来源：Metabolic engineering of Pseudomonas sp. NGC7 for glucose-free 4-hydroxybenzoic acid production（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
4-羟基苯甲酸（HBA）是特种塑料和精细化学品的重要芳香族构件。本研究以甘蔗渣碱处理液中的混合芳香族化合物为碳源，通过敲除HBA羟化酶基因（pobA）和MarR型转录调控因子基因（ferR），构建了不含质粒的双敲除菌株NGC7194。该菌株在不添加糖类的条件下，从碱性提取物中高效生产HBA，产量超过6 g/L，摩尔产率超过90%。研究证明，通过代谢通量调控实现"无糖HBA生产"完全可行。
研究背景
化石资源的过度消耗导致温室气体排放持续上升，全球变暖加速。为摆脱化学工业对化石资源的依赖并实现碳中和，利用植物源可再生资源生产平台化学品受到越来越多的关注。HBA是高性能液晶聚合物和对羟基苯甲酸酯类抗菌剂的重要组成单元，传统上通过Kolbe-Schmitt工艺生产，该工艺依赖化石原料且能耗极高。过去几十年，多种微生物——包括大肠杆菌、恶臭假单胞菌、台湾假单胞菌和谷氨酸棒杆菌——已被相继改造用于从可再生资源生产HBA。本研究聚焦于假单胞菌NGC7，该菌株经代谢工程改造后，能以甘蔗渣碱处理得到的芳香族混合物为原料生产HBA。
研究方法
2.1 浓缩甘蔗渣碱提取物（CBAE）的制备
在泰国Cellulosic Biomass Technology Ltd.运营的纤维素糖生产系统中，甘蔗渣经研磨后用温和碱处理以溶解木质素。所得滤液经压滤机过滤后，用HCl调至pH 5。酸化产生的沉淀（含木质素来源的高分子量芳香族化合物）经滤除后，所得滤液（称为甘蔗渣碱提取物）含有来自羟基肉桂酰酯水解的可溶性芳香族化合物、部分解聚的木质素片段及其他低分子量化合物。如先前报道（Akutsu et al., 2022），该提取物含CA、FA、HBN、HBA、VN、VA、乙酸、甲酸、乳酸和琥珀酸，但不含任何葡萄糖或木糖。
由东丽株式会社前沿研究实验室（日本镰仓）提供的甘蔗渣碱提取物，用HCl酸化（pH≒3），然后用三分之一体积的乙酸乙酯萃取三次。合并的乙酸乙酯级分经蒸发干燥。所得提取物溶于NaOH水溶液（pH=8）。沉淀经离心去除（8,000 × g，25°C，10 min），上清液经0.22 μm膜过滤器过滤，获得浓缩甘蔗渣碱提取物（CBAE）。
CBAE中芳香族化合物的定量采用HPLC [Agilent 1200系列（Agilent Technologies, Inc.）]，配备ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（粒径5 μm，ϕ 4.6 × 150 mm，Agilent Technologies, Inc.），柱温40°C，流动相梯度洗脱[溶剂A：50%（v/v）乙腈和1%（v/v）乙酸水溶液；溶剂B：5%（v/v）乙腈和1%（v/v）乙酸水溶液]。进样前用溶剂B平衡色谱柱。样品进样后，溶剂A在8分钟内从0%升至20%，随后5分钟内升至100%，并保持5分钟。流速为1 mL/min，检测波长为254 nm（VA和HBA）、280 nm（HBN、SN和SA）和330 nm（CA、FA和VN）。
CBAE主要成分按浓度递减顺序为：CA（68.50 g/L，417.3 mM）、FA（9.43 g/L，48.6 mM）、VN（2.13 g/L，14.0 mM）、HBN（1.87 g/L，15.3 mM）、SN（0.30 g/L，1.6 mM）、SA（0.26 g/L，1.3 mM）、HBA（0.25 g/L，1.8 mM）和VA（0.01 g/L，0.1 mM）。CBAE于−80°C保存备用。
mock CBAE根据CBAE的芳香族组成，使用市售试剂人工配制，各组分浓度分别为：CA（68.50 g/L）、FA（9.43 g/L）、HBA（0.25 g/L）、HBN（1.87 g/L）、SA（0.26 g/L）、SN（0.30 g/L）、VA（0.01 g/L）、VN（2.13 g/L）。
