来源：One-step polyhydroxybutyrate production from potato starch by engineered Bacillus subtilis（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚羟基丁酸酯（PHB）是备受关注的生物可降解塑料，但其工业化生产长期被革兰氏阴性菌主导，内毒素污染与下游处理复杂等问题制约了医用级应用。本研究将来自巨大芽孢杆菌的PHB合成操纵子与真养产碱杆菌的β-酮硫解酶基因整合进枯草芽孢杆菌染色体，结合α-淀粉酶分泌表达，实现了以粗制马铃薯淀粉为唯一碳源的一步法PHB生产——聚合物含量达细胞干重的51.8%，效价5.8 g/L。该工作将枯草芽孢杆菌推入高效PHB生产平台之列。
研究背景
聚羟基脂肪酸酯（PHA）是微生物在细胞内积累的碳源与能量储存颗粒，其中PHB研究最为深入。其可生物降解性与生物相容性使其成为石油基塑料的可持续替代品。商业化PHB生产要求宿主菌株非致病、遗传可操作、生长快速且能利用多样化碳源。然而，当前工业PHB生产仍集中于Cupriavidus necator、Escherichia coli与Halomonas bluephagenesis等少数革兰氏阴性菌。这些菌株虽产PHB高效，但内毒素污染、下游加工复杂及监管障碍限制了其在医用级领域的应用。革兰氏阳性菌因此受到关注——蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等虽被研究，但均未实现商业应用。枯草芽孢杆菌是公认安全的工业底盘菌，此前的PHB产量却始终低于细胞干重的13%。本研究旨在通过途径优化与phasin表达，充分释放枯草芽孢杆菌的PHB合成潜力。
研究方法
2.1 菌株与底物
本研究所用菌株与质粒列于原文表1。E. coli DH5α作为常规克隆与质粒扩增的宿主菌。化学感受态E. coli细胞制备与转化按Chang等方法进行。PHB生产宿主为B. subtilis BS0——该工程菌株为产孢缺陷（ΔsigF）、非淀粉水解（ΔamyE）且缺失七种胞外蛋白酶（ΔnprE、ΔaprE、Δepr、Δmpr、ΔnprB、Δvpr、Δbpr）。B. subtilis转化按Yasbin等建立的方案执行，质粒DNA分离自E. coli Turbo（New England Biolabs），该rec+菌株经优化可实现高产量质粒提取。转化子在添加相应抗生素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上、37°C条件下筛选。E. coli质粒筛选使用卡那霉素30 µg/mL；B. subtilis培养则补充卡那霉素（7.5 µg/mL）、红霉素（2 µg/mL）与林可霉素（25 µg/mL）。纯糖与PHB标准品购自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）。马铃薯淀粉购自Roquette（Lestrem, France）。根据制造商规格，该原料干物质含量为85%，淀粉含量以干重计超过95%，直链淀粉含量约20–22%，颗粒较大，平均中位粒径约50 μm。粗甘油来自Greenfuel（Extremadura, Spain）。
【数据】卡那霉素：30 µg/mL（E. coli）/7.5 µg/mL（B. subtilis）；红霉素：2 µg/mL；林可霉素：25 µg/mL；培养温度：37°C；淀粉干物质：85%；淀粉含量：>95%干重；直链淀粉：20–22%；平均粒径：~50 μm
2.2 DNA操作
编码C. necator β-酮硫解酶（phaA）的合成基因已针对B. subtilis进行密码子优化（见补充材料），由NZYtech（Lisboa, Portugal）商业合成。P. megaterium QM B1551与B. subtilis的染色体DNA使用NZY Tissue gDNA Isolation Kit（NZYtech, Portugal）提取；E. coli质粒DNA使用NZYSpeedy Miniprep Kit（NZYtech, Portugal）分离。PCR产物与限制性酶切DNA片段使用NZYGelpure Kit（NZYtech, Portugal）从琼脂糖凝胶或扩增反应液中纯化。所有最终DNA构建体经Macrogen（Seoul, Korea）Sanger测序确认。
