来源：Development and application of a fast and efficient CRISPR/Cas12f -based genetic toolkit in Bacillus cereus GW-01（Journal of Microbiological Methods）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蜡样芽孢杆菌GW-01是一株高效降解β-氯氰菊酯的安全菌株，具有调节肠道菌群和应用于发酵食品的益生菌潜力，但因其限制性修饰系统而难以进行遗传改造。本研究成功建立了基于CRISPR/enCas12f的基因组编辑系统，以plcR基因验证敲除效率达100%，并进一步敲除毒力基因nheABC获得更安全的益生菌株。突变株在细胞表面疏水性、自聚集能力和生物膜形成能力等益生指标上与野生型无显著差异，同时保持80%的β-氯氰菊酯降解效率。
研究背景
蜡样芽孢杆菌是广泛分布于土壤、水体及动物肠道中的常见革兰氏阳性菌，可产生壳聚糖酶、磷脂酶和维生素D等多种生物活性物质，在农业、医药和畜牧业中具有重要应用。自然界中几乎所有蜡样芽孢杆菌菌株都含有毒素编码基因，约85–100%携带nheABC，40–70%携带HblCDA和cytK-2。前期工作中，研究者从健康母羊瘤胃食糜中分离出安全的拟除虫菊酯降解菌株B. cereus GW-01，该菌株具有高效降解拟除虫菊酯的能力。全基因组测序结果显示该菌株仅含nheABC基因。氯氰菊酯作为农业中广泛使用的合成拟除虫菊酯类杀虫剂，在土壤和水环境中频繁检出，微生物降解是经济环保的修复策略。因此，在基因改造后保持氯氰菊酯降解能力，对开发安全功能化的环境修复工程菌株至关重要。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表1。大肠杆菌DH5α作为质粒构建的宿主菌，于37°C、Luria–Bertani（LB）培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中、200 r/min振荡培养。需要时向培养基中添加50 μg/mL卡那霉素。制备感受态细胞时，蜡样芽孢杆菌菌株在含0.5%甘油的脑心浸液肉汤（BHIG；Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, United States）中培养。
【数据】培养基：LB（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；温度：37°C；转速：200 r/min；抗生素：50 μg/mL卡那霉素；感受态培养基：BHIG（含0.5%甘油）
2.2 质粒构建
所有PCR引物及各PAM序列（TTTG）对应的N20序列列于表2。Cas12f介导的甘露糖诱导型基因组编辑流程如图2所示。构建GW-01基因编辑质粒时，将pJOE8999质粒的Cas9 cassette替换为来自A. sulfuroxidans的合成enCas12f1 cassette（Wang et al., 2022）。随后将所得质粒的EcoRI-XbaI片段替换为合成的sgRNA_V1片段以表达sgRNA。最终构建体pJOE-enCas12f1（5421 bp）携带enCas12f1 cassette、sgRNA支架和卡那霉素抗性基因（kanR）（图1）。为获得pJOE-enCas12f1-plcR质粒，通过XhoI和SalI限制性酶切、连接及Golden Gate Assembly将同源重组臂和20 bp间隔序列分别连接到pJOE-enCas12f1上，方法如前所述（Wang et al., 2022）。其他基因组编辑质粒采用相同方法构建。
【数据】质粒大小：pJOE-enCas12f1为5421 bp；PAM序列：TTTG；限制性酶：EcoRI、XbaI、XhoI、SalI；抗性标记：卡那霉素（kanR）
2.3 转化与突变株筛选
