来源：High-level expression of a newly characterized collagenase in Bacillus subtilis for efficient production of collagen peptides from fish scales（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
胶原酶可水解胶原蛋白产生生物活性肽，但低活性限制了其工业应用。本研究利用深度学习工具CLEAN和DLKcat从海量序列中筛选出新型胶原酶LsCol，并通过启动子、RBS及Sec分泌途径多维度工程改造，在枯草芽孢杆菌中实现高达21,080.6 U/mL的细胞外胶原酶活性。该酶对鱼鳞胶原降解效率优异，可生成大量低分子量胶原肽及功能性二肽/三肽，为鱼鳞生物 valorization 提供了完整解决方案。
研究背景
胶原酶（EC 3.4.24.3）能够切割胶原蛋白重复序列Gly-X-Y中Y-Gly肽键，其中X和Y主要为脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp）。微生物来源胶原酶因具有额外结构域、宽底物特异性和高效降解胶原为生物活性肽的能力，是生产胶原肽的理想工具。已有多个微生物胶原酶被表征，如溶组织梭菌、哈维弧菌等，但新型胶原酶仍有待发掘。近年来，基于深度学习的计算工具显著加速了酶发现进程——CLEAN相比BLASTp具有更高的EC注释准确性，DLKcat整合图神经网络与卷积神经网络预测酶-底物相互作用，为高效酶筛选提供了强有力支撑。鱼类加工过程中约50%的副产物（如鱼鳞）富含胶原蛋白，是制备胶原肽的优质原料。
研究方法
2.1 实验材料、引物、菌株与质粒
明胶、Pz肽和酪蛋白购自Sigma-Aldrich（美国）。牛跟腱I型胶原蛋白购自Worthington Biochemical（美国）。脱矿尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）鱼鳞购自SEMNL（中国）。Gly-Pro-Hyp由QYAOBIO（中国）合成。本研究所用引物列于表S1。大肠杆菌DH5α作为克隆和质粒构建宿主菌。枯草芽孢杆菌1A751用于重组蛋白表达。枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pMA5作为表达载体。源自pDL的质粒pDA用作伴侣蛋白和转运蛋白过表达的整合载体。
【数据】菌株：E. coli DH5α、B. subtilis 1A751；质粒：pMA5、pDA；材料来源：Sigma-Aldrich、Worthington Biochemical、SEMNL、QYAOBIO
2.2 数据库中胶原酶的虚拟筛选
使用Peptidase M9结构域（Pfam：PF01752）针对UniRef100数据库中的微生物蛋白进行HMM搜索（http://hmmer.org/），获得21,499条序列。随后使用CLEAN去除未分配给EC 3.4.24.3的蛋白质，数据集缩减至20,034个候选序列。使用CD-HIT以75%序列同一性阈值进行聚类，获得996条非冗余序列用于下游分析。这些序列使用DLKcat进行虚拟筛选，以估计其对胶原基序肽（Gly-Pro-Hyp）3的催化效率。候选酶的氨基酸序列和（Gly-Pro-Hyp）3的SMILES表示作为输入，在默认模型设置下预测kcat值。排名前150的序列用于构建最大似然系统发育树和序列相似性网络（比对分数：200）。最终，基于预测催化效率、SSN簇代表性和系统发育多样性的组合选出15个候选酶。基因经合成后使用pMA5载体在枯草芽孢杆菌中表达。重组菌株在Super Rich培养基中于37°C、220 rpm培养48小时，测定培养上清的胶原酶活性。
【数据】HMM搜索序列数：21,499条；CLEAN筛选后：20,034条；CD-HIT聚类后：996条；聚类阈值：75%序列同一性；培养条件：37°C、220 rpm、48h；培养基：Super Rich
2.3 摇瓶培养条件
