来源：Metabolic engineering of Rhodococcus aromaticivorans RHA1 for muconic acid production from lignin（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素是自然界中最丰富的芳香族生物聚合物，有望替代化石燃料成为化学品制造的可再生原料。本研究利用丝氨酸整合酶辅助基因组工程（SAGE）技术，对红球菌Rhodococcus aromaticivorans RHA1进行系统性代谢工程改造，将软木硫酸盐木质素的氧化解聚产物（主要含香草醛、香草酸和乙酰香草酮）高效转化为粘康酸。最终工程菌株RHAAL14实现了97%摩尔产率和1.4 g/L的粘康酸产量，展示了全基因组整合策略在构建遗传稳定微生物细胞工厂方面的潜力。
研究背景
石油化工和炼油工业是温室气体排放最大的工业部门之一。己二酸作为尼龙-6,6的主要前体，传统上由KA油氧化生产，该过程每年约排放45 Mt CO₂当量，并贡献近80%的工业N₂O排放。木质素约占生物圈有机碳的30%，是极具前景的可再生化工原料。纸浆和造纸厂每年通过硫酸盐法产生约78 Mt木质素，但仅1-2%用于高价值应用，大部分被焚烧发电。随着节能技术进步，现代工厂出现能源盈余，估计每年约有27 Mt硫酸盐木质素可作为高价值产品的原料。将化学解聚与生物催化耦合，利用微生物细胞工厂将木质素衍生芳香化合物（LDACs）转化为目标化学品，是实现这一潜力的新兴技术路线。
研究方法
4.1 化学品与试剂
试剂购自Sigma-Aldrich和Fisher Scientific，除非另有说明均为分析纯。DNA扩增和操作所用酶购自New England Biolabs。寡核苷酸由Integrated DNA Technologies合成，密码子优化的基因由Twist Bioscience合成。本研究所用寡核苷酸和合成DNA序列见Tables S2和S3。
【数据】试剂来源：Sigma-Aldrich/Fisher Scientific；酶来源：New England Biolabs；寡核苷酸合成：Integrated DNA Technologies；基因合成：Twist Bioscience
4.2 菌株、培养基与培养条件
本研究所用细菌菌株列于Table 1。最低培养基培养时，RHA1在补充Goodies的M9培养基中（Vaillancourt et al., 1998）、30°C、200 rpm振荡培养。芳香底物或木质素单体油（见4.6节）溶于二甲基亚砜（DMSO）后加入生长培养基，使用前经0.22 μm膜过滤。种子培养在含适当抗生素的LB中进行：携带pRIME质粒的RHA1使用50 μg/mL硫酸阿普拉霉素，携带pRIME质粒的大肠杆菌使用100 μg/mL氨苄青霉素，携带SAGE cargo质粒的RHA1和大肠杆菌使用50 μg/mL卡那霉素。
【数据】M9培养基补充Goodies；温度：30°C；转速：200 rpm；DMSO溶解底物；0.22 μm膜过滤；抗生素浓度：阿普拉霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL
4.3 DNA操作
本研究所用质粒列于Table S1。野生型基因通过PCR从基因组DNA扩增获得，来源包括：R. aromaticivorans RHA1（vanACB）、Sphingobium lignovorans SYK-6（ligV）或R. rhodochrous GD02（hpeHICBADEF）。aroY-ecdBD和vdcBCD的天然核苷酸序列从GenBank获取（AroY: ADF61496；EcdB: ADF63617.1；EcdD: ADF63615.1；VdcBCD: AF134589）。使用http://atgme.org/ 和http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=101510 进行密码子优化。优化包括使用NovoPro（https://www.novoprolabs.com/tools/repeats-sequences-finder）调整密码子使用、CG含量和大于9 bp的重复序列。合成核糖体结合位点（RBS）使用De Novo DNA RBS Calculator 2020版设计（Salis et al., 2009）。密码子优化序列和RBS连同接头作为片段从Twist Bioscience订购。为克隆到SAGE cargo质粒，目标基因首先克隆到含PT1强组成型启动子（Round et al., 2021）和TthcA终止子的pRIME中，转录单元随后使用通用引物oAL20和oAL21亚克隆到SAGE载体。质粒使用NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix按制造商建议组装（Biolabs, 2022），并在自制电穿孔感受态E. coli DH5α pir中繁殖。
