整羽毛（未粉碎）
3.2 枯草芽孢杆菌纳豆亚种发酵产生的羽毛水解物分析
羽毛水解物的不溶性组分经SEM检查。如图2A所示，最终水解物含有大量无定形角蛋白残渣，以及大量枯草芽孢杆菌纳豆亚种细胞。与本课题组此前关于地衣芽孢杆菌WHU产生规则角蛋白纳米/微粒的报道一致，枯草芽孢杆菌纳豆亚种水解物中也观察到类似颗粒结构（图2A右图）。
可溶性组分用自动氨基酸分析仪表征。共鉴定出15种游离氨基酸，其中酪氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸含量最高（表1）。水解物中检测到的氨基酸水平比未发酵的对照羽毛培养基高出数个数量级。同时，枯草芽孢杆菌纳豆亚种介导的羽毛降解过程中，发酵液中可溶性蛋白和肽段含量显著增加（图2B）。为进一步表征肽段组成，对水解物进行了LC-MS分析。检测到超过5000条短肽，其序列见表S1。鉴定到的肽段长度为5至30个氨基酸，其中五肽为最优势类别（图2C）。值得注意的是，肽段组成分析显示所有20种蛋白氨基酸均存在，其中亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和甘氨酸最为丰富（图S1）。通过生物信息学预测工具评估羽毛水解物中肽段的推定生物活性和功能角色。如表S1所总结，大量肽段被预测具有血管紧张素转换酶（ACE）抑制、糖苷酶抑制、抗氧化、抗炎和抗菌活性。与早期研究中从细菌来源羽毛水解物中鉴定并生化表征抗氧化、抗高血压和抗菌肽的结果一致，这些结果表明枯草芽孢杆菌纳豆亚种产生的水解物是挖掘生物活性肽的宝贵资源。基于现有数据库的功能注释进一步表明，这些肽段可能参与细胞连接组装、细胞间连接组织、紧密连接调控以及多种转运和代谢过程（图2D-G）。综上，枯草芽孢杆菌纳豆亚种发酵获得的羽毛水解物是游离氨基酸、潜在生物活性短肽、角蛋白纳米/微粒和益生菌细胞的复杂混合物，支持其作为饲料工业替代蛋白源的潜在应用。
【数据】游离氨基酸：15种；主要氨基酸：酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸；肽段总数：>5000条；肽段长度：5-30 aa；优势肽段：五肽；主要氨基酸组成：亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甘氨酸；预测活性：ACE抑制、糖苷酶抑制、抗氧化、抗炎、抗菌
3.3 羽毛水解物作为饲料蛋白的生物安全性分析
枯草芽孢杆菌纳豆亚种产生的羽毛水解物的生物安全性在小鼠模型中进行了评估。如图3A所示，低剂量（FH-L）和高剂量（FH-H）水解物组的体重与对照组（Ctrl）无明显偏差，说明在饲料中用这些水解物替代乳酪蛋白不影响生长参数。H&E染色的组织病理学检查显示，一个月水解物补充喂养后主要器官未见明显异常（图3B）。血清生化标志物——包括ALT、MDA、GSH、总胆红素、肌酐和SOD——在水解物处理组和对照组之间保持相当水平（图3C）。这些观察强调了使用水解物作为饲料蛋白替代品时不存在有害影响。
值得注意的是，FH-H组（2.5%水解物）的血清IgA水平较对照组显著升高，提示对宿主具有免疫刺激作用。鉴于口服摄入的羽毛水解物直接与胃肠道接触，进一步研究其对肠道完整性的影响。组织学分析证实羽毛水解物补充不改变肠道组织形态（图3B）。此外，通过检查紧密连接蛋白表达评估肠道屏障功能。免疫荧光分析显示，两个羽毛水解物处理组中Claudin-1、Occludin和ZO-1的表达水平与对照组相当（图3D）。综上，这些发现证实饲料中添加羽毛水解物对肠道健康或屏障完整性无不良影响。
【数据】分组：Ctrl / FH-L（0.25% w/w）/ FH-H（2.5% w/w）；喂养时间：30天；检测：体重、H&E组织学、ALT、MDA、GSH、总胆红素、肌酐、SOD、IgA、紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）
3.4 羽毛水解物对宿主肠道转录组的影响
通过RNA测序研究羽毛水解物补充后小鼠肠道组织的转录组变化。主成分分析（PCA）显示高剂量水解物组（FH-H）与对照组之间存在明显分离，反映基因表达谱的显著差异（图4A）。与对照组相比，FH-L组有157个基因上调和115个基因下调，而FH-H组分别有572个和308个差异表达基因（图4B）。
这些发现表明羽毛水解物诱导的转录组修饰呈剂量依赖性。鉴于高剂量组观察到更显著的变化，后续分析聚焦于FH-H组与对照组之间的比较。FH-H组差异表达基因通过火山图可视化（图4C）。编码D位点白蛋白启动子结合蛋白的Dbp基因是最显著下调的基因，Dbp参与调控与营养和外源物代谢相关基因的表达。Nfil3被鉴定为最显著上调的基因，Nfil3调控肠道固有淋巴样细胞（ILCs）的发育、调节上皮屏障完整性，并……
【数据】差异表达基因：FH-L组157个上调/115个下调；FH-H组572个上调/308个下调；最显著下调基因：Dbp；最显著上调基因：Nfil3
讨论与解读
羽毛角蛋白是一种未充分利用的蛋白质资源，在动物营养领域具有巨大潜力。羽毛角蛋白的实际增值利用不仅需要生物有效性，还需要工艺效率和可制造性。本研究中，枯草芽孢杆菌纳豆亚种以水为唯一培养基实现了完整鸡羽毛的高效转化，无需额外营养补充。在温和发酵条件下6天内实现显著羽毛降解。与传统化学或热解法水解相比，该生物过程降低了能耗并消除了危险试剂的使用。简化的产物组成和直接掺入饲料配方所需的下游处理极少。工业放大时，关键工程考量包括在较大生物反应器中维持充分混合和传质以确保细菌与羽毛底物的均匀接触，以及实施稳健的质量控制以标准化角蛋白水解效率和水解物的生物活性组成。综合而言，低成本底物、简化工作流程和温和工艺条件为规模化生产提供了可行基础，值得未来进行中试验证的技术经济评估和工艺优化。尽管因实验条件差异（羽毛类型、浓度、预处理、孵育时间等）直接比较存在复杂性……
编译者解读：该研究的核心价值在于将"益生菌发酵"与"废弃物资源化"两个合成生物学应用方向巧妙结合——以水为唯一培养基的设计大幅降低了生产成本，而食品级菌株的身份则天然规避了产物安全性审查中的许多障碍。从方法选择看，研究者采用重组酶验证机制与多组学安全性评估的组合策略，既回答了"为什么能降解"的基础科学问题，也提供了"是否安全可用"的应用证据。值得关注的是，该工艺未涉及菌株工程改造，肽段功能预测也尚停留在生物信息学层面——后续若能通过启动子工程或信号肽优化提升角蛋白酶分泌效率，或对预测的功能肽进行实验验证，将进一步提升该技术的经济价值和科学深度。
参考来源
期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2026
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.153782
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.153782