【数据】DNA提取试剂盒：NZY Tissue gDNA Isolation Kit；质粒提取试剂盒：NZYSpeedy Miniprep Kit；PCR纯化试剂盒：NZYGelpure Kit；测序：Sanger法（Macrogen）
2.3 质粒构建
本研究所用质粒列于原文表2，引物见补充材料。来自P. megaterium QM B1551的phaRBC操纵子以引物PxylF/PxylR扩增，通过EcoRI和SpeI限制性位点克隆至木糖诱导型穿梭载体pBS2EXylRP xylA（Popp等，2017）。所得表达构建体命名为pBS2EXylRPxylA_RBC，可将phaRBC操纵子整合至lacA位点，受木糖诱导型启动子控制。基因组编辑使用穿梭载体pJOE8999.1（Altenbuchner, 2016），该载体可实现B. subtilis中CRISPR/Cas9介导的基因修饰。整合载体经两步组装：（i）插入靶向目的基因组位点的基因特异性单链引导RNA（sgRNA）盒；（ii）插入相应的同源重组编辑模板。所有克隆步骤经限制性分析与Sanger测序验证。
【数据】限制性酶：EcoRI/SpeI（phaRBC克隆）；SfiI（编辑模板连接）；sgRNA克隆：BsaI酶切
#### 2.3.1 单链引导RNA克隆
靶向B. subtilis特定基因的sgRNA使用Broad Institute的CRISPR sgRNA Designer工具（Doench等，2016）设计。针对每个靶标，合成一对含适当粘性末端互补寡核苷酸（Macrogen, Korea），退火后连接至pJOE8999.1载体。寡核苷酸以10 μM终浓度混合于退火缓冲液（10×储备液：100 mM Tris-HCl pH 7.5、1 M NaCl、1 mM EDTA pH 8.0），98°C孵育5 min，逐渐冷却至室温以形成双链。退火寡核苷酸使用T4多核苷酸激酶（Thermo Fisher Scientific, USA）按制造商方案进行5′端磷酸化，随后连接至BsaI消化的pJOE8999.1载体，生成sgRNA表达构建体。
【数据】寡核苷酸退火浓度：10 μM；退火缓冲液：100 mM Tris-HCl pH 7.5、1 M NaCl、1 mM EDTA pH 8.0；退火温度/时间：98°C、5 min；磷酸化酶：T4 PNK；限制酶：BsaI
#### 2.3.2 编辑模板克隆
基因组编辑质粒构建的第二步中，生成编辑修复模板以实现位点特异性同源重组整合。每个编辑模板由两个长度大致相等的同源臂组成，侧翼连接所需DNA插入片段。三个片段（5′臂、插入片段和3′臂）分别扩增，通过重叠延伸PCR（SOEing-PCR）融合，详见补充材料。融合产物经SfiI消化，连接至含相应sgRNA的SfiI线性化pJOE8999.1载体，生成完整编辑质粒。敲入质粒构建使用以下sgRNA与修复模板引物组合：（i）pJOE1_phaA_spoVG：sgRNA靶向spoVG（引物TS1F/TS1R）；修复模板引物P1F/P1R、P2F/P2R与P3F/P3R（phaA整合至spoVG）；（ii）pJOE2_phaA_sigX：sgRNA靶向sigX（TS2F/TS2R）；修复模板引物P4F/P4R、P5F/P5R与P6F/P6R（phaA第二次整合至sigX）；（iii）pJOE3_phaP_sigX：sgRNA靶向sigX（TS2F/TS2R）；修复模板引物P4F/P4R、P7F/P7R与P6F/P6R（phaP整合至sigX位点）；（iv）pJOE4_amyQ_cotB：sgRNA靶向cotB（TS3F/TS3R）；修复模板引物P8F/P8R、P9F/P9R与P10F/P10R（amyQ整合至cotB位点）。所有构建体经Sanger测序验证。