【数据】密码子优化工具：ATGme/Kazusa/NovoPro；RBS设计：De Novo DNA RBS Calculator 2020；组装试剂：NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix；宿主菌：E. coli DH5α pir
4.4 RHA1基因组工程
RHA1转化时，电穿孔感受态细胞通过对数中期培养物用冰冷ddH₂O洗涤四次、10%甘油洗涤一次制备。感受态细胞与DNA孵育30分钟后，使用Bio-Rad MicroPulser在2.0 kV、5 ms条件下电穿孔，然后在LB中恢复5小时后涂板。使用SAGE进行基因组整合按前述方法进行（Elmore et al., 2023; Lalande et al., 2026）。整合后，质粒骨架用pJE1817质粒上的φC31整合酶切除。整合和骨架切除通过菌落PCR确认。catB和pcaHG缺失使用sacB反向筛选按前述方法完成（van der Geize et al., 2001），并通过菌落PCR验证。
【数据】电穿孔条件：2.0 kV、5 ms；恢复时间：5 h；感受态制备：ddH₂O洗涤4次+10%甘油洗涤1次；DNA孵育时间：30 min
4.5 甲醛定量
为测量胞内甲醛水平，细胞在25 mL含指定底物的M9培养基中培养至对数中期，离心收集。沉淀用M9洗涤两次，重悬于1 mL Tris-HCl、300 mM NaCl、pH 8.0缓冲液中。细胞通过3轮珠磨破碎（6 m/s，45 s/轮），裂解液离心澄清。200 μL裂解液与200 μL 2,4-二硝基苯肼（DNPH）混合，37°C孵育1小时。反应液随后16,000 × g离心10分钟，HPLC检测350 nm处的腙衍生物。甲醛通过相同方式衍生化一系列真实标准品并生成标准曲线进行插值定量。数据归一化至仅含M9的衍生化样品和裂解液总蛋白含量（使用Pierce™ BCA Protein Assay Kit测定，ThermoFisher Scientific）。
【数据】裂解：3轮珠磨，6 m/s，45 s/轮；衍生化：200 μL裂解液+200 μL DNPH，37°C，1 h；离心：16,000 × g，10 min；检测波长：350 nm；缓冲液：Tris-HCl 300 mM NaCl pH 8.0
4.6 生物转化实验
为测试工程菌株对底物的转化能力，细胞在LB中培养至对数中期。收获细胞用M9洗涤后重悬至所需OD。培养物分装至48孔板，加入目标底物启动生物转化，30°C振荡培养。定期取样，用dH₂O稀释，16,000 × g离心10分钟，−20°C冷冻保存至HPLC分析。ccMA生产时，RHAAL14在100 mL LB中培养至对数中期，收获后用M9洗涤，重悬至OD 5.0。培养物分装至48孔板，加入LDACs和葡萄糖，30°C振荡培养。初始批次实验设单个生物学重复。补料分批实验设三次重复，底物在0、5和10小时加入。
【数据】培养体积：100 mL LB；OD：5.0；温度：30°C；底物添加时间点：0、5、10 h；离心：16,000 × g，10 min；保存温度：−20°C
4.7 木质素解聚、分离与分析
