来源：Biochemical characterization and catalytic features of a GH5 endo-β-1,4-mannanase from Aspergillus niger code 1234（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甘露聚糖是半纤维素的重要组分，其酶解产物甘露寡糖（MOS）具有益生元活性，在食品与饲料工业中价值可观。本研究从亚马逊地区饮用水中分离的黑曲霉（Aspergillus niger）1234菌株中纯化出一种GH5_7亚家族内切β-1,4-甘露聚糖酶（AnMan5A-like），该酶在62°C、pH 3.9条件下活性最优，且在50°C和60°C下孵育72小时后仍保留95%以上残余活性。酶解产物以聚合度2–3的甘露寡糖为主，结构分析揭示其催化裂隙可容纳五个底物结合位点。
研究背景
甘露寡糖因益生元特性在食品、饲料及制药领域备受关注。随着循环生物经济转型加速，可再生生物质作为生物燃料和生化品原料的地位日益凸显。酶法加工可将复杂多糖转化为寡糖和单糖，是实现这一转型的关键环节。然而，不同生物质的组成与结构差异要求定制化酶系统协同作用。
在具有生物技术潜力的多糖中，甘露聚糖广泛存在于油棕仁粕、咖啡渣、椰子粕等农业工业残渣中，也见于巴西生物多样性中未被充分开发的神圣椰子（açaí）、阔叶棕（juçara）和macatiba等种子残渣。与已被广泛利用的甘蔗渣和秸秆相比，大量富含甘露聚糖的残渣仍被低值利用或不当丢弃，造成显著环境影响。内切β-1,4-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）能够水解β-1,4-甘露聚糖主链，将富含甘露聚糖的生物质转化为甘露糖和甘露寡糖等高附加值产品，因此成为生物炼制和功能食品领域的研究热点。
研究方法
2.1 化学试剂
槐豆胶（LBG）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。SDS-PAGE蛋白标准品购自Bio-Rad（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）。其余化学试剂均购自商业渠道。
2.2 菌株繁殖与保藏
黑曲霉1234菌株购自亚马逊培养物保藏中心（CFAM-Fiocruz），为分离自巴西亚马逊州伊兰杜巴Serra Baixa社区饮用水中的野生菌株。黑曲霉在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上于30°C繁殖7天，直至观察到密集的黑色孢子形成。收集孢子时，向平板加入2 mL无菌0.9% NaCl溶液，用Drigalski涂布器刮取并转移含孢子溶液至50 mL离心管中。离心（9000 rpm，15分钟），弃上清，孢子与20%甘油按1:3比例混合，终浓度约10⁸孢子/mL。孢子悬液于−20°C保存。
【数据】培养基：PDA；温度：30°C；时间：7天；孢子收集液：0.9% NaCl；离心：9000 rpm×15 min；保存浓度：约10⁸孢子/mL；保存温度：−20°C
2.3 内切β-1,4-甘露聚糖酶的生产
取3 mL孢子悬液接种于300 mL改良Breccia培养基中，培养基成分（g/L）：NaNO₃ 1.2，KH₂PO₄ 3.0，K₂HPO₄ 6.0，CaCl₂·2H₂O 0.05，MgSO₄·7H₂O 0.2，FeSO₄·7H₂O 0.002，CoCl₂·6H₂O 0.016，MnSO₄·4H₂O 0.005，ZnSO₄·7H₂O 0.0014，酵母提取物12，LBG 30（溶于0.05 M柠檬酸盐缓冲液，pH 4.8），置于1 L锥形瓶中[23]。锥形瓶在轨道摇床中以200 rpm、30°C振荡培养7天。从培养第3天至第7天，每24小时间隔测定内切β-1,4-甘露聚糖酶活性。活性达峰期的培养物经玻璃纤维滤膜真空泵过滤，滤液（粗酶提取物）用于内切β-1,4-甘露聚糖酶纯化及生化研究。
