来源：Efficient high-temperature simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulosic substrates enabled by engineering thermotolerance in an enzyme-secreting industrial Saccharomyces cerevisiae strain（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素生物乙醇生产中，商业酶制剂成本可占总生产成本的20-40%。本研究通过全基因组转化技术，将耐热性导入一株兼具抑制物耐受、木糖利用和纤维素酶分泌能力的工业酿酒酵母菌株，获得高性能衍生菌株Cellusec®4.0。该菌株在41°C混合糖发酵中乙醇产量较亲本提高86%，并在多种木质纤维素底物的高温同步糖化发酵中表现优异，为降低酶制剂用量、推进二代生物乙醇工业化提供了可行路径。
研究背景
二代生物乙醇以农业废弃物、林业残渣等非粮生物质为原料，是极具潜力的低碳燃料。然而，木质纤维素的顽固结构使其糖化过程依赖商业酶制剂，酶成本占总生产成本的20-40%，成为规模化应用的主要经济瓶颈。为解决这一问题，研究者开发了能够分泌纤维素酶的酿酒酵母菌株，在同步糖化发酵（SSF）工艺中原位生产纤维素酶，可将商业酶制剂用量降低最多50%。SSF在同一反应器中完成糖化与发酵，不仅简化了工艺流程，还通过即时发酵维持低糖浓度，缓解产物抑制并降低污染风险。
SSF的理想运行温度应兼顾纤维素酶最适活性（通常45-50°C）与酵母发酵性能，但工业酿酒酵母的耐热性有限，高温下发酵效率显著下降。如何在保持工业菌株已有优良性状（抑制物耐受、木糖利用、酶分泌）的同时引入耐热性，是该领域的关键技术挑战。
研究方法
2.1 培养基与培养条件
酵母抽提物蛋白胨（YP）培养基由10g L⁻¹酵母提取物和20g L⁻¹蛋白胨组成，添加20g L⁻¹葡萄糖即得YPD培养基。YPD琼脂平板通过在培养基中添加15g L⁻¹琼脂制备。用于转化、发酵和SSF的预培养物在50mL YPD培养基中（300mL锥形瓶，金属盖，DWK品牌），于30°C、200rpm条件下过夜培养，除非另有说明，均通过室温下2000×g离心1分钟收集细胞。OD600值与细胞干重浓度的换算通过Cellusec®3.3的校准实验确定：OD600为10相当于1g CDW L⁻¹。OD600值使用NanoPhotometer NP80（Implen）测定。
【数据】培养基：YP/YPD（酵母提取物10g L⁻¹，蛋白胨20g L⁻¹，葡萄糖20g L⁻¹）；温度：30°C；转速：200rpm；离心：2000×g，1min，室温；OD600=10对应1g CDW L⁻¹
2.2 全基因组转化（WGT）
从YPD琼脂平板上用移液枪头收集马克斯克鲁维酵母（K. marxianus）细胞，提取基因组DNA。细胞悬浮于150µL Tris-EDTA（TE）缓冲液（10mM Tris-HCl，pH7.5；1mM EDTA）中，随后加入150µL酚-氯仿-异戊醇（25:24:1，分子生物学级，Thermo Fisher Scientific）和0.5mm玻璃珠（Sigma-Aldrich）。使用FastPrep24™5G仪器（MP Biomedicals™，Thermo Fisher Scientific）以7m s⁻¹速度破碎细胞2分钟。裂解液随后在室温下21,000×g离心10分钟，取100µL水相转移至新管。加入300µL无水乙醇（>99.5%，VWR）沉淀DNA，21,000×g离心5分钟。所得沉淀用300µL 70%（v/v）乙醇洗涤，同样条件下再次离心5分钟。50°C空气干燥10分钟后，DNA重悬于50µL TE缓冲液。加入RNase A（Thermo Fisher Scientific；每50µL DNA加1U）于37°C处理2小时去除RNA。琼脂糖凝胶电泳估计DNA片段大小约6-10kb。
Cellusec®3.3过夜预培养物经室温2000×g离心1分钟收集。所得沉淀轻轻重悬于无菌重悬缓冲液（100mM醋酸锂，10mM二硫苏糖醇，10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA），室温避光孵育55分钟。随后4°C离心1分钟收集细胞，用冰冷无菌Milli-Q水（18.2MΩ·cm，Millipore）洗涤，4°C再次离心1分钟。再用冰冷1M山梨醇洗涤一次。最终沉淀重悬于500µL冰冷1M山梨醇中。
