来源：Bioprinted core-shell living material platform for spatially controlled encapsulation of Bacillus subtilis and sustained metabolite exchange（Bioactive Materials）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
抗菌素耐药性（AMR）已成为全球健康危机，传统化学消毒剂的频繁使用反而加速了环境细菌耐药性的发展。本研究利用数字光处理（DLP）生物打印技术，构建了一种PEGDA壳层包封枯草芽孢杆菌孢子的核壳结构活性材料。该平台不仅支持孢子长期存活，还能抵御紫外线、乙醇和干燥等环境胁迫达4周，并将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的生长抑制约一个数量级。这一概念验证为生物防治剂的工程化部署提供了全新路径。
研究背景
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是院内感染的主要病原体之一，常通过接触污染表面传播。尽管美国医院在降低MRSA感染率方面做出了持续努力，但进展已趋于停滞。传统表面消毒依赖频繁使用化学消毒剂，这种做法可能加速环境中细菌耐药性的发展，因此亟需开发替代性生物防治方法。
芽孢杆菌属物种已被证明能够主动控制建筑环境表面的潜在致病菌。含有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌孢子的商业化清洁产品，在硬表面上可使MRSA负担降低50%至89%。然而，这些应用依赖频繁补加孢子以维持防治效果，限制了其长期实用性。如何将生物防治剂稳定固定于工程化支架中，实现持续功能，是当前面临的核心挑战。
研究方法
4.1 化学试剂
PEGDA（Mn = 700 Da和Mn = 250 Da）、甲基丙烯酸酐（MA）、酒石黄、海藻酸钠、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙胺（TEA）和异丙醇（IPA）购自Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。氯化钠（NaCl）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、甲醇、多聚甲醛和SYTOX™ Orange核酸染料购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）、2-吗啉乙磺酸（MES）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自东京化成工业（日本东京）。透明质酸（HA；分子量范围：10 kDa至约1.0 MDa）来自华熙生物（中国济南）。2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐（AEMA）购自Acros Organics（比利时海尔）。Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）购自Gibco（Thermo Fisher Scientific）。
【数据】试剂来源：Sigma–Aldrich、Thermo Fisher Scientific、东京化成工业、华熙生物、Acros Organics、Gibco；PEGDA分子量：700 Da和250 Da；HA分子量范围：10 kDa至约1.0 MDa
4.2 水凝胶合成
AlgMA水凝胶按照先前发表的方案合成。简要步骤如下：在含0.5 M NaCl的50 mM MES缓冲液中配制1%（w/v）海藻酸钠溶液，调节pH至6.5。加入NHS和EDC活化海藻酸盐骨架上的羧基，反应5分钟。随后引入AEMA，反应24小时。NHS:EDC:AEMA的摩尔比为1:2:1，AEMA添加浓度为每克海藻酸钠2.3 mmol。反应通过过量丙酮沉淀终止，产物溶于Milli-Q水，使用12–14 kDa截留分子量透析管对Milli-Q水透析3天。透析产物冻干保存。所有合成和纯化步骤均在室温下进行。