【数据】接种量：3 mL孢子悬液/300 mL培养基；培养基：改良Breccia（含30 g/L LBG，pH 4.8）；转速：200 rpm；温度：30°C；培养时间：7天；取样间隔：24 h
2.4 膜超滤、凝胶过滤和离子交换色谱纯化酶
过滤后的培养上清液用10 kDa膜（Amicon搅拌超滤系统，Merck，德国）浓缩。取10 mL截留液，随后通过Sephadex® G-75高分辨率柱（60 × 2.6 cm）（GE Healthcare Life Sciences，美国）进行尺寸排阻色谱分离。色谱柱预先用含0.15 M NaCl的50 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）平衡。样品以20 mL/h流速洗脱，收集4.0 mL级分，通过280 nm吸光度检测内切β-1,4-甘露聚糖酶活性和蛋白浓度。具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的级分进一步用DEAE-Sephacel™柱（30 × 1.6 cm）（GE Healthcare Life Sciences，美国）进行离子交换色谱分析。色谱柱预先用乙酸钠缓冲液平衡，以线性NaCl梯度（0–1 M）洗脱。样品以40 mL/h流速洗脱，收集4 mL具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性的级分，合并后于4°C保存备用。蛋白浓度另按Lowry法[24]以牛血清白蛋白为标准测定。SDS-PAGE电泳（Mini-PROTEAN Tetra Cell，BIO-RAD，美国）用于评估粗酶及各纯化步骤所得级分的蛋白分离情况、潜在同工酶及均一程度。实验使用12%聚丙烯酰胺凝胶，胶体考马斯亮蓝染色。另制备含0.1% LBG的平行SDS-PAGE凝胶进行酶谱（zymogram）分析。电泳后，凝胶在反应缓冲液中孵育使LBG被酶水解，用刚果红染色[25]显现内切β-1,4-甘露聚糖酶活性条带。
【数据】超滤膜截留：10 kDa；凝胶过滤柱：Sephadex® G-75（60×2.6 cm）；平衡缓冲液：50 mM乙酸钠（pH 5.0）+0.15 M NaCl；洗脱流速：20 mL/h；级分体积：4.0 mL；离子交换柱：DEAE-Sephacel™（30×1.6 cm）；洗脱梯度：0–1 M NaCl；洗脱流速：40 mL/h；SDS-PAGE凝胶浓度：12%；酶谱凝胶含0.1% LBG
2.5 内切β-1,4-甘露聚糖酶活性及动力学参数测定
内切β-1,4-甘露聚糖酶活性测定方法为：250 µL酶溶液与250 µL LBG（0.5%，溶于50 mM柠檬酸盐缓冲液，pH 4.8）混合，于50°C反应10分钟。还原糖释放量用二硝基水杨酸试剂[26]测定。以甘露糖（≥99%，Sigma-Aldrich，美国）为标准品进行外标校准。内切β-1,4-甘露聚糖酶活性定义为每分钟每毫升酶溶液释放的还原糖微摩尔数。米氏常数（Kₘ）和最大反应速率（Vₘₐₓ）以LBG为底物测定，底物溶于50 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 3.9），浓度范围为0.25至5.00 mg/mL。测定时取50 µL酶液（蛋白浓度0.03 mg/mL）与100 µL不同浓度的LBG在60°C反应10分钟。动力学参数通过将实验数据拟合至米氏方程，采用非线性回归分析估算。使用GraphPad Prism软件（版本11，GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣迭戈）进行非线性回归拟合获得动力学参数。
【数据】酶活测定：250 µL酶+250 µL LBG（0.5%，pH 4.8），50°C×10 min；动力学测定：50 µL酶（0.03 mg/mL蛋白）+100 µL LBG（0.25–5.00 mg/mL，pH 3.9），60°C×10 min