转化时，100µL感受态细胞与3µg K. marxianus基因组供体DNA混合，转移至2mm电转杯（Fisherbrand™）。电穿孔条件为1.5kV、25µF、200Ω，电击后立即加入1mL YPD培养基，在Infors Multitron摇床中35°C、200rpm复苏2小时。全部复苏液用Roll & Grow™铺板珠涂布于十块含100mg L⁻¹氨苄青霉素（防污染）的YPD琼脂平板上。平板在SureTemp®双对流培养箱中于40.5°C培养。4-6天后出现的菌落划线接种至新鲜YPD平板，40.5°C继续培养。共为13个分离株制备YPD预培养物。其中4个生长有限的分离株被排除，剩余9个分离株进入小规模发酵评估。
Cellusec®4.0耐热性的遗传稳定性另作评估：细胞接种于5mL YPD培养基（金属盖试管），30°C、200rpm振荡培养48小时。培养物随后用Roll & Grow™铺板珠涂布YPD琼脂平板分离单菌落，40.5°C培养至单菌落出现，确认耐热性稳定遗传。
【数据】DNA提取：酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，FastPrep破碎7m/s，2min；离心：21,000×g，10min；DNA沉淀：无水乙醇，21,000×g，5min；RNase处理：37°C，2h；DNA片段：约6-10kb；感受态制备：100mM醋酸锂/10mM DTT，RT避光55min；电转：1.5kV，25µF，200Ω；复苏：35°C，200rpm，2h；筛选温度：40.5°C；菌落出现时间：4-6天；稳定性验证：30°C培养48h后40.5°C划线
2.3 通用发酵与SSF操作流程
所有pH调节通过添加4M HCl或4M KOH完成。磁力搅拌使用静态培养箱内的多位搅拌板（Evermed）。所有SSF实验在Infors Multitron摇床中于指定温度、200rpm条件下进行。温度通过含50mL水的对照容器验证。（补料）分批SSF实验容器为250mL Duran瓶（DWK Life Sciences），配溴丁基橡胶塞（DWK Life Sciences），插入23G针头（Terumo™ Agani™）并加棉塞以实现有限气体交换。发酵和（补料）分批SSF实验的细胞密度按容器内最终总体积计算。实验过程中定期取样0.3-1mL（依粘度和固含量而定）。样品经高效液相色谱（HPLC）分析。产率以理论最大乙醇滴度的百分比表示。理论最大乙醇滴度基于结构性碳水化合物含量计算：葡聚糖和木聚糖质量分别乘以1.111和1.136换算为单糖，再以0.51g g⁻¹因子换算为乙醇（Brunecky et al., 2025）。
【数据】pH调节：4M HCl/4M KOH；SSF转速：200rpm；取样量：0.3-1mL；葡聚糖/木聚糖换算因子：1.111/1.136；乙醇换算因子：0.51g/g
2.4 点滴平板分析（Spot assays）
YPD培养基中过夜培养的预培养物稀释至OD600为1.0（NanoPhotometer NP80测定）。随后在无菌Milli-Q水中于96孔微孔板中制备五倍梯度稀释液。使用96针复制器（8×6阵列；Merck）将稀释液转移至YPD琼脂平板，通过直接表面接触沉积小液滴。点样后，平板在无菌条件下干燥约10分钟再进行培养。平板分别在30、39、40和41°C培养最多四天。不同温度的培养在独立的Heratherm静态培养箱（Thermo Scientific）中同时进行。平板不密封、不堆叠，以确保温度暴露均匀。每天使用Fusion Fx6成像系统（Vilber）采集图像。所有点滴实验均设两个独立的生物学重复，结果一致。
【数据】初始OD600：1.0；稀释梯度：五倍系列稀释；培养温度：30/39/40/41°C；培养时间：最多4天；干燥时间：约10min
2.5 HPLC分析
样品离心两次以去除细胞和不溶性颗粒，直接进行HPLC分析。糖和乙醇使用Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad）定量，柱温60°C，流动相为2.5mM硫酸，流速0.5mL min⁻¹。检测使用1260 Infinity II示差折光检测器（Agilent）。
【数据】色谱柱：Aminex HPX-87H；柱温：60°C；流动相：2.5mM硫酸；流速：0.5mL/min
2.6 发酵实验