HAGM按照基于先前报道方法的改良程序合成。将1 g HA溶于100 mL 1:1（v/v）丙酮:水混合物中，搅拌过夜。逐滴加入1.8 mL TEA并充分混合，随后逐滴加入1.8 mL甲基丙烯酸缩水甘油酯。反应在持续搅拌下过夜进行。然后将反应混合物转移至3500 Da截留分子量透析管中，对去离子水透析48小时，每天换水三次。最终产物冷冻冻干保存。
【数据】AlgMA合成：1%（w/v）海藻酸钠，50 mM MES缓冲液，0.5 M NaCl，pH 6.5；NHS:EDC:AEMA摩尔比1:2:1；AEMA浓度2.3 mmol/g海藻酸钠；透析截留分子量12–14 kDa，3天；室温。HAGM合成：1 g HA溶于100 mL 1:1丙酮:水；TEA 1.8 mL；甲基丙烯酸缩水甘油酯1.8 mL；透析截留分子量3500 Da，48小时，每天换水3次
4.3 菌株与培养条件
枯草芽孢杆菌TH035为土壤分离株，选作野生型菌株，购自芽孢杆菌遗传保藏中心（BGSC）。向该菌株背景中引入诱导型GFP表达质粒以生成B. subtilis TH035（pSC01-GFP），具体如下所述。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌金黄色亚种Rosenbach TCH1516为临床分离株，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC；BAA-1717）。MRSA和枯草芽孢杆菌均在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB；1.7% w/v胰酶解酪蛋白胨、0.3% w/v大豆蛋白胨、0.5% w/v氯化钠、0.25% w/v磷酸氢二钾、0.25% w/v葡萄糖）中常规培养，CFU在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）上计数。枯草芽孢杆菌和MRSA培养物分别常规孵育于30°C和37°C，MRSA抑制实验在室温下进行，如下所述。
【数据】TSB成分：1.7% w/v胰酶解酪蛋白胨、0.3% w/v大豆蛋白胨、0.5% w/v氯化钠、0.25% w/v磷酸氢二钾、0.25% w/v葡萄糖；枯草芽孢杆菌培养温度：30°C；MRSA培养温度：37°C；MRSA抑制实验温度：室温
4.4 枯草芽孢杆菌菌株与质粒构建
为改善B. subtilis TH035的显微可视化效果，用可实现高水平GFP表达的质粒pSC01对其进行转化。pSC01质粒通过修饰穿梭质粒pLIKE-sipW-tasAss(30)-silk (10Ala)1构建。引入调控元件，并去除模板质粒中的无意义序列以提高质粒稳定性。首先使用Nanopore测序（Plasmidsaurus Inc.）对模板质粒进行测序以确认全序列。随后用HindIII和SapI限制酶消化质粒以切除无意义区域。将线性化质粒连接以消除冗余序列。为生成新质粒骨架，使用引物pSC-BB-F和pSC-BB-R对修饰后的构建体进行PCR扩增。同时，使用引物O1-PgroES-CosE-F和O1-PgroES-CosE-R扩增启动子-操纵子片段，使用引物GFP-F和GFP-R从pBAD-GFP质粒扩增GFP编码序列。这三个片段——骨架、调控元件和GFP插入片段——通过Gibson组装进行拼接。组装后的质粒转化入10-beta感受态大肠杆菌细胞（NEB），筛选正确构建体的菌落。经验证的克隆进行培养并提取质粒用于后续实验。