2.6 质谱法测定内切β-1,4-甘露聚糖酶纯度
取5 µg蛋白等分试样，用10 mM碳酸氢铵（AmBic，pH 8.5）定容至60 µL，加入25 µL 0.2% RapiGest，于80°C孵育15分钟。样品用3 mM二硫苏糖醇（DTT）于60°C还原30分钟，然后用9 mM碘乙酰胺于室温烷基化30分钟。随后样品用胰蛋白酶（1:40）于37°C酶解18小时。酶解液用10 µL 5%三氟乙酸酸化，于37°C孵育90分钟，然后于4°C以14,000 rpm离心30分钟。收集上清液，用POROS 20 R2反相树脂（Thermo Fisher Scientific）填充的移液器吸头进行固相萃取纯化。纯化后的酶解产物经真空离心干燥，重悬于40 µL含0.1%甲酸的水/乙腈（97:3）中，供LC-MS系统进样。
样品用液相色谱-质谱联用系统分析，采用Nexera X2系统（Shimadzu），配备Ascentis C18色谱柱（150 × 1 mm，3 µm；Supelco）。色谱分离使用流动相A（含0.1%甲酸的水，v/v）和B（含0.1%甲酸的乙腈，v/v）梯度洗脱，程序如下：1分钟（3% B），19分钟（40% B），20分钟（95% B），30分钟（95% B），31分钟（3% B），45分钟（3% B）。进样量2 µL，柱温50°C，流速0.09 mL/min。柱流出液引入Maxis Impact质谱仪（Bruker Daltonics），配备ESI-Q-TOF配置。电喷雾电离参数：雾化气压力2 bar，干燥气流8 L/min，温度200°C，毛细管电压4500 V，端板偏移−500 V。质谱数据以数据依赖采集模式（DDA/AutoMS）获取，每循环隔离并碎裂最多三个前体离子，扫描范围50–1500 m/z，采集速率3 Hz。原始LC-MS/MS数据用Proteome Discoverer软件（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）处理，使用Sequest HT搜索引擎进行肽段和蛋白质鉴定。MS/MS谱图搜索针对黑曲霉蛋白数据库。胰蛋白酶为消化酶，允许最多两次漏切。蛋白质鉴定基于肽段-谱图匹配、唯一肽段数、序列覆盖率和Sequest HT评分（表S1）进行评估。蛋白质鉴定后，手工检查已鉴定肽段位置与预测构成催化位点和底物结合裂隙的残基之间的关系。
【数据】蛋白量：5 µg；还原：3 mM DTT，60°C×30 min；烷基化：9 mM碘乙酰胺，室温×30 min；酶解：胰蛋白酶1:40，37°C×18 h；酸化：10 µL 5% TFA，37°C×90 min；离心：14,000 rpm×30 min，4°C；LC-MS进样体积：2 µL；柱温：50°C；流速：0.09 mL/min；梯度：3%–95% B，45 min
2.7 pH和温度对内切β-1,4-甘露聚糖酶活性及热稳定性的影响
纯化内切β-1,4-甘露聚糖酶的最适温度和pH采用中心复合旋转设计（CCRD 2²）进行评估，共11组实验（表……原文未完整呈现）。
研究结果
3.1 黑曲霉1234菌株内切β-1,4-甘露聚糖酶的纯化
曲霉属产内切β-1,4-甘露聚糖酶因其在甘露聚糖水解中的生物技术价值而被广泛研究。课题组前期研究已将黑曲霉1234菌株鉴定为高效的内切β-1,4-甘露聚糖酶生产者[32]。因此，选用该菌株进行内切β-1,4-甘露聚糖酶的纯化和生化表征。产酶时间曲线见补充材料（图S2）。根据该曲线，第6天收集上清液，此时内切β-1,4-甘露聚糖酶活性达到峰值（15.30 ± 0.74 IU/mL）。超滤（10 kDa截留）将酶活性浓缩至57.13 IU/mL（3.74倍），而渗透液中仅残留1.00 IU/mL，表明酶被有效截留。