对于蛋白表达，重组枯草芽孢杆菌菌株在含5 mL LB培养基的50-mL摇瓶中于37°C、220 rpm培养12小时。随后将培养物接种至含5 mL Super Rich（SR）培养基（15 g/L胰蛋白胨、25 g/L酵母提取物、3 g/L K2HPO4，pH 7.2）的50-mL摇瓶中，于37°C、220 rpm培养48小时。根据需要添加抗生素（50 μg/mL卡那霉素和5 μg/mL氯霉素）。当需要诱导时，在OD600达到0.8-1.0时加入2%（w/v）麦芽糖、2%（w/v）木糖或1 mM IPTG。
【数据】培养基：LB、SR（15 g/L胰蛋白胨、25 g/L酵母提取物、3 g/L K2HPO4，pH 7.2）；温度：37°C；转速：220 rpm；时间：12h/48h；抗生素：50 μg/mL卡那霉素、5 μg/mL氯霉素；诱导剂：2%麦芽糖、2%木糖、1mM IPTG；诱导时机：OD600 0.8-1.0
2.4 枯草芽孢杆菌中LsCol表达元件优化
编码LsCol的基因（UniProt ID：UPI00104C2DC9）克隆至pMA5载体，获得表达质粒pMA5-lscol。选取12个启动子（包括9个组成型和3个诱导型）用于胶原酶表达。启动子片段Phag、PSpovG、PamyE、PgsiB、PftsZ、Phbs、PsodA和PfusA从枯草芽孢杆菌1A751基因组DNA扩增。P43、Pgrac和Pxyl分别从pWB980、pHT43和pAX01质粒扩增。Pglv从枯草芽孢杆菌1A751基因组扩增，定点突变按前述方法进行。所得产物转化至大肠杆菌DH5α，阳性克隆经测序验证。原始质粒pMA5-lscol转化至枯草芽孢杆菌1A751获得菌株BC0。携带启动子Phag、PSpovG、PamyE、PgsiB、PftsZ、Phbs、PsodA、P43、PfusA、Pglv、Pgrac和Pxyl的质粒分别转化至枯草芽孢杆菌1A751，产生重组菌株BC1-BC12。
为研究核糖体结合位点对LsCol表达的影响，使用在线工具RBS Calculator v2.0（https://salislab.net/software/）预测翻译强度。从转录起始位点到核糖体结合位点的序列作为恒定上游区域输入，连同初始RBS序列和CDS序列一起提交。选择RBS Calculator（设计模式），以枯草芽孢杆菌作为生物体。随后，将pMA5-Pglv-lscol中的初始RBS序列替换为设计序列并转化至枯草芽孢杆菌1A751，产生菌株BC13至BC20。
整合质粒pDA用于过表达Sec途径相关基因。基因（dnaK、csaA、prsA、ftsY、hbs、ffh、scr、secA、secDF、secE、secG、secY）和基因操纵子（groESL、SRP、secYEG）使用相应引物从枯草芽孢杆菌1A751基因组DNA扩增。groESL由groES和groEL组成。secYEG和SRP为人工基因操纵子。secYEG包含基因secY、secE（含其RBS）和secG（含其RBS），而SRP包含基因ffh、hbs（含其RBS）和scr。片段使用Gibson Assembly连接至pDA骨架片段。所需质粒使用限制性内切酶AhdI线性化并整合至枯草芽孢杆菌1A751基因组。将pMA5-Pglv-RBS5-lscol转化至所得菌株（BC21-BC35）。重组菌株在SR培养基中于37°C、220 rpm培养48小时，测定培养上清的胶原酶活性。
【数据】启动子数量：12个（9组成型+3诱导型）；整合基因：dnaK、csaA、prsA、ftsY、hbs、ffh、scr、secA、secDF、secE、secG、secY、groESL、SRP、secYEG；工具：RBS Calculator v2.0；酶：AhdI；培养条件：37°C、220 rpm、48h
2.5 胶原酶活性测定与蛋白浓度测定
胶原酶活性使用比色茚三酮法测定，以L-甘氨酸为标准品。简要步骤为：100 μL酶溶液与100 μL 2%（w/v）明胶底物混合，在45°C、50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）中孵育10分钟。加入三氯乙酸（200 μL，1.25 M）终止反应。4°C下12,000 rpm离心10分钟后，取20 μL上清与100 μL茚三酮试剂混合，在沸水浴（100°C）中孵育20分钟。冷却至室温（22°C）后，加入500 μL 50%正丙醇，测定OD600处吸光度。使用不同浓度的甘氨酸溶液按照相同程序构建标准曲线。一个酶活性单位定义为每分钟从明胶中释放1 μg甘氨酸所需的酶量。蛋白浓度使用Lowry法测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白。
