来源：Enhancing thermotolerance of Aspergillus niger for sodium gluconate production by combining metabolic engineering and fermentation process optimization（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
葡萄糖酸钠生产依赖黑曲霉的旺盛代谢活动，但反应放热带来的热胁迫严重制约了生产效率。本研究采用无DNA的CRISPR-Cas9技术构建了pyrG*营养缺陷型底盘菌株，并在该位点整合表达来源于酵母的AMP脱氨酶基因（amd），获得耐热性能显著提升的COE-AMD菌株。45°C条件下，该菌株在66小时内产出311.5 g/L葡萄糖酸钠，产率较野生型提高1.6倍。整合多组学分析揭示了氨同化增强驱动的系统代谢重编程机制，并据此通过补充铵盐进一步放大了菌株的生产优势。
研究背景
黑曲霉是工业葡萄糖酸生产的核心菌株，其生产依赖于葡萄糖氧化酶（GOD）和过氧化氢酶（CAT）组成的双酶系统。发酵过程中，NaOH作为中和剂维持pH约5.5，将葡萄糖酸转化为葡萄糖酸钠。然而，快速催化反应与中和过程产生的热胁迫严重影响菌株代谢活性与细胞活力。在大规模生物反应器中，高代谢活性伴随的底物快速消耗和氧气摄取产生大量代谢热，受限于传热与冷却效率，尤其在高黏度或高密度发酵体系中，温度梯度和局部过热现象难以避免，导致酶活性降低、代谢效率下降、产量减少。因此，增强黑曲霉的耐热性是提升工艺稳定性与生产效率的关键。本研究旨在通过精确的代谢工程策略构建耐热型黑曲霉底盘菌株，并结合多组学指导的工艺优化实现葡萄糖酸钠生产的过程强化。
研究方法
2.1 微生物菌株、培养基与过程数据测定
葡萄糖酸钠生产菌株黑曲霉CICC40350（中国工业微生物菌种保藏管理中心）作为亲本菌株。大肠杆菌DH5α用于质粒扩增。摇瓶和5-L生物反应器发酵方法参考已报道的方案，用于比较不同菌株间的耐热性差异。
摇瓶发酵表征：将茄形瓶中洗下的孢子分散并计数。以总量5×10⁷个孢子的接种量接种至含50 mL培养基的250-mL摇瓶中。种子培养于37°C、220 rpm条件下进行。培养20小时后，以13%（v/v）的接种比例将种子培养液转接至含50 mL培养基的发酵摇瓶中，于37°C、220 rpm条件下培养。
5-L台式生物反应器表征：培养基组成如下：葡萄糖，300 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.19 g/L；KH₂PO₄，0.5 g/L；(NH₄)₂HPO₄，0.19 g/L；玉米浆，2.1 mL/L，pH 6.5–7.0；消泡剂，0.2 mL/L。培养基于121°C灭菌60分钟。发酵过程中，搅拌速度在10小时后从500 rpm提升至800 rpm。过程分析与最终发酵参数测定方法同前报道。
【数据】菌株：黑曲霉CICC40350；接种量：5×10⁷孢子；培养基体积：50 mL；温度：37°C；转速：220 rpm；种子培养时间：20h；接种比例：13%（v/v）；葡萄糖浓度：300 g/L；MgSO₄·7H₂O：0.19 g/L；KH₂PO₄：0.5 g/L；(NH₄)₂HPO₄：0.19 g/L；玉米浆：2.1 mL/L；pH：6.5–7.0；消泡剂：0.2 mL/L；灭菌条件：121°C、60min；搅拌速度：500→800 rpm（10h后）
2.2 原生质体转化
总计1×10⁸个孢子在CM培养基中于30°C过夜萌发（pyrG缺陷菌株需补充10 mM尿苷）。菌丝体经过滤、洗涤、收集后，以1 g湿菌丝体、0.2 g溶壁酶和10 mL SMC缓冲液（1.33 M山梨醇、50 mM CaCl₂、20 mM MES缓冲液，pH 5.8）的混合物于37°C消化2.5–3小时以释放原生质体。过表达实验中，约10 µg质粒用于转化。
无DNA pyrG*（突变型）营养缺陷型底盘菌株的构建：该流程基于实验室已建立的体外CRISPR/Cas9方法进行优化。靶向pyrG的sgRNA使用体外转录试剂盒（TR101，Vazyme，南京，中国）表达并纯化，分装后于–80°C保存。原生质体转化过程使用约2 µg纯化的sgRNA和1 µg Cas9蛋白。