【数据】酸化pH：5；萃取溶剂：乙酸乙酯（1/3体积×3次）；离心：8,000 × g，25°C，10 min；滤膜：0.22 μm；HPLC柱温：40°C；流速：1 mL/min；检测波长：254/280/330 nm；CBAE主要成分及浓度：CA 68.50 g/L、FA 9.43 g/L、VN 2.13 g/L、HBN 1.87 g/L、SN 0.30 g/L、SA 0.26 g/L、HBA 0.25 g/L、VA 0.01 g/L；保存温度：−80°C
2.2 缺失HBA羟化酶（pobA）和MarR型转录抑制因子（ferR）菌株的构建
pobA敲除菌株的构建：将大肠杆菌S17-1λ pir（表S2）用pTS220（表S3）转化，涂布于含25 mg/L卡那霉素（Km）的LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）平板上，37°C培养。通过双亲株接合转移法（El-Sayed et al., 2001）将质粒pTS220转入NGC7。挑取NGC7单菌落接种于10 mL LB中，30°C振荡培养（180 rpm，16 h）。S17-1λ pir/pTS220在含25 mg/L Km的LB中于相同条件下培养。各取0.1 mL培养液接种于10 mL LB（S17-1λ pir/pTS220添加25 mg/L Km），振荡培养至600 nm光密度（OD600）达0.3。OD600值用数字比色计（miniphoto 518R，TAITEC Corporation）监测。各取1 mL培养液于管中混合，用配备无菌滤膜（VSWP01300，MF-Millipore，0.025 μm，Merck KGaA）的无菌过滤装置（SX0002500，Millipore Swinnex Filter Holder，25 mm，Merck KGaA）过滤菌悬液。过滤后将滤膜置于LB平板上，菌面朝上，30°C孵育4 h促进接合。滤膜上生长的细胞用0.5 mL无菌生理盐水悬浮，梯度稀释后涂布于含25 mg/L Km和100 mg/L氨苄青霉素（Amp）的LB平板，30°C培养。挑取新形成的菌落至含Km和Amp的LB平板，30°C培养。随后将这些分离株涂布于含25%（w/v）蔗糖的LB平板进行反向筛选（30°C，24–48 h）。平板上生长的菌落在LB平板上传代培养（30°C）。为验证选择标记的切除，对克隆进行Km敏感性测试。目标基因pobA的敲除通过PCR确认，引物对为5′-AGTTGCAAGCTCGGAACATT-3′和5′-CATCGGCCATATTGATACCC-3′。所得⊿pobA菌株命名为NGC704（表S2）。
ferR敲除菌株的构建：将NGC715（表S2）用pK18⊿ferR（表S3）通过电穿孔法（25 kV/cm）转化，所得转化子涂布于含83.5 mg/L Km的LB平板，30°C培养。Km抗性克隆在YT培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L Bacto胰蛋白胨、250 g/L蔗糖）中30°C振荡培养以促进反向筛选，随后划线于YT琼脂平板，30°C培养。ferR的敲除通过PCR确认，引物对为5′-GAAGCTGTTTTCGCATTCCA-3′和5′-TTGTGCGAGACCTGACCATC-3′。所得⊿ferR菌株命名为NGC784（表S2）。
ferR和pobA双敲除菌株的构建：将NGC784用pK18⊿pobA按上述双亲株接合法转化。pobA的敲除通过PCR确认，引物对为5′-TAAAACGACGGCCAGTGCCAAAGGACATGGCGGGTTTCCT-3′和5′-ATTCGAGCTCGGTACCCGGGGAGGTGCGACGTGGAAATAC-3′。所得双敲除菌株命名为NGC7194（表S2）。
【数据】Km浓度：25 mg/L（pobA构建）/83.5 mg/L（ferR构建）；Amp浓度：100 mg/L；蔗糖浓度：25%（w/v）；接合时间：4 h；接合温度：30°C；电穿孔电压：25 kV/cm；培养温度：30°C；振荡转速：180 rpm；培养时间：16 h；OD600目标值：0.3；滤膜孔径：0.025 μm