【数据】底物：2%（w/v）明胶；缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）；温度：45°C；反应时间：10min；终止剂：1.25M三氯乙酸200 μL；离心：12,000 rpm、4°C、10min；显色：100°C沸水浴20min；检测波长：OD600；酶活单位定义：每分钟释放1 μg甘氨酸
2.6 补料分批发酵与LsCol纯化
补料分批发酵在5 L发酵罐（百仑生物科技有限公司，中国上海）中进行。菌株在SR培养基中于37°C、220 rpm培养12小时。种子培养物接种至2 L SR培养基。当OD600达到10时，补加补料液I（500 g/L麦芽糖）至终浓度20 g/L麦芽糖。当初始麦芽糖浓度低于5 g/L时，补加补料液I至终浓度20 g/L。补料液II含15 g/L胰蛋白胨、25 g/L酵母提取物、3 g/L K2HPO4和26 g/L NaH2PO4·2H2O，接种后以4至15 mL/L/h的递增速率添加12小时，然后维持15 mL/L/h直至发酵结束。pH维持在7.0，用30% H₃PO₄和5 M KOH调节。搅拌速度在400至800 rpm之间自动调节，维持溶解氧为30%，通气速率恒定为1 vvm。残留麦芽糖使用还原糖含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，中国北京）测定。上清液用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）透析后上样Q-Sepharose Fast Flow柱。使用5步梯度洗脱。
【数据】发酵罐：5 L；培养基：SR；接种量：2 L；补料液I：500 g/L麦芽糖（终浓度20 g/L）；补料液II：15 g/L胰蛋白胨、25 g/L酵母提取物、3 g/L K2HPO4、26 g/L NaH2PO4·2H2O；补料速率：4-15 mL/L/h；pH：7.0；搅拌：400-800 rpm；溶解氧：30%；通气：1 vvm；时间：12h种子培养
研究结果
3.1 新型胶原酶在枯草芽孢杆菌中的筛选与表达
使用基于深度学习的CLEAN和DLKcat工具筛选候选胶原酶后（图1A），为排名前150的预测胶原酶构建了序列相似性网络分析和最大似然系统发育树（图1B和图S1）。从不同簇中选取15个胶原酶在枯草芽孢杆菌中表达，其中6个表现出可检测的胶原酶活性，包括来自类芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）的LsCol（UniProt ID：UPI00104C2DC9）（38.1 U/mL）、CpCol（20.8 U/mL）、SspCol（13.0 U/mL）、UcCol（9.3 U/mL）、CsCol（7.3 U/mL）和SsCol（2.3 U/mL）。为进一步评估其水解性能，将这些胶原酶用于水解鱼鳞（1000 U/g，6小时）。LsCol产生了最高的CTP和GPH产率，分别为16.3%和4.54%，CpCol分别为12.5%和3.23%（表S2）。因此，选择LsCol进行进一步优化。
BLAST分析显示，LsCol与蜡状芽孢杆菌胶原酶的氨基酸序列同一性最高，为72%，其次与Hathewaya histolytica胶原酶ColG为45.2%，与产气荚膜梭菌胶原酶ColA为45%。保守结构域搜索显示，LsCol由N端信号肽、前肽、肽酶家族M9 N端结构域、肽酶家族M9结构域、胶原酶G催化辅助结构域、多囊肾病（PKD）样结构域和两个细菌前肽酶C端（PPC）结构域组成（图1C）。锌结合基序HEXXH（肽酶家族M9的典型基序）在LsCol中高度保守。因此，LsCol可归类为肽酶家族M9的胶原酶。