浓缩酶提取物经Sephadex® G-75柱尺寸排阻色谱分离，检测到三个主要蛋白峰（图S3）。内切β-1,4-甘露聚糖酶活性出现两个相邻峰：第一个峰位于第40–47级分，命名为MAN1234A，总活性为1.31 IU/mL；第二个较小的峰为主峰的肩峰，位于第48–54级分，命名为MAN1234B，活性为0.92 IU/mL。尽管MAN1234B丰度较低且未与主峰完全分离，但该峰在280 nm低蛋白吸光度区域被洗脱，已与主峰相关的大部分蛋白分离。两个级分分别合并以进行后续纯化。
MAN1234A和MAN1234B级分随后经DEAE-Sephacel™柱离子交换色谱纯化。MAN1234A的洗脱图谱显示四个蛋白峰（图S4A），其中只有一个酶活性峰（第45–54级分），蛋白丰度较低。相比之下，MAN1234B的活性峰（第57–62级分）与主要蛋白峰（第58–63级分）重合，表明该级分中内切β-1,4-甘露聚糖酶活性与优势蛋白相关（图S4B）。纯化结果汇总于表1。采用的方法最终从离子交换色谱获得两个纯化级分MAN1234A-IE和MAN1234B-IE，其内切β-1,4-甘露聚糖酶比活力分别为79.30和44.80 IU/mg，较粗酶提取物提高了4–7倍。纯化方案实现4.05倍纯化，回收率为0.30%。这些数值低于米曲霉β-甘露聚糖酶的报道值（11.06倍纯化；6.92%回收率）[68]。然而，在多步纯化过程中，当样品纯度优先于回收率时，此类损失是常见的。因此，纯化级分被认为适用于本研究中的生化和结构表征。
【数据】峰值活性：15.30 ± 0.74 IU/mL（第6天）；超滤后活性：57.13 IU/mL（3.74倍）；渗透液残留：1.00 IU/mL；MAN1234A活性：1.31 IU/mL（级分40–47）；MAN1234B活性：0.92 IU/mL（级分48–54）；比活力：MAN1234A-IE 79.30 IU/mg，MAN1234B-IE 44.80 IU/mg；纯化倍数：4.05倍；回收率：0.30%
3.2 黑曲霉1234菌株内切β-1,4-甘露聚糖酶的分子表征与纯度评估
纯化过程中各步骤酶纯度通过SDS-PAGE和酶谱分析评估。每经一步色谱纯化，蛋白条带数量逐步减少，高分子量蛋白消失，剩余条带分辨率提高。DEAE-Sephacel™色谱后，MAN1234A-IE级分显示约50 kDa处有一条优势蛋白条带，伴有残留拖尾，表明存在少量杂质。相比之下，MAN1234B-IE仅显示一条相似表观分子量的单一蛋白条带，表明纯度更高（图1）。酶谱分析确认两个纯化级分均具有内切β-1,4-甘露聚糖酶活性，与浓缩粗提取物中观察到的条带一致，活性条带对应SDS-PAGE上约50 kDa的蛋白。高分子量条带未检测到活性，表明纯化策略成功分离了目标酶。
所得分子量与丝状真菌产生的其他内切β-1,4-甘露聚糖酶一致。大豆壳培养的黑曲霉产生表观分子量为45 kDa的内切β-1,4-甘露聚糖酶[33]。Clonostachys byssicola甘露聚糖酶分子量范围为36.6至53 kDa[34]，而塔玛里曲霉在半乳甘露聚糖上生长产生53 kDa的甘露聚糖酶[35]。黑曲霉经离子交换纯化的甘露聚糖酶分子量为66 kDa[36]，而Penicillium freii的甘露聚糖酶表观分子量为72 kDa[37]。该表观分子量范围与真菌分泌型β-甘露聚糖酶中常见的异质性一致——这些酶可能在同工酶组成、成熟状态、糖基化和纯化历史方面存在差异。
然而，仅靠电泳分析不足以确定MAN1234A-IE和MAN1234B-IE代表不同的酶还是同一蛋白的不同纯化状态。分子量相近的同工酶现象已有充分文献记载。例如，Puchart[38]报道了烟曲霉产生的两种内切β-1,4-甘露聚糖酶同工酶（60和63 kDa）。Stålbrand等[39]在里氏木霉中鉴定出51和56 kDa的同工酶。因此，多条电泳条带或紧密相关的色谱级分不一定代表不同的同工酶，也可能反映共纯化蛋白或同一酶的翻译后修饰形式。为此，两个级分均进行了LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS在两个色谱级分中鉴定出同一种来自黑曲霉的GH5亚家族7内切β-1,4-甘露聚糖酶（UniProt登录号A0A0N7AZ90，GenBank登录号AJZ68815.2）[40]。蛋白质鉴定由45%序列覆盖率、36个唯一肽段、121个肽段-谱图匹配和327.1的Sequest HT评分支持（表S1）。MAN1234A-IE含有额外的共纯化蛋白，而MAN1234B-IE未检测到污染蛋白，这与电泳图谱一致，证明两个级分含有相同目标β-甘露聚糖酶但纯度不同。