2.3 ferR（MarR型转录调控因子）敲除对CA和FA生长的影响
将NGC7和NGC782分别接种于10 mL LB中，振荡培养（160 rpm，30°C，16 h）。细胞经离心收集（5,000 × g，5 min，4°C），用MMx-3缓冲液[34.2 g/L Na2HPO4·12H2O、6.0 g/L KH2PO4、2.5 g/L (NH4)2SO4、1.0 g/L NaCl]洗涤两次，重悬于同种缓冲液中。细胞生长在MMx-3培养基[34.2 g/L Na2HPO4·12H2O、6.0 g/L KH2PO4、2.5 g/L (NH4)2SO4、1.0 g/L NaCl、493 mg/L MgSO4·7H2O、5 mg/L FeSO4·7H2O、14.7 mg/L CaCl2·2H2O]（Sonoki et al., 2018）中监测，分别添加5 mM CA或5 mM FA作为唯一碳源。96孔微量滴定板中的接种量设为初始OD600为0.1。平板于30°C连续振荡（567 cpm）培养，OD600用酶标仪（Epoch 2，Agilent Technologies）定期测量。CA和FA溶于二甲亚砜，浓度为500 mM，作为储备液使用。
【数据】离心：5,000 × g，5 min，4°C；培养基：MMx-3；碳源：5 mM CA或5 mM FA；初始OD600：0.1；培养温度：30°C；振荡转速：567 cpm；储备液浓度：500 mM（DMSO溶解）
2.4 ferR敲除对fcs和ech表达的定量分析
将NGC7和NGC782分别接种于10 mL LB中，振荡培养（160 rpm，30°C，16 h）。细胞经离心收集（5,000 × g，5 min，4°C），用MMx-3缓冲液洗涤两次，重悬于同种缓冲液中。将细胞悬液接种于含5 mM葡萄糖作为唯一碳源的MMx-3培养基中，初始OD600为0.2，振荡培养（160 rpm，30°C）。收集对数中期的细胞，用Illustra RNAspin（Cytiva，Marlborough，MA）提取总RNA。RNA浓度定量、cDNA合成和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）按先前描述的方法进行（Ookawa et al., 2025）。本研究所用特异性引物对如下：ech，5′-CTTCTACAGCAAGCCAACCA-3′和5′-GCCCCAGTTGATTTCAGACA-3′；fcs（引物序列原文未完整呈现）。
【数据】离心：5,000 × g，5 min，4°C；培养基：MMx-3 + 5 mM葡萄糖；初始OD600：0.2；培养温度：30°C；振荡转速：160 rpm；RNA提取试剂盒：Illustra RNAspin
研究结果
3.1 高效HBA生产平台菌株的工程改造
CBAE含有H型木质素来源化合物（CA、HBN和HBA）、G型化合物（FA、VN和VA）以及S型化合物（SN和SA），具体组成见材料与方法部分。假单胞菌NGC7作为微生物底盘，具有利用多种芳香族化合物作为碳源和能量来源的代谢能力（图1）。因此，推测NGC704能将CA和HBN按化学计量关系转化为HBA，同时代谢其他芳香族化合物FA、VN、VA、SN和SA。
如图2A和B所示，NGC704确实在mock CBAE和CBAE中生长并产生HBA。此外，当CBAE存在时，NGC704的生长得到改善。CBAE由甘蔗渣碱提取物经酸化和乙酸乙酯萃取制备——该提取物除芳香族化合物外还含有乙酸、甲酸、乳酸和琥珀酸，但不含葡萄糖或木糖（Akutsu et al., 2022）。这些有机酸在酸性条件下可被共萃取到乙酸乙酯中，而亲水性氮源（如氨基酸和肽）及糖类不会分配进入乙酸乙酯。已有报道称NGC7衍生菌株能利用这些共萃取的有机酸（甲酸盐除外），且在含甘蔗渣碱提取物的培养基中生长得到促进（Alam et al., 2026）。因此，这些有机酸可能是促进细胞生长的关键因素。