【数据】活性筛选：LsCol 38.1 U/mL、CpCol 20.8 U/mL、SspCol 13.0 U/mL、UcCol 9.3 U/mL、CsCol 7.3 U/mL、SsCol 2.3 U/mL；鱼鳞水解：1000 U/g、6h；LsCol产CTP 16.3%、GPH 4.54%；CpCol产CTP 12.5%、GPH 3.23%；序列同一性：与B. cereus 72%、与ColG 45.2%、与ColA 45%
3.2 枯草芽孢杆菌中LsCol的启动子和RBS优化
为筛选适合LsCol表达的启动子，评估了12个启动子。经48小时摇瓶培养后，重组菌株BC10、BC11和BC12分别产生1290.9、744.6和511.7 U/mL的胶原酶活性（图2A）。所有含诱导型启动子的菌株均表现出高于组成型启动子菌株（20.3-180.6 U/mL）的胶原酶活性。菌株BC10（pMA5-Pglv-lscol）表现出最高活性1290.9 U/mL，是含PHapII启动子的菌株BC0（38.1 U/mL）的33.9倍。因此，使用质粒pMA5-Pglv-lscol进行进一步优化。
选择8个计算的翻译起始速率范围为1.87至23.53 au×10⁵（相当于原始序列的0.4至4.9倍）的核糖体结合位点序列，用于替换质粒pMA5-Pglv-lscol中的天然RBS（表S3）。菌株BC13-BC20分别产生822.3、1505.0、1709.3、1746.8、1802.9、1720.0、1560.3和1316.8 U/mL的胶原酶活性，表明除BC13外的RBS工程均提高了酶活性（图2B）。值得注意的是，胶原酶活性随翻译起始速率增加而升高，但当强度超过最佳水平后下降。其中，菌株BC17产生最高活性1802.9 U/mL，较菌株BC10提高了1.4倍（图2B）。
全因子回归模型显示，启动子和RBS是影响枯草芽孢杆菌蛋白表达水平的最重要因素。诱导型启动子将细胞生长与目标蛋白表达解偶联，从而减少枯草芽孢杆菌早期细胞生长阶段异源蛋白生产相关的代谢负担和细胞毒性。本研究中，含诱导型启动子（如Pglv、Pgrac和Pxyl）的菌株比含组成型启动子（包括Phag、PSpovG、PamyE、PgsiB、PftsZ、Phbs、PsodA、P43和PfusA）的菌株产生更高的LsCol胶原酶活性（图2A）。Pglv启动子已被广泛用作枯草芽孢杆菌中的有效表达元件。Pglv对人成纤维细胞生长因子的表达高于PHapII，但对蔗糖异构酶的表达低于组成型启动子，表明最佳启动子取决于特定表达系统。此外，麦芽糖作为Pglv启动子的安全诱导剂，增强了该系统在食品工业中应用的适用性。
RBS的序列特征可通过影响mRNA二级结构的形成和翻译起始区的可及性来影响翻译效率。RBS文库的构建劳动密集且缺乏通用性。为解决这些限制，开发了RBS Calculator和RBS Designer等算法。使用RBS calculator生成的序列已显著改善了蛋白谷氨酰胺酶和二乙酰壳二糖脱乙酰酶的表达。本研究中，RBS calculator指导的RBS优化将LsCol表达从1290.9提升至1802.9 U/mL（图2B）。随着预测翻译起始速率的增加，酶活性先升高后下降。较高起始速率下出现的这种反向趋势可能归因于mRNA上的核糖体碰撞干扰了有效翻译。
【数据】BC10活性：1290.9 U/mL；BC11：744.6 U/mL；BC12：511.7 U/mL；组成型启动子范围：20.3-180.6 U/mL；BC10/BC0倍数：33.9倍；RBS速率范围：1.87-23.53 au×10⁵（0.4-4.9倍）；BC13-BC20活性：822.3、1505.0、1709.3、1746.8、1802.9、1720.0、1560.3、1316.8 U/mL；BC17提升倍数：1.4倍
3.3 过表达Sec途径组分增强LsCol产量
为进一步提高LsCol表达，在枯草芽孢杆菌1A751中分别过表达Sec途径组分基因（dnaK、csaA、prsA、ftsY、hbs、ffh、scr、secA、secDF、secE、secG、secY）和基因操纵子（groESL、SRP、secYEG）。经48小时摇瓶培养后，过表达groESL（BC24）、ftsY（BC25）、hbs（BC26）、secDF（BC31）、secE（BC32）、secY（BC34）和secYEG（BC35）的菌株分别产生2177.2、1903.2、2048.3、1962.3、1967.7、2067.1和2526.5 U/mL的细胞外胶原酶活性（图2C）。其中，BC35（secYEG）产生最高活性2526.5 U/mL，较菌株BC17提高了1.4倍。