软木硫酸盐木质素（0.898 kg，来源UPM）和氢氧化钠（1.2 kg）溶解于15 L水中。加入硫酸铜（终浓度1.2 mM），剧烈搅拌。所得溶液含60 g/L木质素和2 M氢氧化钠，通过双ISCO泵送入不锈钢盘管（19.5 ft × 1.9 mm内径），配备质量流量控制器调节在线O₂供给。管路在油浴中加热至210°C，液体和气体分别以9.6 mL/min和173 mL/min的流速通过管路。混合物随后经过水夹套不锈钢冷却回路，进入背压调节器维持管内压力361 psi。反应器流出液酸化至pH 2，经Whatman 202滤纸过滤，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯用旋转蒸发器蒸发，得到53 g棕色粘稠油状物。分离时，按体积比2:3:2:3混合正庚烷、乙酸乙酯、甲醇和去离子水制备“Arizona L”溶剂系统。氧化木质素油（53 g）悬浮于300 mL Arizona L上相和300 mL下相中。Gilson CPC仪器装载Arizona L下相作为固定相，1400 RPM平衡，上相显示80%固定相保留率。然后注入3 × 17 mL含两相的等分试样（对应4.5 g木质素油，含1.2 g LDACs），混合物用上相以30 mL/min流速、上行模式洗脱。洗脱10分钟后开始收集级分（弃去）。共收集118个级分（每个18 mL），基于UV峰轮廓合并级分组（Fig. S9）并用UPLC分析。级分1-20（360 mL）含深棕色寡聚物，弃去。级分21-105主要含可生物利用的LDACs，保留。级分106-118及柱中剩余寡聚物（用下相上行模式挤出）弃去。最后，级分21-105合并，旋转蒸发得到1.529 g单体油。该过程重复进行，共获得4.89 g单体油。各阶段单体组成详情见Supporting Information Table S4。
【数据】木质素：0.898 kg；NaOH：1.2 kg；水：15 L；CuSO₄：1.2 mM；木质素浓度：60 g/L；NaOH浓度：2 M；盘管尺寸：19.5 ft × 1.9 mm；温度：210°C；液体流速：9.6 mL/min；O₂流速：173 mL/min；压力：361 psi；酸化pH：2；粗产物：53 g；Arizona L比例：2:3:2:3；CPC转速：1400 RPM；进样量：3 × 17 mL；洗脱流速：30 mL/min；级分体积：18 mL；总级分数：118；保留级分：21-105；单体油产量：1.529 g/批次，总计4.89 g
4.8 色谱分析
木质素油的UPLC分析（Fig. S10）中，每份样品约15 mg溶解于（原文未详述后续参数）。
【数据】样品量：约15 mg；原文未详述其余色谱参数
研究结果
2.1 硫酸盐木质素解聚
为生成生物催化底物，我们对软木硫酸盐木质素应用了fLOAD处理（图1）。木质素首先在段塞流反应器中进行碱性有氧氧化解构，获得6.1 wt% LDACs（g LDAC/g木质素）。随后水相酸化并用乙酸乙酯萃取，得到含41 wt% LDACs的粘稠油状物（74 wt% LDAC回收率）。使用离心分配色谱（CPC）以Arizona L溶剂系统作为双相液-液萃取介质，将单体型组分与寡聚型组分分离（Alherech et al., 2021）（图S1）。所得木质素单体油含61 wt% LDAC，主要成分为香草醛和香草酸，以及少量乙酰香草酮、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛和5-羧基香草醛（89% LDAC回收率，Table S4和图S2）。
【数据】LDAC产率：6.1 wt%；萃取后LDAC含量：41 wt%；LDAC回收率：74 wt%；单体油LDAC含量：61 wt%；LDAC回收率（CPC后）：89%；主要组分：香草醛、香草酸；次要组分：乙酰香草酮、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛、5-羧基香草醛
2.2 增强香草醛代谢
芳香醛类（主要是香草醛）是fLOAD处理木质素提取物中的主要LDACs，占单体型组分的50%以上。虽然RHA1可通过氧化为酸来分解代谢芳香醛，但这些化合物对菌株毒性很高，RHA1无法在高于1 mM的香草醛浓度下生长（Chen et al., 2012）。我们此前证明，在RHA1中过表达天然的醛脱氢酶可将菌株对香草醛的耐受性提高十倍（Round et al., 2021）。在此基础上，我们利用SAGE将来自Sphingobium lignivorans SYK-6的ligV基因（编码一种表征明确的、高效转化香草醛的醛脱氢酶）整合到基因组中（Kamimura et al., 2017; Masai et al., 2007）。所得菌株RHALR02（本研究所用菌株见表1）在10 mM香草醛上生长良好。培养上清液分析显示香草醛被完全消耗，香草酸积累至6 mM以上（图2B）。过表达香草酸O-脱甲基酶VanAB可缓解生物过程中的香草酸瓶颈（Salvachúa et al., 2018）。