【数据】孢子量：1×10⁸；萌发温度：30°C；尿苷补充：10 mM；消化温度：37°C；消化时间：2.5–3h；湿菌丝体：1g；溶壁酶：0.2g；SMC缓冲液：10mL（1.33M山梨醇、50mM CaCl₂、20mM MES，pH 5.8）；质粒用量：约10µg；sgRNA用量：约2µg；Cas9蛋白用量：1µg
2.3 转录组学分析
用于转录组学分析的RNA在36小时时点提取。RNA提取和转录组测序由美吉生物医药科技有限公司使用Illumina NovaSeq 6000平台完成。用于分析的参考基因组为美国食品药品监督管理局公布的野生型黑曲霉ATCC 1015D-2基因组（分类学ID：5061；基因组版本：GCA_002211485.2）。转录组数据分析包括数据质量控制、样本相关性分析、差异基因表达分析和功能注释。差异基因表达分析使用edgeR软件进行。满足校正后p值（错误发现率，FDR）<0.05且|log2倍数变化|≥1的基因被认定为差异表达基因（DEGs）。登录号为PRJNA1438800。
【数据】取样时间：36h；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；参考基因组：ATCC 1015D-2（GCA_002211485.2）；DEG筛选阈值：FDR<0.05且|log2FC|≥1
2.4 代谢组学分析
胞内磷酸糖、有机酸和氨基酸的检测方法基于实验室已建立的方法进行优化。采用同位素稀释质谱法（IDMS）定量胞内代谢物。质谱检测中，添加从酿酒酵母补料分批培养中获得的U-¹³C标记细胞提取物作为内标。代谢组学数据使用MetaboAnalyst 6.0软件分析。组间统计学显著性采用Student's t检验评估，p值使用Benjamini–Hochberg方法进行多重比较校正。满足校正后p值<0.05且变量投影重要性（VIP）>1.0的代谢物被认为具有显著差异。原始数据见Mendeley Data, V1, https://doi.org/10.17632/ms2ycttg36.1。
【数据】定量方法：IDMS；内标：U-¹³C标记细胞提取物；分析软件：MetaboAnalyst 6.0；统计方法：Student's t检验 + Benjamini–Hochberg校正；显著性阈值：校正p<0.05且VIP>1.0
2.5 代谢通量分析
代谢通量分析（MFA）基于实验室前期建立的代谢通量模型进行，重点关注黑曲霉细胞内Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径、磷酸戊糖（PP）途径、三羧酸（TCA）循环、生物质合成途径和产物形成途径的代谢通量。主要副产物柠檬酸（占总副产物90%以上）的浓度仅为0.4 g/L，远低于葡萄糖酸钠产量。代谢通量计算采用以下简化假设：（1）柠檬酸为唯一副产物；（2）每批培养假设处于拟稳态，胞内中间代谢物无净积累；（3）NADH、NADPH和FADH₂在能量上等价；（4）整个发酵过程中细胞组成保持恒定，不受底物摄取和产物分泌的影响。MFA使用MATLAB R2022b软件中的化学计量模型实现。通量估算在拟稳态假设下进行，通过最小化计算与实测胞外速率之间的残差完成。MFA模型的拟合优度通过比较由计算所得胞内通量分布推导的比耗氧速率（qO₂）与发酵过程中实验测定的qO₂来评估。预测qO₂基于代谢网络中氧化代谢的化学计量计算。预测与实测qO₂值的紧密吻合证实了估算代谢通量分布的可靠性。
【数据】副产物：柠檬酸（>90%）；柠檬酸浓度：0.4 g/L；分析软件：MATLAB R2022b；验证方法：预测qO₂与实测qO₂比对
研究结果
3.1 基于Cas9–核糖核蛋白策略的定点整合底盘构建
为改造工业葡萄糖酸钠生产菌株黑曲霉的耐热性，erg3和amd最初被选为潜在代谢靶点。序列比对在黑曲霉基因组中鉴定出两个ERG3同源基因（ERG3-1和ERG3-4）及一个AMD基因，其中ERG3-4被确认为酵母ERG3的功能性结构同源物。因此，编码ERG3-4和AMD的内源基因被选为过表达靶点。