B. cereus GW-01的质粒转化采用电穿孔法，参照Wang et al.（2018）所述方法。制备感受态细胞时，将GW-01菌株培养至OD600为0.6–0.8，收集菌体后用洗涤缓冲液（0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L甘露醇+10%甘油）洗涤四次。最终菌体重悬于0.8 mL洗涤缓冲液中，按80 μL等分分装至含质粒DNA的1.5 mL离心管中。将B. cereus GW-01与质粒共同转化。取5 μL质粒DNA（1 μg溶于水）加入50 μL感受态细胞中，在0.1-cm间距电转杯中施加电脉冲（1.8 kV，25 μF，200 Ω），参照Turgeon et al.（2006）所述方案并稍作修改。脉冲后立即加入冰预冷的LB培养基，于37°C、180 rpm振荡培养3 h。随后将培养物涂布于卡那霉素抗性平板（50 μg/mL）上，37°C培养20 h以验证转化子生长。将敲除质粒转化B. cereus GW-01后，使用含卡那霉素的LB培养基筛选阳性克隆。培养6 h后，将培养物转移至LB培养基中，加入甘露糖至终浓度0.4%（Wang et al., 2022）以诱导enCas12f表达进行DNA切割。过夜诱导后，将培养物涂布于无抗生素琼脂平板，37°C过夜培养。通过菌落PCR筛选阳性突变株。此外，对PCR产物进行测序以确认基因敲除成功。
【数据】感受态制备OD600：0.6–0.8；洗涤缓冲液：0.5 mol/L山梨醇+0.5 mol/L甘露醇+10%甘油；电穿孔参数：1.8 kV、25 μF、200 Ω、0.1-cm电转杯；质粒DNA用量：5 μL（1 μg）；复苏条件：37°C、180 rpm、3 h；筛选平板：50 μg/mL卡那霉素、37°C、20 h；甘露糖诱导浓度：0.4%；诱导时间：过夜
2.4 质粒消除
为消除残留质粒并排除其对后续表型和功能分析的影响，将突变株在不含抗生素的LB培养基中每12小时间隔连续传代培养。随后将培养物划线于琼脂平板。仔细挑取菌落，分别在LB-卡那霉素和LB琼脂平板上进行影印培养。选取对卡那霉素敏感的菌落，在1 mL无抗生素LB培养基中增殖培养。使用载体来源引物进行PCR扩增，验证定点突变pJOE-enCas12f1质粒所携带的预期突变位点。质粒消除效率以卡那霉素敏感菌落数除以测试菌落总数计算。
【数据】传代间隔：12 h；质粒消除效率计算公式：卡那霉素敏感菌落数/测试菌落总数×100%
2.5 突变株功能鉴定
#### 2.5.1 溶血试验
野生型菌株和ΔnheABC突变株分别培养。将菌悬液点样于5%绵羊血琼脂平板上，37°C培养24 h。观察并拍摄溶血表型以评估菌株溶血活性。
【数据】血琼脂浓度：5%绵羊血；培养条件：37°C、24 h
#### 2.5.2 降解与代谢测定
将菌株接种于含β-氯氰菊酯的培养基中，恒温培养。培养3天后，采用高效液相色谱（HPLC）定量β-氯氰菊酯残留浓度。随后计算降解效率，并进行统计分析以比较野生型与基因敲除菌株的代谢降解能力。
【数据】培养时间：3天；检测方法：HPLC
2.6 生长曲线测定
将野生型B. cereus GW-01及其突变株从−80°C冷冻保存的菌种接种至种子培养基中，于37°C、200 rpm预培养12 h。初次培养后，将5 mL培养物转移至50 mL新鲜种子培养基中继续过夜培养。每2小时取样监测生长状况。本研究所有实验均设三个独立生物学重复，每个生物学重复含三个技术重复以确保数据可靠性。
【数据】预培养：37°C、200 rpm、12 h；接种量：5 mL/50 mL；取样间隔：2 h；重复设置：3个生物学重复×3个技术重复
2.7 突变株益生特性表征
#### 2.7.1 自聚集试验
突变株自聚集试验如下：将OD600为1.0的菌悬液加入试管中，涡旋30 s，随后37°C静置培养。小心吸取上清液，在0、6、12和24 h测定600 nm处吸光度。自聚集率（%）按以下公式计算，其中A0为0 h吸光度，At为指定时间点吸光度。
自聚集% = (1 − At/A0) × 100
【数据】菌悬液OD600：1.0；涡旋时间：30 s；培养温度：37°C；测定时间点：0、6、12、24 h
#### 2.7.2 细胞表面疏水性试验
突变株细胞表面疏水性参照先前描述的方法评估。将OD600为1.0的菌悬液与等体积二甲苯混合，涡旋5 min。随后将混合物于37°C静置30 min以促进分相。测定水相在600 nm处的吸光度，记为A1。疏水性（%）按以下公式计算，其中A0和A1分别为与溶剂混合前后600 nm处的吸光度。