该质粒随后通过自然感受态方案转化入B. subtilis TH035菌株。简言之，将枯草芽孢杆菌在Lysogeny肉汤（LB）中的过夜培养物以1:10稀释于MNGE培养基中诱导感受态。培养物在37°C下生长至OD600达到0.5–0.7，使用Genesys 10S UV-Vis分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量。取400 μL培养物，加入1–2 μg纯化的pSC01质粒，培养1小时。此时加入100 μL表达混合物，再培养1小时，然后涂布于含5 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上作为选择标记。根据相对于野生型对照的可见GFP表达选择菌落，并使用菌落PCR扩增插入区域进行验证。
【数据】质粒构建：HindIII和SapI限制酶；转化条件：400 μL培养物，1–2 μg质粒，37°C，OD600 0.5–0.7，1小时+1小时培养；选择标记：5 μg/mL氯霉素
4.5 枯草芽孢杆菌孢子纯化
B. subtilis TH035（pSC01-GFP）孢子从Difco产孢培养基（DSM）中培养72小时（37°C）后分离。DSM由Difco营养肉汤（含0.3% w/v牛肉提取物和0.5% w/v蛋白胨）与0.1% w/v KCl和0.012% w/v MgSO4⋅7H2O组合配制；高压灭菌前将整个混合物调节至pH 7.6。高压灭菌后，加入Ca(NO3)2、MnCl2和FeSO4，终浓度分别为1 mM、0.01 mM和1 μM。在此培养基中生长72小时后，通过离心收集菌体，并在无菌水中洗涤两天。随后进行Renografin纯化以将孢子与营养细胞分离。简言之，将枯草芽孢杆菌悬浮液加入由34% v/v 3M磷酸钾缓冲液和11.18% v/v 50%聚乙二醇（PEG）4000组成的两相提取系统中。剧烈混合15分钟并离心后，收集上层相。将提取的上层相用无菌水稀释并沉淀；此过程重复五次以去除残留的PEG 4000。分离的孢子进一步通过20%至50% HistoDenz梯度离心纯化，仅选择休眠的、相位明亮的孢子。最终孢子浓度通过TSA上稀释涂布确定。
【数据】DSM成分：0.3% w/v牛肉提取物、0.5% w/v蛋白胨、0.1% w/v KCl、0.012% w/v MgSO4⋅7H2O，pH 7.6；添加盐终浓度：Ca(NO3)2 1 mM、MnCl2 0.01 mM、FeSO4 1 μM；培养条件：37°C，72小时；Renografin两相系统：34% v/v 3M磷酸钾缓冲液+11.18% v/v 50% PEG 4000；混合时间：15分钟；HistoDenz梯度：20%至50%
4.6 孢子封装核壳结构的3D打印
本研究全程使用由2%（w/v）AlgMA、0.25%（w/v）LAP和悬浮于DPBS中的指定浓度枯草芽孢杆菌孢子组成的生物墨水。除非另有说明，生物墨水中的孢子浓度维持在10⁷孢子/mL。生物打印使用配备385 nm光源的定制DLP生物打印机进行。生物墨水储液池使用玻璃载玻片和聚二甲基硅氧烷（PDMS）片组装，甲基丙烯酸酯包被的盖玻片作为打印基底。核心结构使用5.57 mW/cm²的光强度、10秒曝光打印，形成125 μm厚的构建体。壳结构在以下光照条件下打印……
【数据】生物墨水成分：2%（w/v）AlgMA、0.25%（w/v）LAP、10⁷孢子/mL（默认）；打印参数：385 nm光源，5.57 mW/cm²，10秒曝光，核心厚度125 μm
研究结果
2.1 封装孢子的水凝胶核心优化
本研究选择的孢子封装材料基于其生物相容性和可打印性，旨在确保萌发后细菌的高存活率和足够的打印分辨率。我们初步评估了三种常用的DLP生物打印材料支持孢子萌发和维持细菌活力的能力：合成聚合物PEGDA和两种化学修饰的天然聚合物AlgMA和HAGM。每种材料均嵌入了来自土壤分离株B. subtilis TH035的孢子，该菌株具有IPTG诱导型GFP表达（B. subtilis TH035（pSC01-GFP））。HAGM和AlgMA均支持显著更高的细菌从材料中萌发和向外生长，表现为更高的GFP荧光强度，而PEGDA则较低（图2A–D）。虽然HAGM和AlgMA在促进细菌活力方面表现出相似能力，但AlgMA提供了更好的打印质量，边缘更清晰。基于这种生物性能和制造性能的组合，选择AlgMA作为后续实验的封装材料。