匹配的数据库蛋白预测分子量为41.2 kDa，理论等电点为4.61。SDS-PAGE观察到的较高表观分子量（约50 kDa）可能由糖基化解释——序列中鉴定出三个潜在N-糖基化位点（图S5），且已知黑曲霉对分泌蛋白进行广泛糖基化[35]。与CAZy数据库中已表征GH5_7条目比对分析，将该蛋白归入保守的黑曲霉Man5A/AnMan5A组。匹配序列与黑曲霉CBS 513.88的Man5A（CAK96471.1 [41]）具有100%同一性和100%查询覆盖率，与黑曲霉LW-1/E-30的AnMan5A（AEY76082.1 [42]）具有99.22%同一性和100%查询覆盖率，与黑曲霉BK01的部分ManBK序列（ACJ06979.1 [43]）具有99.42%同一性和90%查询覆盖率。基于LC-MS/MS鉴定结果及与已表征黑曲霉Man5A/AnMan5A酶的密切关系，纯化酶被命名为AnMan5A-like GH5_7内切β-1,4-甘露聚糖酶（AnMan5A-like）。CAZy中已表征黑曲霉GH5_7 β-甘露聚糖酶的比较概览见表S3。尽管这些酶具有相似的理化性质——特别是酸性pH最适和真菌分泌型β-甘露聚糖酶典型的分子量——但在最适温度、动力学参数、底物特异性和水解产物方面存在显著差异。这些差异可能反映菌株特异性特征以及表达系统、纯化策略、糖基化、测定条件和底物组成的差异。最后，鉴定肽段被手工定位映射……（原文未完整呈现）。
讨论与解读
讨论
黑曲霉内切β-1,4-甘露聚糖酶的生产、纯化和表征相较于其他碳水化合物活性水解酶仍研究不足。本研究从亚马逊雨林分离的黑曲霉菌株中纯化并全面表征了一种AnMan5A-like GH5_7内切β-1,4-甘露聚糖酶。该酶在酸性条件和中等偏高温度下具有最适活性，同时具有长期热稳定性，支持其在工业甘露聚糖水解中的潜力。动力学分析表明其催化性能与其他真菌内切β-1,4-甘露聚糖酶一致。水解实验确认了内切作用模式，纯化酶主要产生DP2和DP3甘露寡糖，未检测到甘露糖；而粗酶提取物因辅助酶的作用产生更广泛的产品谱，包括甘露糖。结构分析进一步支持该酶属于黑曲霉GH5_7 Man5A/AnMan5A组的分类，并为其底物结合架构和水解行为提供了补充见解。生化、蛋白质组学、结构和水解分析的综合结果凸显了亚马逊黑曲霉菌株作为工业相关甘露聚糖酶来源的价值。重要的是，纯化酶与粗酶制剂的不同催化特征表明它们在生物加工中具有不同的应用潜力——纯化酶适用于需要明确产物谱的应用，而粗酶可产生更广泛的产品谱。
编译者解读
该研究在酶纯化策略上采用超滤—凝胶过滤—离子交换三步法，最终获得比活力79.30 IU/mg的AnMan5A-like酶，4.05倍纯化倍数和0.30%回收率虽不高，但换来了电泳级别的纯度。从合成生物学应用视角看，该酶最突出的卖点是酸性条件下（pH 3.9）的高活性和50–60°C下72小时不丧失活性的热稳定性——这恰好契合工业生物炼制的严苛条件。值得注意的是，酶谱和质谱联用确认了同一GH5_7酶在不同色谱级分中的存在，避免了将同一蛋白的糖基化变体误判为同工酶的常见陷阱。不过，该研究仍停留在野生菌株天然酶的纯化表征层面，未涉及异源表达和蛋白工程改造，后续若能在工业宿主中实现重组表达并针对底物特异性进行定向进化，其应用潜力将进一步释放。
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2026.110951