为避免随机诱变带来的不稳定性和不可预测性，基于pyrG营养缺陷型底盘的精确、定点整合系统至关重要。研究成功采用无DNA的Cas9–核糖核蛋白（RNP）方法改造了工业SG生产菌株的基因组。通过将sgRNA引导至pyrG基因座的378位点，该策略实现了高编辑效率：90%的转化子携带特定的单碱基（T）插入，有效失活了pyrG基因（图1）。随后建立了定点pyrG互补系统。通过将空表达盒精确整合至pyrG基因座构建了互补转化子，以评估该遗传操作对菌株性能的影响。关键的是，该菌株的SG产量与原始野生型（WT）菌株在统计学上无显著差异。最终，这种定点pyrG靶向整合成功规避了随机过表达引起的葡萄糖到SG的0.04 mol/mol产量损失，为后续代谢工程奠定了稳健的底盘。
3.2 amd过表达菌株耐热性的增强
利用pyrG底盘，将带有强启动子PgpdA的erg3-4和amd整合至pyrG基因座并实现组成型过表达（COE）。在摇瓶试验中，erg3-4过表达菌株（COE-ERG3-4）在升温条件下仅表现出微弱的耐热性改善。相比之下，amd过表达菌株（COE-AMD）表现出显著的稳健性，在72小时后仍维持高SG产量。经96小时发酵，COE-AMD在摇瓶中达到69.9 ± 2.7 g/L SG产量，较WT菌株提高1.6倍。
COE-AMD进一步通过5-L生物反应器发酵表征，以研究amd过表达在45°C下对SG生产的影响。COE-AMD在接种后12小时内即呈现指数生长，而WT菌株在45°C下表现出严重的生长延迟，生物量积累可忽略不计（图2A）。相比之下，WT菌株需要96小时才能达到相当的细胞干重。这种快速生长表明COE-AMD在放大发酵环境中具有优异的耐热性。与此一致，COE-AMD的GOD比活性快速上升，更早达到阈值，并在整个过程中维持显著高于WT的GOD活性（图2B）。此外，COE-AMD展现出显著增强的SG生物合成能力。如图2C和D所示，工程菌株COE-AMD在约24小时进入快速葡萄糖消耗和产物合成阶段。相反，WT菌株表现出延长的迟滞期，将快速生产推迟至36小时之后。CER和耗氧速率（OUR）进一步验证了这些发现（图2E和F）。COE-AMD在45°C下维持旺盛的代谢状态，反映了其稳健的生长特性。其CER在36小时后达到峰值3.3 mmol/(L·h)，OUR达34.8 mmol/(L·h)，约为WT菌株的两倍。这些数据突出表明，指数生长中期（约36小时）发生了关键的代谢分化，该时点因此被选为后续整合多组学分析的关键取样时间点（转录组取样36h，代谢组取样27h和44h）。平均葡萄糖消耗速率从3.33 g/(L·h)提升至5.1 g/(L·h)，增加了5%（见补充材料）。这直接将SG生产速率从3.0 g/(L·h)提升至4.7 g/(L·h)，SG产率从0.74 mol/mol增加至0.76 mol/mol。综上，这些结果证实amd过表达赋予菌株热胁迫稳健性，显著改善了黑曲霉在45°C下的SG生产能力。COE-AMD的总发酵周期从94小时缩短至64小时，较WT缩短了32%。
3.3 多组学分析阐明耐热机制
COE-AMD菌株在45°C下的耐热性和增强的SG生产性能归因于amd在pyrG基因座的组成型过表达，该基因可降解AMP生成IMP和内源NH₃。研究采用整合转录组学和代谢组学分析来解析COE-AMD优异耐热性背后的代谢机制。
#### 3.3.1 氨基酸降解与胞内信号传导的协同调控
比较转录组学在COE-AMD中鉴定出2677个差异表达基因（图3A）。基因本体论（GO）富集分析显示WT与耐热型COE-AMD之间胞内生理状态的总体显著差异（图3B）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析突出显示了三个核心代谢模块的显著变化（P_adjust < 0.001）：精氨酸和脯氨酸代谢（map00330）、β-丙氨酸代谢（map00410）以及丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢（map00250）（图3C）。基于转录组数据，过表达的AMP脱氨酶（EC:3.5.4.6）产生的NH₃并未显著增强精氨酸的生物合成途径（map00230-嘌呤代谢），相反，精氨酸到乙酰-CoA的降解途径在稳定期之前被激活。这一代谢特征提示精氨酸降解和碳骨架回收的特异性激活。