尽管NGC704在CBAE中表现出较高的HBA产率，但CA和FA的转化速率在68 h培养后仍减弱且未完全转化（图2A和B）。由于阿魏酰辅酶A合成酶（Fcs）和烯酰辅酶A水合酶/裂解酶（Ech）似乎是CA和FA分解代谢途径中的两个限速酶（图1），异源表达fcs和ech有望加速其降解速率。为此，将携带乳糖启动子控制下fcs和ech的质粒（pTS093_fcs_ech）导入NGC704，评估转化株NGC704/pTS093_fcs_ech的HBA生产能力。结果表明，CA和FA的转化率并未显著提高（图S1）。然而，将底物消耗量相对于⊿OD600值（OD600_68 h–OD600_0 h）归一化后显示，pTS093_fcs_ech导入NGC704使CA和FA的转化效率略有提升（表S4）。
荧光假单胞菌BF13中fcs、ech和vdh（香草醛脱氢酶）的转录调控由MarR型转录调控因子FerR介导。ferR的缺失导致CA和FA上的生长动力学加速（Calisti et al., 2008）。在NGC7中鉴定到一个ferR基因（PSN_2461）的直系同源物，其与BF13的FerR具有57%的氨基酸序列同一性。但与BF13不同的是，该基因在NGC7基因组上位于fcs、ech和vdh基因簇之外（图3A）。
我们构建了ferR缺失突变株（NGC784），并评估其在CA和FA上的生长情况。在两种底物上，NGC784均表现出比野生型NGC7更短的延滞期（图3B、C），表明FerR在NGC7中作为fcs、ech和vdh的转录抑制因子发挥作用。为确认NGC784中ferR缺失是否导致ech/vdh/fcs基因簇表达水平升高，进行了qRT-PCR分析（图3D）。位于基因簇两端的ech和fcs（图3A）均显著上调，表明NGC784在CA和FA上生长的增强源于该基因簇的去抑制。
在NGC784中敲除pobA后，所得菌株NGC7194使用CBAE进行HBA生产评估。补料分批培养数据显示，ferR的缺失提高了CA和FA的转化效率（图2C和D）。与将fcs和ech通过质粒导入NGC704相比，靶向敲除调控这些分解代谢操纵子的负调控因子被证明更为有效。虽然乳糖启动子已知可在NGC7菌株背景下发挥作用（Akutsu et al., 2022；Sonoki et al., 2018），暗示基因表达成功，但通过ferR敲除实现的內源途径去调控为芳香族转化提供了更优越的代谢通量。
此外，已有报道称乳糖启动子能在恶臭假单胞菌KT2440基因组中实现高水平的基因表达（Elmore et al., 2017）。基于与伯杰氏手册的比较，先前曾提出NGC7与恶臭假单胞菌之间存在系统发育关系（Akutsu et al., 2022）。因此，乳糖启动子被认为能够驱动异源基因fcs和ech的增强表达。然而，CA和FA的转化率并未显著提高。相比之下，敲除已知促进CA和FA降解的转录抑制因子（图3）被证明是有效的。
用于fcs/ech表达的pTS093表达载体是pJB866（Blatny et al., 1997）衍生质粒，通过内膜蛋白TetA赋予四环素抗性。已有报道称TetA的过量生产会增加宿主细胞对氨基糖苷类抗生素（Hasan et al., 2023）和芳香族化合物β-侧柏素（Stone et al., 2016）的敏感性。鉴于CA本身具有强烈的膜破坏特性（Lou et al., 2012），基于质粒的表达性能受限可能归因于TetA表达与CA毒性的协同毒性效应，该效应在mock和实际CBAE的CA转化过程中损害了细胞性能。相比之下，ferR的缺失在不引入膜蛋白的情况下解除了內源ech/vdh/fcs基因簇的抑制，从而避免了这种协同毒性，实现了更优越的转化性能。
重要的是，最终菌株NGC7194不含质粒，消除了培养期间质粒稳定性和代谢负担的担忧。这一特性还消除了对抗生素选择的需求，使NGC7194成为工业生物生产中高度实用且经济可行的平台。基于上述结果，NGC7194被确定为从CBAE生物生产HBA的最适菌株。
【数据】氨基酸序列同一性：57%（FerR/PSN_2461 vs BF13 FerR）；培养时间：68 h；HBA产率：NGC704在CBAE中较高（具体数值原文未详述）；补料分批模式；qRT-PCR显示ech和fcs显著上调
3.2 NGC7194从CBAE生产HBA的培养参数优化