因此，我们在RHALR02中整合了第二个拷贝的RHA1自身vanACB基因，生成RHALR03。ligV和vanACB均在T1启动子控制下组成型表达（Round et al., 2021），位于基因组poly-attB盒内（图S3）。具体而言，pJE1832-PT1-ligV整合在BT1 attB位点，pJE1834-PT1-vanACB整合在TG1位点。在这些操作中，载体骨架按前述方法切除以去除抗生素抗性标记（Elmore et al., 2023）。在10 mM香草醛上生长时，RHALR03积累约4 mM香草酸，较RHALR02减少约30%。原儿茶酸（香草酸O-脱甲基化的产物）未积累至显著水平。两株菌在10 mM香草醛和10 mM香草酸上的生长速率相似。但在15 mM香草酸上，RHALR03的生长速率比RHALR02高66%，表明vanACB过表达具有显著优势（图2C）。Rieske加氧酶对香草酸的O-脱甲基化会释放等摩尔量的甲醛（Erickson et al., 2022）。因此，我们测量了RHALR03的胞内甲醛水平。结果显示，在香草酸上生长期间，RHALR03的甲醛水平比WT高两倍（图2D）。在RHA1中，预测编码分枝硫醇依赖性甲醛解毒途径的基因在阿魏酸（一种甲氧基化LDAC）上生长时上调（Otani et al., 2014）。该途径中，甲醛与分枝硫醇非酶促反应，加合物随后被分枝硫醇依赖性甲醛脱氢酶AdhE氧化（Yurimoto et al., 2005）。为测试过表达adhE是否能降低甲醛水平并进一步增强生长，我们将adhE克隆到pRIME中并转化至RHA1和RHALR03。与RHALR03或WT相比，两株菌在香草酸上的生长均无改善（图S4）。综上，这些数据表明vanACB过表达改善了香草醛和香草酸生长期间的分解代谢。
【数据】香草醛浓度：10 mM；香草酸积累：RHALR02 >6 mM，RHALR03约4 mM（减少约30%）；生长速率提升：15 mM香草酸上RHALR03比RHALR02高66%；甲醛水平：RHALR03为WT的2倍；启动子：T1组成型；整合位点：BT1 attB（ligV）、TG1 attB（vanACB）
2.3 构建ccMA生产模块
顺,顺-粘康酸（ccMA）是β-酮己二酸途径儿茶酚分支的代谢中间体（Patrauchan et al., 2005）。因此，此前的ccMA生物催化剂通过使用原儿茶酸脱羧酶将代谢流从原儿茶酸重新导向儿茶酚（Cai et al., 2020; Weiland et al., 2023）。为开发将代谢流导向儿茶酚的途径，我们测试了两种芳香酸脱羧酶在RHA1中的活性：来自Streptomyces sp. D7的VdcC（一种香草酸脱羧酶）（Chow et al., 1999）和来自Enterobacter cloacae的AroY（一种原儿茶酸脱羧酶）（Yoshida et al., 2010）。与对没食子酸具有强大活性的AroY不同（Payer et al., 2017），VdcC对香草酸有强烈偏好，且未检测到对异香草酸、原儿茶酸、藜芦酸或没食子酸的脱羧活性（Chow et al., 1999）。两种脱羧酶均属于UbiD蛋白家族，利用异戊二烯化黄素辅因子prFMN（Marshall et al., 2017）。据我们所知，RHA1不产生prFMN。因此，我们将脱羧酶基因与其各自的辅助基因共表达，即ecdBD和vdcBD。这些基因编码一个异戊二烯基转移酶和一个功能未知的酶，可增强生物催化剂中的脱羧活性（Johnson et al., 2016; Sonoki et al., 2014）。基因针对RHA1进行密码子优化，并作为单一转录单元克隆到pRIME中。对于pRIME-aroY-ecdBD，在每个基因上游生成并插入合成核糖体结合位点，而vdcBCD保持天然操纵子结构。我们在为阻止现有途径分解代谢而设计的RHA1突变体中测试了这些脱羧酶：ΔpcaHG（阻止原儿茶酸裂解）和ΔvanA（阻止香草酸O-脱甲基化）。ΔpcaHG菌株通过同源重组生成（图S5A），在显著延迟后在香草酸上生长（图S5B），与前述描述一致（Spence et al., 2020）。这种生长可能归因于推测的羟基醌途径，其中原儿茶酸被氧化脱羧（Spence et al., 2020）。因此，pRIME-aroY-ecdBD被整合到该菌株的基因组中，而pRIME-vdcCBD被整合到此前构建的ΔvanA突变体中（Chen et al., 2012）。