精氨酸作为含氮量最高的氨基酸，其代谢重编程似乎是菌株热适应过程的核心。具体而言，胍丁胺酶（EC 3.5.3.11）的表达显著上调，促进了精氨酸前体向腐胺的转化。伯胺氧化酶（EC 1.4.3.21）表达大幅增加，该酶催化所有胞内伯胺（氨基酸）降解的终末步骤，同时释放内源NH₄⁺和H₂O₂。进一步分析揭示，上述代谢重塑触发了三重生理响应：（i）氮素回收：释放的NH₄⁺通过谷氨酸合酶被高效再同化，维持氮稳态。（ii）能量供应：β-丙氨酸通过转氨酶（EC 2.6.1.19）和脱氢酶（EC 1.2.1.18）级联反应转化为乙酰-CoA，从而将碳骨架导入能量代谢。关键的是，这种重编程在指数生长期即已启动，使工程菌株能够在早期阶段开启热应激响应。
#### 3.3.2 IMP降解增强铵同化的机制
amd过表达导致AMP降解为IMP并释放NH₃。转录组数据显示，嘌呤代谢和氮代谢相关基因的表达谱发生了系统性变化（图4）。COE-AMD中，参与NH₄⁺再同化途径的谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶基因表达上调，表明释放的NH₄⁺被高效捕获并纳入氨基酸代谢网络。在代谢组层面，指数生长后期（44h时点）胞内氨基酸池的组成发生了显著变化，多种氨基酸的丰度在COE-AMD与WT之间存在明显差异（图5）。
3.4 组学指导的发酵工艺优化
基于多组学揭示的铵同化增强机制，研究者在初始培养基中补充了0.4 g/L铵盐以进一步强化COE-AMD在45°C下的发酵性能。结果显示，铵盐补充使生物量、酶活和产物生成速率分别提高了3.0倍、4.0倍和1.6倍（图6）。最终，COE-AMD在45°C下66小时内产出311.5 ± 2.0 g/L SG，产率达0.78 ± 0.03 mol/mol。
【数据】SG产量：311.5 ± 2.0 g/L；发酵时间：66h；产率：0.78 ± 0.03 mol/mol；铵盐添加量：0.4 g/L；生物量提升：3.0倍；酶活提升：4.0倍；产物生成速率提升：1.6倍；温度：45°C
讨论与解读
本研究建立了完整的黑曲霉耐热工程平台。在底盘构建层面，采用无DNA的Cas9–RNP策略精确定点突变pyrG基因，避免了外源DNA片段的引入和随机整合事件，这对维持黑曲霉作为公认安全（GRAS）菌株的基因组完整性至关重要——可防止沉默的次级代谢物基因簇（如霉菌毒素相关基因）被意外激活，保障产品安全。选择pyrG作为筛选标记，是因为其作为关键生长因子的角色优于argB。
amd过表达菌株的耐热优势源于AMP脱氨酶介导的代谢重编程。该酶将AMP降解为IMP并释放内源NH₃，触发了精氨酸降解途径的激活和碳骨架回收。这种在指数生长期即启动的热应激响应赋予工程菌株显著的生长优势——COE-AMD在45°C下12小时内即进入指数生长，而WT需96小时才能达到相当生物量。组学指导的工艺优化进一步验证了机制发现的转化价值：补充0.4 g/L铵盐即实现生物量、酶活和产物生成速率的倍数级提升。
【编译者解读】本研究展示了"机制驱动"的菌株 engineering 范式——先通过组学手段解析耐热的代谢基础，再据此进行精准的工艺干预。amd过表达策略的巧妙之处在于将氮代谢调控与热应激响应耦联，通过内源NH₃释放和再同化循环实现代谢稳态的全局重塑。但值得注意的是，COE-ERG3-4菌株的耐热改善微弱，提示麦角固醇通路在该菌株背景下的热保护作用有限。从工业应用视角看，311.5 g/L的产量和66小时的周期已具备良好经济性，但45°C下的长期传代稳定性及更大规模反应器的传质限制仍需进一步验证。
参考来源
Sun, J. Enhancing thermotolerance of Aspergillus niger for sodium gluconate production by combining metabolic engineering and fermentation process optimization. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134659
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134659