【数据】同源臂：两个约等长片段；融合方法：SOEing-PCR；限制酶：SfiI；编辑位点：spoVG、sigX、cotB
2.4 质粒消除与基因组修饰验证
为从重组菌株中消除编辑质粒，编辑后的菌落于无抗生素LB琼脂平板上、50°C条件下连续传代三次，每次24 h。每次传代均划线分离单菌落以促进质粒丢失。质粒消除通过有无卡那霉素的LB琼脂平板复制接种评估。不含质粒的菌落在37°C含卡那霉素条件下无法生长，确认质粒丢失。基因组修饰进一步通过特异性引物对菌落PCR验证（见补充材料），并经Sanger测序确认。
【数据】质粒消除温度：50°C；时间：24 h × 3次传代；验证方法：卡那霉素抗性复制接种 + 菌落PCR + Sanger测序
2.5 摇瓶培养
工程化B. subtilis菌株的PHB生产在200 mL锥形瓶中进行，含15 mL PHB生产培养基，组成（每升）：2 g (NH4)2SO4、10 g大豆蛋白胨、18.3 g K2HPO4·3H2O、6 g KH2PO4、1 g柠檬酸钠、0.2 g MgSO4·7H2O、0.1 g CaCl2、12 mg FeSO4·7H2O、3 mg MnSO4·H2O、1.2 mg CuSO4·H2O与1.2 mg ZnCl2，根据实验条件补充1–5%（w/v）的相应碳源。诱导实验中，预培养在PHB生产培养基中、34°C、250 rpm振荡条件下过夜培养。预培养物用于接种新鲜培养物，接种时OD600调至0.05。孵育后，培养物在不同时间点以0–20 g/L木糖诱导，诱导后继续培养至24 h。细胞生物量通过5 mL培养物离心（15,000 rpm、15 min、4°C）定量。所得沉淀以Milli-Q水洗涤两次，冻干后测定DCW与PHB含量（% w/w）。
【数据】培养基体积：15 mL/200 mL瓶；(NH4)2SO4：2 g/L；大豆蛋白胨：10 g/L；K2HPO4·3H2O：18.3 g/L；KH2PO4：6 g/L；柠檬酸钠：1 g/L；MgSO4·7H2O：0.2 g/L；CaCl2：0.1 g/L；FeSO4·7H2O：12 mg/L；MnSO4·H2O：3 mg/L；CuSO4·H2O：1.2 mg/L；ZnCl2：1.2 mg/L；碳源：1–5%（w/v）；木糖：0–20 g/L；温度：34°C；转速：250 rpm；接种OD600：0.05；离心：15,000 rpm、15 min、4°C
2.6 聚羟基丁酸酯测定分析方法
胞内PHB按Lin与Chen（2017）所述方案分析。发酵后，菌体经8,000 rpm离心10 min收集，以Milli-Q水洗涤两次。收集的细胞冻干后进行酸催化丙醇解，将胞内PHB转化为3-羟基丁酸丙酯。具体地，10 mg冻干细胞材料转移至10 mL密封管中……
【数据】离心：8,000 rpm、10 min；样品量：10 mg冻干细胞；衍生化方法：酸催化丙醇解
研究结果
3.1 枯草芽孢杆菌中可调控聚羟基丁酸酯生物合成途径的工程化
利用重组微生物底盘的合成生物学方法在提升PHA生产方面潜力巨大，然而PHA生物合成基因功能表征的不足仍制约着途径工程与PHB产量优化。由phaRBC操纵子编码、广泛分布于芽孢杆菌属的IV类PHA合酶（PhaRCs）非常适合在革兰氏阳性宿主中表达，是B. subtilis中PHB生物合成的理想候选。本研究从P. megaterium QM B1551（一种特征明确的天然PHB生产者）的phaRBC操纵子中获取了NADPH依赖性乙酰乙酰辅酶A还原酶（phaB）与phaRC合酶基因。为实现可调控表达与高途径通量，phaRBC操纵子被克隆至木糖诱导型启动子控制下，并整合至B. subtilis BS0的lacA位点，生成菌株BS1。为补全PHB生物合成途径，选择来自C. necator的phaA基因（编码β-酮硫解酶），基于其此前在B. subtilis中已验证的功能。为实现高水平组成型表达，phaA在P spoVG与P sigX两个强启动子控制下通过CRISPR-Cas9基因组编辑系统整合至染色体。构建了携带spoVG（BS2a）或sigX（BS2b）位点单拷贝phaA插入的菌株，以及同时含有两个整合位点的双拷贝菌株（BS2c），从而在B. subtilis中建立模块化、可调控的PHB生物合成平台，用于评估phaA基因剂量与木糖浓度依赖性诱导对PHB生产的影响。正确的基因组整合经菌落PCR与Sanger测序确认。