在分批培养中，研究了DO浓度、pH和温度对NGC7194从mock CBAE生产HBA的影响，以确定最大化HBA生产效率的培养参数。根据先前报道（Akutsu et al., 2022），在评估DO浓度时将温度（30°C）和pH（7.0）固定。NGC7194在含mock CBAE的MMx-3中于不同DO水平（5%、10%、20%和30%）下培养。在所考察的DO水平中，20%最为有效，产率达98.8 mol%，且mock CBAE中其他芳香族化合物被完全消耗（图S2）。较高的氧气供应有利于生长；然而，DO为30%时对NGC7194的生长和HBA生产能力均产生负面影响——尽管该菌株与好氧菌恶臭假单胞菌密切相关（Akutsu et al., 2022）。当DO水平超过细胞在有氧呼吸中将氧气作为末端电子受体的利用能力时，过量的氧气可能导致活性氧的形成——即使存在过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶也是如此。
接下来，在四种温度条件（25°C、28°C、30°C和32°C）下考察温度的影响，pH和DO浓度分别恒定在7.0和20%（图S3）。NGC7194在30°C时获得最大HBA产率和比生长速率。
（后续培养参数优化内容——包括pH优化、补料策略、无糖HBA生产验证等——因原文节选在此截断，未能完整呈现。原文结果部分后续内容涉及NGC7194在mock CBAE和CBAE中的无糖HBA生产验证，产量超过6 g/L，摩尔产率超过90%。）
【数据】DO优化范围：5%、10%、20%、30%；最优DO：20%；最优DO下HBA产率：98.8 mol%；温度优化范围：25°C、28°C、30°C、32°C；最优温度：30°C；pH固定值：7.0；最优条件下HBA产量：>6 g/L；摩尔产率：>90%
讨论与解读
本研究通过两步基因敲除策略——先敲除pobA阻断HBA的进一步降解，再敲除ferR解除对羟基肉桂酸降解途径的转录抑制——构建了无需质粒的双敲除菌株NGC7194。与异源表达限速酶fcs和ech相比，敲除负调控因子的策略在提高CA和FA转化效率方面更为有效。研究还发现，质粒介导的基因过表达可能因TetA膜蛋白与CA的协同毒性而受限，这为芳香族化合物生物转化中表达系统的选择提供了重要参考。
值得关注的是，该研究实现了在不添加任何糖类的条件下，从真实的木质纤维素碱处理液（而非人工模拟液）中高效生产HBA。这为木质纤维素生物精炼中"糖类优先"的传统思路提供了差异化路径——直接将碱处理液中的芳香族混合物作为碳源，绕开了糖化步骤。
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编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于"调控而非过表达"的策略选择——敲除一个转录抑制因子（ferR）比导入多拷贝质粒过表达限速酶效果更好，且避免了质粒维持带来的代谢负担和抗生素依赖。从合成生物学应用角度看，无质粒菌株在工业放大中具有明显优势：无需抗生素筛选压力、无质粒不稳定性问题、更符合经济性要求。但需注意，本研究的成功高度依赖NGC7本身具备完整的芳香族化合物代谢网络，该底盘对多种木质素来源芳香族单体均有天然利用能力。将这一策略移植到其他工业菌株时，需评估底盘菌株的內源代谢能力是否足够。此外，真实CBAE中除芳香族化合物外还含有多种有机酸，其对菌株生长的促进作用暗示了复杂底物中组分间协同效应的潜在价值——这一点在合成生物学底物设计中往往被忽视。
参考来源
Wang, Y. Metabolic engineering of Pseudomonas sp. NGC7 for glucose-free 4-hydroxybenzoic acid production. Bioresource Technology, 2027.
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135689
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135689