疏水性% = (1 − A1/A0) × 100
【数据】菌悬液OD600：1.0；有机溶剂：二甲苯（等体积）；涡旋时间：5 min；静置条件：37°C、30 min
#### 2.7.3 生物膜形成试验
采用结晶紫染色法评估菌株生物膜形成能力（Kuebutornye et al., 2022）。将GW-01ΔnheABC的传代培养悬液加入24孔板中，37°C静置培养24 h。去除未黏附的细菌细胞，用0.9% NaCl溶液洗涤孔板，随后用结晶紫染色30 min。用NaCl溶液洗去多余结晶紫，加入无水乙醇溶解生物膜30 min。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）读板仪测定595 nm处光密度（OD595）。
【数据】培养板：24孔板；培养条件：37°C静置24 h；洗涤液：0.9% NaCl；染色时间：30 min结晶紫；脱色：无水乙醇30 min；检测波长：OD595
2.8 统计分析
所有数据以平均值±标准差（SD）表示，使用GraphPad Prism 9.5.0进行分析。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey诚实显著性差异（HSD）检验分析组间差异。
【数据】统计软件：GraphPad Prism 9.5.0；统计方法：单因素方差分析+Tukey HSD检验
研究结果
3.1 CRISPR/Cas12f系统在B. cereus GW-01中的构建
为测试CRISPR/enCas12f基因组编辑系统能否在B. cereus GW-01中使用，选择plcR基因作为靶标进行概念验证。plcR基因是蜡样芽孢杆菌的核心毒力调控因子，功能明确（Gohar et al., 2008）；其敲除产生易检测的表型且不显著影响正常生长、益生特性或降解功能（Hsueh et al., 2006），是验证编辑系统的理想靶标（Prince and Kovac, 2022）。首先，如材料与方法部分所述，将包含供体DNA、基因特异性sgRNA和enCas12f1 cassette的质粒电转入B. cereus GW-01。鉴于蜡样芽孢杆菌中广泛存在内源限制性修饰（R-M）系统，该系统可特异性识别并切割外源DNA片段（Xu et al., 2012），可能影响pJOE-enCas12f-plcR质粒的转化效率。经菌落PCR和质粒限制性酶切双重验证的单克隆转化子（扩增条带大小和酶切片段长度与理论值一致）在液体培养基中培养。随后将细胞悬液稀释至10⁻⁶并涂布于LB琼脂平板（图3a-1）。对于plcR基因，所有随机挑取的菌落（4/4）获得的325 bp PCR产物证明plcR基因成功缺失（原始全长片段：858 bp）。相比之下，野生型亲本菌株GW-01产生1200 bp的扩增产物（图3b）。对16个克隆进行卡那霉素敏感性测试，结果显示所有克隆均对卡那霉素敏感（图3a-2）。因此，质粒消除效率达到100%（16/16）。作为概念验证，研究者使用该策略在菌株GW-01中连续敲除nheABC基因，结果如图3c所示。野生型菌株GW-01中由NheABC-ko-F/NheABC-ko-R引物扩增的区域大小为4100 bp，而所有随机挑取的菌落（4/4）均呈现预期的500 bp扩增子，确认基因成功切除。此外，该系统还分别用于单独敲除NheA、NheB和NheC，敲除效率同样达到100%（图3d、图3e、图3f）。这些结果表明CRISPR/enCas12f系统能够在B. cereus GW-01中成功进行碱基编辑。
【数据】plcR基因敲除后PCR产物：325 bp；plcR基因全长：858 bp；野生型扩增产物：1200 bp；质粒消除效率：100%（16/16）；nheABC敲除后PCR产物：500 bp；野生型nheABC扩增产物：4100 bp；单基因敲除（nheA、nheB、nheC）效率：100%；菌液稀释度：10⁻⁶
3.2 突变株特性