我们进一步优化了核心制造的光曝光参数，以最大化萌发后的细菌活力。结果表明，从最小可打印阈值增加光强度并不会导致打印构建体的力学性能（图S1A）或封装细菌活力（图S1B）出现显著差异。为评估AlgMA基质内萌发细菌的长期活力，在萌发后24、48、72和96小时监测细菌生长（图2E–H）。鉴于枯草芽孢杆菌在细菌生长过程中聚集体或微菌落尺寸存在天然异质性，我们根据尺寸分布将聚集体细分为四分位数。计算每个时间点各四分位数的相对频率，以提供群体动态的更细致视图（图2E–I-J）。结果表明AlgMA能够支持细菌活力和生长至少96小时（图2K）。值得注意的是，菌落尺寸分布在24小时呈双峰分布，最高相对频率对应最小和最大聚集体尺寸。随时间推移，该分布变得更加均匀（图2K）。这一行为与以下观察一致：水凝胶基质特性直接影响受限系统中封装微生物菌落尺寸和生长动态。24小时的双峰分布（最高频率出现在最小和最大聚集体尺寸）可能反映了AlgMA核心内孢子萌发的异步性——部分孢子较早萌发并快速扩张，而其他孢子仍处于向外生长的早期阶段。随时间推移，该分布变得更加均匀，因为较小的菌落继续生长，而较大的菌落则遇到来自周围基质日益增加的机械限制，这可能限制其进一步扩张和营养扩散。
【数据】材料比较：HAGM和AlgMA支持显著更高细菌萌发（GFP荧光强度高于PEGDA）；AlgMA打印边缘更清晰；细菌活力维持：至少96小时；菌落尺寸分布：24小时双峰分布，随时间趋于均匀
2.2 核壳结构的构建：代谢物交换与细菌截留
为构建能够物理截留细菌同时允许营养物质和生物活性化合物或代谢物扩散的核壳结构，我们采用PEGDA（Mn = 250 Da）作为壳层的主要结构组分。PEGDA 250是3D生物打印中广泛使用的材料，单独光交联时可形成致密、无孔的表面（图S2A）。受先前使用致孔剂在可光交联生物墨水中创建可调孔隙率的工作启发，将甲醇作为致孔剂引入光交联PEGDA基质中，以在纳米尺度引入孔隙。我们发现，将甲醇浓度从0%增加至70%（v/v）导致PEGDA壳层内孔径逐渐增大（图S2）。SEM成像表明，当使用70%甲醇作为致孔剂时，封装在AlgMA核心内的孢子在核壳结构内培养后成功萌发为营养细胞并形成聚集体（图3A–C）。PEGDA基壳层表现出所需的纳米级孔隙，可截留细菌同时允许分子扩散（图3C）。
为进一步评估细胞活力和空间分布，我们测量了活细菌的GFP荧光，以及固定后非活力细胞的SYTOX™ Orange荧光。核心内的大多数细菌保持活力（图3D–F）。重要的是，这些聚集体被空间限制在直径1 mm的核心区域内，与打印期间预定义的掩模设计一致。此外，在致孔剂浓度系列（0%至70%）中GFP和SYTOX™ Orange信号的共定位显示，营养细胞仅存在于70%甲醇条件下，且被成功截留（图S3）。活力细胞计数的定量分析证实结构内萌发效率高（>99.9%），8小时后细菌生长达到10⁶–10⁷ CFU/mL（图S4）。这些结果证实，只有当PEGDA壳层中引入足够孔隙率时，才能实现有效的细菌萌发和截留。我们的结果表明，70%甲醇是控制渗透性同时维持细菌截留的最佳致孔剂浓度。
为进一步验证壳层的细菌截留和营养流动能力，进行了对照实验：将孢子以与核壳构建体相同的浓度直接混入PEGDA壳层材料中，按前述方法培养。只有位于材料表面且直接接触培养基的孢子成功萌发（图3G）。PEGDA基质内部未观察到细菌菌落，与AlgMA核心内观察到的封装生长形成鲜明对比。
为确认PEGDA壳层对细菌截留的必要性，我们比较了核壳构建体和无壳层仅含AlgMA核心的构建体在萌发后上清液的OD600。无壳层构建体表现出显著升高的上清液OD600，表明细菌逃逸至周围培养基中，而核壳构建体保持接近基线的OD600（图S5），证明截留功能具体由PEGDA壳层提供，单独AlgMA核心无法实现。此外，核壳构建体培养8天以评估长期细菌截留。在第0天和第8天收集上清液进行600 nm光密度（OD600）测量。OD600值在整个实验期间保持为零或接近零，实验开始和结束时的OD600无显著差异（图3H），表明枯草芽孢杆菌无法在结构外部生长，因此被有效截留。鉴于枯草芽孢杆菌若逃逸可在所用培养基中快速增殖并形成生物膜，我们的发现证实核壳结构在8天期间有效将活细菌截留在构建体内。