为进一步评估secYEG过表达的效果，对BC17和BC35经48小时摇瓶培养后的LsCol胞内和胞外分布进行了分析（图S2）。过表达secYEG的菌株BC35较BC17表现出更低的胞内LsCol水平和更高的胞外LsCol水平（图S2A）。密度分析进一步证实，胞外LsCol比例从BC17的37.5%增加至BC35的56.5%，而胞内LsCol比例相应降低（图S2B）。这些结果表明secYEG过表达促进了LsCol的分泌。
Sec途径是枯草芽孢杆菌中蛋白质分泌的主要途径。已有研究表明secYEG过表达可提高人成纤维细胞生长因子和α-淀粉酶等目标蛋白的产量。SecYEG复合物（由SecY、SecE和SecG组成）是Sec转位酶系统的关键组分，是蛋白质跨细菌质膜转运的核心机器。其过表达可能增强目标蛋白的胞外转运，从而减少胞内积累、代谢负担和细胞毒性。过表达secY或secE分别使LsCol活性提高14.7%或9.1%，而SecYEG实现了40.1%的提升。在所测试的分泌组分中，过表达人工操纵子secYEG获得了最高的细胞外胶原酶活性（2526.5 U/mL）（图2C）。这些结果表明，Sec途径组分的协调表达对于枯草芽孢杆菌中蛋白质的高效分泌至关重要，特别是对于SecYEG等复合物。
【数据】BC24（groESL）：2177.2 U/mL；BC25（ftsY）：1903.2 U/mL；BC26（hbs）：2048.3 U/mL；BC31（secDF）：1962.3 U/mL；BC32（secE）：1967.7 U/mL；BC34（secY）：2067.1 U/mL；BC35（secYEG）：2526.5 U/mL；BC35/BC17倍数：1.4倍；胞外比例变化：37.5%→56.5%；secY单过表达提升：14.7%；secE单过表达提升：9.1%；secYEG提升：40.1%
3.4 补料分批发酵与LsCol纯化
【数据】原文未详述
3.5 LsCol的酶学性质表征
【数据】原文未详述
3.6 LsCol对胶原蛋白的切割位点分析
【数据】原文未详述
3.7 LsCol高效生产鱼鳞来源的CTP和GPH
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过深度学习工具从海量序列中高效筛选出新型胶原酶LsCol，结合启动子工程、RBS工程和Sec途径工程三种策略，实现了枯草芽孢杆菌中胶原酶的高水平分泌表达。补料分批发酵中细胞外胶原酶活性达到21,080.6 U/mL。LsCol在45°C和pH 7.5条件下表现出最佳活性，能有效水解明胶和Pz肽。鱼鳞水解物的切割位点分析表明，LsCol优先切割鱼胶原特征性Gly-Pro-Hyp重复单元内的Hyp-Gly肽键。LsCol能高效降解鱼鳞胶原为低分子量肽（<500 Da占73.0%），CTP和GPH产率分别为26.5%和5.75%。
编译者解读
该研究展示了计算驱动酶挖掘与经典菌株工程相结合的巨大潜力——先用AI工具从两万余条序列中锁定目标，再用"启动子-核糖体结合位点-分泌途径"三板斧将酶活从38.1 U/mL推高至21,080.6 U/mL，提升了550余倍。值得注意的是，研究团队并未止步于酶产量，而是将产物应用于真实鱼鳞底物，并量化了功能性胶原肽的产率。这种从"酶发现-表达优化-应用验证"的完整闭环是合成生物学产业化的典范路径。局限在于，LsCol对完整不溶性胶原的降解效率及多尺度放大生产的稳定性仍需进一步验证。
参考来源
Li Y. High-level expression of a newly characterized collagenase in Bacillus subtilis for efficient production of collagen peptides from fish scales. Food Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.150249
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.150249