通过分子水平验证，研究者成功获得基因敲除菌株ΔnheABC。通过在24 h内测定600 nm处光密度（OD600）绘制这些菌株的生长曲线（图4a）。ΔnheABC菌株在前15 h内表现出与野生型相当的生长速率，表明nheABC基因簇的破坏不会显著影响细菌增殖。进一步的表型分析显示，突变株完全丧失溶血活性（图4c）。为进一步了解nheABC基因缺失是否影响菌株的β-氯氰菊酯降解特性，研究者测定了突变株培养三天后的β-氯氰菊酯降解效率。正如预期，培养三天后，野生型GW-01和ΔnheABC菌株均降低了初始浓度为30 μg/mL的β-CY。ΔnheABC组的残留浓度为7.08 μg/mL，对应降解率为76.38%，与野生型菌株无显著差异（图4b）。这些结果表明，nheABC毒力基因簇的缺失不影响菌株的β-氯氰菊酯降解能力。
【数据】生长曲线监测时间：24 h；无显著差异时间段：前15 h；β-CY初始浓度：30 μg/mL；ΔnheABC残留浓度：7.08 μg/mL；ΔnheABC降解率：76.38%；溶血活性：完全丧失
3.3 突变株益生特性表征
菌株黏附宿主肠道上皮细胞的能力对其发挥益生特性至关重要。评价细菌黏附能力的常用指标包括细胞表面疏水性、自聚集能力和生物膜形成能力。采用有机溶剂法测定突变株的细胞表面疏水性（图5a）。结果显示，ΔnheABC与野生型菌株无显著差异，并保持高水平的疏水性（>80%）。在前6 h内，ΔnheABC表现出相对较低的黏附率（<50%），其自聚集曲线反映了这一点（图5b）。然而，培养24 h后，ΔnheABC的黏附指数增加至92.33%，与野生型GW-01无显著差异。还评估了GW-01/ΔnheABC的生物膜形成能力（图5c）。GW-01和ΔnheABC的OD595值分别为3.05和2.98，二者之间无统计学显著差异。这些发现表明，GW-01中毒力基因nheABC的缺失不会损害肠道定殖所必需的细菌黏附能力。
【数据】ΔnheABC疏水性：>80%；前6 h自聚集率：<50%；24 h黏附指数：92.33%；GW-01生物膜OD595：3.05；ΔnheABC生物膜OD595：2.98；显著性水平：P < 0.05
讨论与解读
蜡样芽孢杆菌是常用益生菌菌种之一，具有强大的胞外蛋白分泌能力。基于蜡样芽孢杆菌的微生态制剂在医疗、农业和水产养殖等领域应用广泛。GW-01菌株在降解β-氯氰菊酯、调节动物肠道菌群和食品发酵方面显示出巨大优势。尽管与其他蜡样芽孢杆菌相比，GW-01菌株所含毒素基因相对较少，且动物实验表明GW-01菌株更安全，但删除毒力相关基因仍是使其成为更安全制剂及底盘细胞的重要手段。传统同源重组耗时且效率低；CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除效率高、操作简单、周期短，但也存在Cas9相对分子质量大、转化困难、脱靶率高等缺陷，限制了其在GW-01菌株中的应用。而Cas12f因其分子量小在GW-01中展现出巨大优势。Wang et al.（2022）使用Cas12f在炭疽芽孢杆菌中实现了100%的敲除效率。本研究在B. cereus GW-01中建立了基于Cas12f的CRISPR系统，靶向编码非溶血性肠毒素nhe的基因，实现了100%效率的基因敲除。
编译者解读
本研究选用Cas12f而非Cas9构建编辑系统，精准回应了蜡样芽孢杆菌转化难、限制性修饰系统强的痛点——小分子量效应蛋白在电穿孔效率受限的菌株中具有天然优势。甘露糖诱导的严格调控设计避免了毒性蛋白的组成型表达，100%的质粒消除效率也为后续无标记菌株应用扫清了障碍。值得注意的是，研究在追求安全性的同时系统验证了益生指标与降解功能未受损，这种"功能保全"式评估策略对开发活菌制剂尤为重要。局限在于目前仅完成了基因缺失编辑，尚未展示插入或点突变能力；后续若能在该系统中实现更复杂的基因操作，将进一步提升其作为合成生物学底盘的价值。
参考来源
Wei E. Development and application of a fast and efficient CRISPR/Cas12f-based genetic toolkit in Bacillus cereus GW-01. Journal of Microbiological Methods, 2026. DOI: 10.1016/j.mimet.2026.107584
DOI: 10.1016/j.mimet.2026.107584