为直接定量通过壳层的分子传输，我们测量了酒石黄（一种小分子阴离子染料）从核壳构建体的释放。酒石黄释放随致孔剂浓度增加而显著增加，在无壳层时最高（图S6），证实纳米多孔PEGDA壳层允许尺寸类似代谢物的小分子进行孔隙率依赖性扩散，同时如图3G和H所示截留营养细胞。
【数据】壳层材料：PEGDA 250；致孔剂：甲醇，浓度0%至70%（v/v）；最佳浓度：70%；核心直径：1 mm；萌发效率：>99.9%；8小时细菌生长：10⁶–10⁷ CFU/mL；长期截留：8天，OD600保持零或接近零
2.3 结构参数对细菌聚集体形成的影响
利用DLP生物打印技术，我们制造了高分辨率、图案化的活性材料，能够在数分钟内支持大面积均匀细菌聚集……
【数据】打印分辨率：微米级；聚集均匀性：大面积一致（原文未详述具体数值）
2.4 环境胁迫下孢子活力的维持
为评估核壳结构对封装孢子的保护功能，我们设计了实验比较萌发前（孢子状态）和萌发后（营养细胞状态）暴露于外部胁迫因子的核壳结构。胁迫条件包括脱水、乙醇和UV-C照射。
结果显示，以孢子形式暴露于脱水、乙醇或UV-C照射的样品，其后续萌发产生的菌落尺寸分布与未受胁迫的对照组相当。相反，以萌发后营养细胞形式暴露于相同胁迫条件的样品，细菌存活率显著降低。这些结果表明，核壳结构中的孢子状态对常见环境胁迫具有显著抗性，而营养细胞状态则相对脆弱。
在重复、长期暴露实验中，我们进一步评估了常见环境胁迫因子对枯草芽孢杆菌孢子活力和萌发的影响。每种结构中可检测到的孢子总数在置于有利于萌发的条件之前进行计数。结果显示，即使在重复暴露于脱水、乙醇和UV-C的条件下，封装孢子仍能维持其萌发能力达4周以上。
【数据】胁迫条件：脱水、乙醇、UV-C照射；保护时间：4周；孢子状态抗性：显著高于营养细胞状态
2.5 封装枯草芽孢杆菌对MRSA的抑制
为验证该活性材料平台的生物防治功能，我们测试了封装枯草芽孢杆菌抑制MRSA生长的能力。实验设计为：将MRSA添加到围绕结构的培养基中，或添加到含有来自等体积生物墨水的游离孢子的培养基中。仅含核壳材料（无孢子）的对照组用于测量未受抑制的MRSA生长。
结果表明，含有封装枯草芽孢杆菌孢子的核壳结构能够将MRSA的生长抑制约一个数量级。相比之下，含有游离孢子的条件也表现出一定的抑制效果，但核壳结构提供了持续、稳定的抑制功能，无需重复添加。
【数据】MRSA抑制效果：约一个数量级（约10倍）；培养条件：室温
讨论与解读
抗菌素耐药性仍是全球健康挑战，微生物生物防治剂在公共基础设施中用于病原体控制的整合尚未完全实现。本研究开发了一种3D打印核壳结构，将枯草芽孢杆菌孢子封装在生物相容性工程材料中，展示了长期、被动控制耐药病原体的概念验证方法。通过利用DLP生物打印，我们实现了微米级分辨率的精确空间控制和可扩展的活性结构制造。
材料评估证明了水凝胶选择对细菌封装系统的关键重要性。天然聚合物基水凝胶优于合成PEGDA的性能与工程活性材料中生物相容性的既定原则一致。PEGDA中观察到的细菌活力降低可能归因于其致密、高度交联的网络限制了营养和氧气向封装细胞的扩散。此外，PEG基水凝胶具有生物惰性，缺乏天然聚合物（如海藻酸盐和透明质酸）固有的细胞交互线索，后者为微生物存活和生长提供了更宽松的微环境。
编译者解读：该研究的核心价值在于将"孢子休眠—条件触发萌发"的生物学策略与DLP打印的几何精度巧妙结合——壳层既充当物理屏障防止细菌逃逸，又通过致孔剂调控实现营养与代谢物的选择性交换。这种"先封装后激活"的设计巧妙规避了打印过程中对活细胞的损伤，同时赋予材料长达4周的干燥存储稳定性。从应用角度看，该平台在表面消毒、生物医学包装等领域具有明确转化潜力。然而，当前MRSA抑制实验仅验证了约一个数量级的抑制效果，在实际复杂环境中能否维持同等效力，以及壳层长期使用中的机械稳定性，仍需进一步考察。
参考来源
期刊：Bioactive Materials, 2027
DOI: 10.1016/j.bioactmat.2026.08.025
DOI: 10.1016/j.bioactmat.2026.08.025