【数据】phaB/phaRC来源：P. megaterium QM B1551；phaA来源：C. necator；整合位点：lacA、spoVG、sigX；启动子：PxylA（诱导型）、P spoVG、P sigX（组成型）；菌株：BS1（仅phaRBC）、BS2a（phaA@spoVG）、BS2b（phaA@sigX）、BS2c（双拷贝）
3.2 诱导剂浓度与细胞密度对聚羟基丁酸酯生产的影响
PHB生物合成途径置于木糖诱导型启动子控制下，可通过诱导剂浓度与诱导时机调节途径活性。首先使用BS2a菌株在含3%葡萄糖的PHB生产培养基中评估木糖浓度对PHB合成的影响（图1A）。接种后约2 h（对应OD600约0.5）进行phaRC操纵子诱导，木糖浓度梯度设定，培养至24 h。无诱导剂时PHB积累可忽略不计，而PHB含量与生物量均随木糖浓度升高而增加（图1B）。最大值出现在0.5%木糖处：PHB含量42.9 ± 2.5 %wt，DCW为9.5 ± 0.4 g/L，PHB效价4.1 ± 0.2 g/L，更高诱导剂水平无进一步提升。为评估诱导时机对PHB积累的影响，新鲜培养物以OD600 0.05起始接种，培养至目标细胞密度后，在OD600 0.05至1.5范围内以0.5%木糖精确诱导，确保各重复间目标诱导点对应相同生理阶段。如图1C所示，诱导发生在OD600 0.05至1之间时PHB含量基本恒定，但延迟至OD600 1.5时PHB含量下降，表明早期诱导可最大化PHB积累。在优化的木糖诱导条件下，比较了工程菌株BS2a、BS2b与BS2c的合成PHB途径性能。如表3所示，三株菌的DCW与PHB产量谱相似，表明无论phaA由P spoVG还是P sigX启动子表达，PHB积累与生物量形成均得到相当水平的增强。此外，与双拷贝菌株BS2c的比较揭示，增加phaA染色体拷贝数并未进一步提升PHB积累，提示在测试条件下单拷贝phaA即可提供足够的β-酮硫解酶活性以支持最大PHB合成。不出所料，缺乏phaA基因的对照菌株BS1仅积累痕量PHB（0.1 ± 0.01 g/L），24 h时DCW为3.8 ± 0.2 g/L（表3），与先前报道一致——B. subtilis不编码功能性的内源phaA基因。
【数据】葡萄糖：3%；诱导时间：接种后~2 h（OD600 ~0.5）；最佳木糖浓度：0.5%；PHB含量：42.9 ± 2.5 %wt；DCW：9.5 ± 0.4 g/L；效价：4.1 ± 0.2 g/L；最佳诱导OD600：0.05–1；BS1对照：PHB 0.1 ± 0.01 g/L，DCW 3.8 ± 0.2 g/L
3.3 碳源类型与浓度对聚羟基丁酸酯积累的影响
碳源浓度强烈影响生物量形成与PHB合成。为优化碳源供给，BS2a菌株在葡萄糖浓度递增（1–5% w/v）的培养基中、34°C振荡条件下培养。如图1D所示，细胞生物量与PHB产量均随葡萄糖浓度升高而增加，在3%葡萄糖处达到最大值。该浓度下，24 h内超过95%的葡萄糖被消耗，而初始浓度设为4%和5%时，残余葡萄糖水平分别超过20%和40%。这一平台期表明菌株在约30 g/L葡萄糖处达到代谢或生理饱和点，碳源供给的进一步增加并未促进生长或PHB合成。通常，微生物在指数期与稳定期均可积累PHA。为评估PHB积累的时间动态，BS2a菌株培养物每8 h取样，测定生物量（DCW）与PHB效价（图1E）。PHB合成主要发生在营养平衡条件下的指数生长期，24 h达到最大含量，并稳定维持至48 h，表明聚合物可持续积累而无需营养胁迫。24 h后PHB水平与DCW均保持恒定，可能反映维持代谢。这种生长偶联的PHB生产与依赖营养限制诱导聚合物合成的经典两阶段策略形成对比，可同时实现生物量形成与聚合物积累，提高体积产率并简化生物过程控制。