10mL规模发酵的预培养物在5mL YPD（试管）中培养。小型15mL瓶含9mL YP培养基，添加7%（w/v）葡萄糖、4%（w/v）木糖和1%（w/v）纤维二糖，接种1mL预培养物。
50mL规模发酵中，细胞按上述方法制备，重悬于含8%（w/v）葡萄糖、4%（w/v）木糖和1%（w/v）纤维二糖的YP培养基中，初始OD600为5（0.5g CDW L⁻¹）。将50mL接种培养基分装至无菌200mL发酵管。培养物用橡胶塞密封，橡胶塞装有剪口的移液枪头（50mL规模）或23G针头（Terumo™ Agani™）（10mL规模），内含棉塞以允许有限气体交换。50mL规模于40°C、10mL规模于41°C培养，磁力搅拌200rpm。
SSF实验中，酶用量以每克纤维素滤纸酶活单位（FPU g⁻¹纤维素）表示。SSF和发酵实验均作为单次实验进行，但50mL规模YP发酵和碱预处理甘蔗渣的补料分批SSF除外。
【数据】10mL发酵：7%葡萄糖+4%木糖+1%纤维二ose；培养温度：41°C；50mL发酵：8%葡萄糖+4%木糖+1%纤维二糖；初始OD600：5（0.5g CDW/L）；培养温度：40°C；搅拌：200rpm
2.7 高粱浆分批SSF
高粱浆由TNO（荷兰）提供，经其专有FABIOLA™有机溶剂预处理工艺处理。高粱浆含87%水分和13%固形物，固形物中葡聚糖73.2%、木聚糖5.9%、木质素5.7%、灰分6.6%。浆料补充尿素（2g L⁻¹）、氨苄青霉素（100mg L⁻¹）和氯霉素（100mg L⁻¹），以及CTec3-H…（原文截断）
【数据】高粱浆：87%水分，13%固形物（含73.2%葡聚糖、5.9%木聚糖、5.7%木质素、6.6%灰分）；补充：尿素2g/L、氨苄青霉素100mg/L、氯霉素100mg/L
研究结果
3.1 高温混合糖发酵中WGT分离株的筛选
四个分离株在预培养期间生长不足被排除。其余九个菌落在含葡萄糖、木糖和纤维二糖的混合糖培养基中于41°C进行筛选（图1）。各分离株的高温发酵性能差异显著，相对于亲本菌株Cellusec®3.3，既有性能提升也有性能下降的表型。四个分离株的发酵速率较Cellusec®3.3适度降低，而五个分离株表现出改善的高温发酵性能——41°C下具有更高的发酵速率和乙醇滴度。
其中一个分离株表现出显著更高的发酵速率，20小时内产生3.10%（w/v）乙醇，而Cellusec®3.3仅产生1.44%（w/v）。该Cellusec®3.3的耐热衍生菌株以下称为Cellusec®4.0。Cellusec®4.0的残余糖浓度也大幅降低，葡萄糖和木糖均实现接近完全利用。相比之下，Cellusec®3.3仅分别消耗了可用葡萄糖和木糖的78%和26%。纤维二糖利用也显著增强，Cellusec®4.0消耗了70%的可用纤维二糖，而Cellusec®3.3仅表现出有限的消耗。Cellusec®4.0对纤维二糖的高效利用与其保留了Cellusec®3.3工程化的β-葡萄糖苷酶分泌表型一致。
这些糖利用差异反映在乙醇产量上：Cellusec®3.3和Cellusec®4.0的最终滴度分别为2.28和4.25%（w/v），后者提高了86%。与先前工作中三个选定分离株在发酵测定中仅观察到有限差异不同，本研究更广泛的筛选揭示了WGT及固体培养基筛选后显著的表型多样性（Deparis et al., 2021; Stojiljković et al., 2022; Vanmarcke et al., 2021）。这些结果表明，仅基于固体培养基高温生长筛选获得的分离株可能高温发酵能力下降，凸显了在与工艺相关的发酵条件下进行筛选的重要性。尽管如此，多个分离株特别是Cellusec®4.0表现出的性能提升，证明了WGT在生成具有增强高温混合糖发酵能力的工业菌株方面的潜力。
Cellusec®4.0表型的稳定性通过30°C培养48小时、随后40.5°C平板划线（两天内形成单菌落）得到确认。Cellusec®4.0的性能在50mL发酵、较低温度40°C的重复实验中进一步确认（图2），该温度是后续SSF实验的目标温度。Cellusec®4.0能够消耗几乎所有木糖，而Cellusec®3.3在初始浓度4%的木糖中残留0.98%（w/v）未发酵（图2b）。类似地，Cellusec®4.0的残余纤维二糖浓度低于Cellusec®3.3，分别残留0.32和0.74%（w/v）（图2c）。这使Cellusec®4.0的乙醇滴度达到5.47%（w/v），而Cellusec®3.3为4.82%（w/v）（图2d）。葡萄糖消耗无差异（图2a）。亲本菌株在较低温度下性能改善使得Cellusec®4.0的优势缩小，但仍具实质性提升。然而，在木质纤维素底物的SSF过程中，抑制性化合物可能加剧热胁迫，有潜力放大发酵性能差异（Wallace-Salinas and Gorwa-Grauslund, 2013）。