各菌株对原儿茶酸或香草酸的脱羧能力通过全细胞实验评估。携带vdcBCD的菌株RHAAL10未检测到对香草酸的脱羧活性（图S6A），且不能在香草酸上生长。在携带pRIME-vdcCBD的大肠杆菌裂解液中，以及在从复制性质粒表达这些基因的RHA1菌株中，也未检测到活性（图S6B）。最后，在pRIME中以合成操纵子形式携带vdcC与ecdBD的RHA1菌株也未检测到对香草酸的脱羧活性。相比之下，携带AroY的ΔpcaHG菌株RHAAL09将原儿茶酸转化为儿茶酚和ccMA（图3A），并在5 mM香草酸上生长良好。为在RHA1中实现AroY介导的ccMA生产，我们在ΔpcaHG菌株中敲除了编码粘康酸环异构酶的catB基因（图S7A）。双敲除菌株不能在愈创木酚上生长，在超过48小时延迟后在香草酸上生长（图S7B）。将pRIME-aroY-ecdBD转化至ΔpcaHG ΔcatB菌株得到RHAAL11。在生物转化实验中，该菌株在44小时内将5 mM香草酸以100%摩尔产率转化为ccMA（图3B）。香草酸的完全转化表明没有碳流失到竞争性的推测羟基醌途径。因此，我们继续使用AroY-EcdBD模块。为将该模块整合到生物催化剂中，我们将aroY-ecdBD转录单元克隆到pJE1828 SAGE cargo载体中，并整合到菌株RHALR03的BxBI attB位点。pcaHG基因也被删除，得到菌株（原文截断）。
【数据】香草酸转化：5 mM→ccMA，100%摩尔产率，44 h内完成；RHAAL09生长底物：5 mM香草酸；ΔpcaHG ΔcatB生长延迟：>48 h；脱羧酶来源：VdcC（Streptomyces sp. D7）、AroY（Enterobacter cloacae）；整合位点：BxBI attB
2.4 乙酰香草酮转化与完整生物催化剂组装（基于上下文重构，结果数值均来自原文节选）
【数据】原文未详述此部分完整参数
讨论与解读
本研究展示了利用全基因组整合策略将RHA1工程化为从氧化解聚木质素生产ccMA的生物催化剂。红球菌已被工程化用于从木质素生产大宗化学品（Spence et al., 2021; Kim et al., 2019; Cai et al., 2020; Sun et al., 2016），包括ccMA（Cai et al., 2020）。本工作的独特之处在于完全采用基因组整合方法构建代谢网络，高效地将木质素流中几乎所有芳香化合物（包括非天然底物）引导至高价值产物。鉴于近期研究表明红球菌基因组可能比普遍认为的更具可塑性（Acedos et al., 2025），此类整合方法对于开发遗传稳定的生物催化剂、绕过昂贵且有毒性抗生素的需求以及减少质粒维持相关的代谢负担至关重要。本研究利用整合性SAGE和pRIME工具包对RHA1进行基因组工程改造，证明了这些工具在红球菌工程中的实用性。通过使用强组成型启动子驱动工程途径表达并敲除分解代谢基因，避免了碳通过竞争途径流失。最终生物催化剂过表达15个基因（分为四个转录单元），将木质素油中97%的芳香单体转化为ccMA，其中包括用于乙酰香草酮转化的Hpe途径的过表达。虽然同源（原文截断）。
编译者解读：该研究的方法论亮点在于完全摒弃质粒体系，采用SAGE基因组整合策略构建了15基因过表达的复杂代谢网络——这种"无质粒"设计在工业放大中具有显著优势，既避免了抗生素添加成本，也消除了质粒丢失风险。从合成生物学应用角度看，选择RHA1这种天然LDAC降解菌作为底盘，配合密码子优化和合成RBS设计，体现了"驯化自然菌株"而非"重构异源宿主"的务实路线。值得注意的是，AroY-EcdBD模块的成功与VdcC模块的失败形成鲜明对比，提示UbiD家族脱羧酶在异源宿主中表达时，辅助蛋白的选择和操纵子结构设计可能比酶本身的选择更为关键。未来若能将木质素解聚与生物转化过程进一步集成优化，该策略有望推动木质素基粘康酸的工业化进程。
参考来源
Lalande, A.T. Metabolic engineering of Rhodococcus aromaticivorans RHA1 for muconic acid production from lignin. Metabolic Engineering, 2027.
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102531
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102531