值得注意的是，工程菌株在葡萄糖上实现的PHB效价比此前报道的重组B. subtilis高出约四到十倍，证明合成PHB途径的有效性，并凸显工程化B. subtilis作为PHB生产稳健细胞工厂的潜力。碳源类型对PHB生物合成的影响通过BS2a菌株在七种单一碳源（葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、半乳糖与粗甘油，各30 g/L）的摇瓶培养进行评估。如图1F所示，甘露糖支撑了最高的生物量与PHB积累：DCW为10.1 ± 0.4 g/L，PHB含量50.2 ± 2.5 wt%，对应效价5.1 g/L。葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖与粗甘油均促进大量PHB积累（42.8–50.2 wt%），而乳糖与半乳糖的聚合物形成极少，乳糖表现最差（1.2 wt% PHB；DCW 2.8 g/L）。乳糖与半乳糖的低产量与B. subtilis中底物运输和/或分解代谢能力受限的既往报道一致，包括β-半乳糖苷酶活性、lac操纵子功能与半乳糖摄取途径相关的限制。总体而言，这种广泛的底物……
【数据】最佳葡萄糖浓度：3%（30 g/L）；葡萄糖消耗：>95%（3%，24 h）；4%残留：>20%；5%残留：>40%；甘露糖：DCW 10.1 ± 0.4 g/L，PHB 50.2 ± 2.5 wt%，效价5.1 g/L；葡萄糖-粗甘油范围：42.8–50.2 wt% PHB；乳糖：1.2 wt% PHB，DCW 2.8 g/L
3.4 马铃薯淀粉一步法生产聚羟基丁酸酯
（此节原文节选未完整提供，根据摘要及图表信息编译）为实现从粗制淀粉直接生产PHB，工程菌株进一步整合了来自Bacillus amyloliquefaciens的α-淀粉酶基因amyQ，构建菌株BS4。该菌株可分泌α-淀粉酶将淀粉水解为可代谢糖，同时表达phasin（PhaP）与PHB合成途径，实现淀粉水解、生物量形成与聚合物积累的协同。
【数据】菌株BS4：amyQ + phaP + phaA + phaRBC；淀粉浓度：3%；PHB含量：51.8% DCW；效价：5.8 g/L；生物量：11.3 g/L
讨论与解读
原文结论指出，工程化B. subtilis实现了生长偶联的PHB积累，同时保留了进一步代谢优化与拓展至多样化PHA共聚物的遗传灵活性。在摇瓶规模下，工程菌株以一步法工艺实现了与最佳淀粉基系统相当的生产水平，展示了低成本底物淀粉的高效转化。理化表征确认聚合物性能与商业标准品相当，支持其工业与生物医学应用前景。未来工作将聚焦于受控生物反应器验证、额外低成本原料的碳利用优化、代谢通量分析以解析碳分配并识别竞争途径，同时以组成型表达系统替代诱导型系统，实现无诱导剂的工业化生产。
编译者解读
该研究的技术路线清晰体现了"底盘-途径-底物"三位一体的设计逻辑：以蛋白酶缺陷、非产孢的B. subtilis BS0为底盘消除产物降解隐患，以CRISPR-Cas9精确整合途径基因规避质粒不稳定性，再以α-淀粉酶分泌实现"一步法"淀粉转化。选择P. megaterium的IV类PhaRC合酶与C. necator的PhaA进行跨物种组装，巧妙规避了B. subtilis内源途径缺失的瓶颈。值得关注的是"生长偶联型"生产模式——不依赖营养限制即可持续积累PHB至48 h，这为连续发酵工艺开发提供了便利。然而，摇瓶数据距工业放大尚有距离，且粗甘油等废弃碳源的利用效率仍逊于纯糖。从合成生物学视角看，该工作为革兰氏阳性菌作为"低内毒素"PHB生产平台提供了有力证据，但代谢通量向PHB的分配效率及phaP（phasin）的具体贡献机制仍有待深入解析。
参考来源
Shahayeva M. One-step polyhydroxybutyrate production from potato starch by engineered Bacillus subtilis. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134933
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134933