图2e展示了Cellusec®3.3和Cellusec®4.0在不同温度下的五倍系列稀释点滴平板结果。在40和41°C下，Cellusec®3.3无生长，而Cellusec®4.0仍表现出强劲生长，进一步确认了其改善的耐热性。Cellusec®3.3生长的上限温度约为39°C，在该温度下观察到有限生长和偶发小菌落。
【数据】41°C筛选：Cellusec®4.0产乙醇3.10%(w/v)/20h vs Cellusec®3.3为1.44%(w/v)；最终滴度：4.25%(w/v) vs 2.28%(w/v)，提高86%；糖消耗：Cellusec®4.0近完全利用葡萄糖/木糖，消耗70%纤维二糖；Cellusec®3.3仅消耗78%葡萄糖、26%木糖；50mL/40°C验证：乙醇5.47%(w/v) vs 4.82%(w/v)；残留木糖：0.98%(w/v) vs 0.32%(w/v)残留纤维二糖；Cellusec®3.3生长上限：约39°C
3.2 Cellusec®4.0对高粱浆的高温SSF
为评估Cellusec®4.0改善的高温发酵表型能否转化到工业相关条件，在高粱浆上于40°C进行SSF（图3）。该底物采用分批SSF，因高粱浆含水量高达87%。Cellusec®4.0最终乙醇滴度达到4.64%（w/v），Cellusec®3.3为3.75%（w/v），乙醇产量提高24%。乙醇产量的提升伴随糖消耗动态的明显差异。预糖化期间释放的葡萄糖和木糖被Cellusec®4.0快速且几乎完全消耗，而Cellusec®3.3的糖消耗则缓慢且不完全。值得注意的是，Cellusec®3.3在后期时间点葡萄糖浓度再次升高，表明在酵母发酵能力不足的情况下酶制剂持续水解。这一现象在Cellusec®4.0中明显减弱，其在糖化过程中葡萄糖释放与发酵过程中葡萄糖消耗之间维持了更有效的平衡。最终残余葡萄糖和木糖浓度：Cellusec®3.3分别为2.67和0.34%（w/v），而Cellusec®4.0仅为0.40和0.10%（w/v）。
这些结果表明，先前在确定培养基中观察到的高温发酵表型在更复杂的工业相关SSF条件下得以保留。
【数据】高粱浆SSF/40°C：乙醇4.64%(w/v) vs 3.75%(w/v)，提高24%；残余葡萄糖：0.40%(w/v) vs 2.67%(w/v)；残余木糖：0.10%(w/v) vs 0.34%(w/v)
3.3 预处理软木纤维素浆的补料分批SSF：更高温度带来更高乙醇滴度
为展示高温运行的优势，使用Cellusec®4.0在35和40°C下对预处理软木纤维素浆进行补料分批SSF（图4）。由于预处理软木的高固含量和较差的液化特性，采用补料分批SSF配置。40°C下乙醇生产明显更快，最终滴度为3.44%（w/v），35°C下为2.67%（w/v），提高29%。两种温度下均未检测到葡萄糖或木糖积累，表明乙醇浓度的提高源于糖化效率的改善。这些结果与公认的高温下酶水解速率增加的规律一致，支持了使用耐热菌株进行高温SSF的合理性（Choudhary et al., 2016; Mishra et al., 2016b; Rana et al., 2014）。提高酶用量可能带来更高的乙醇滴度，但本研究获得的结果处于工业相关范围内（Lennartsson et al., 2014）。虽然高温在SSF中的优势此前已有报道，但那些研究表明乙醇滴度因未发酵糖的积累而严重受限（Gao et al., 2018; Liu et al., 2014）。这凸显了改善的耐热性对于有效高温SSF的重要性。
【数据】软木补料分批SSF：40°C乙醇3.44%(w/v) vs 35°C为2.67%(w/v)，提高29%；两种温度下均无糖积累
3.4 碱预处理甘蔗渣在低和中等酶用量下的补料分批SSF
为确认Cellusec®4.0即使在高糖生产速率条件下也能实现完全糖利用，使用低（3.6FPU g⁻¹）和中等（15.1FPU g⁻¹）用量的自产纤维素酶制剂，对碱预处理甘蔗渣进行SSF（图5）。在3.6FPU g⁻¹的低酶用量下，未检测到葡萄糖或木糖的积累（原文截断），表明糖化速率是限制因素。在15.1FPU g⁻¹的中等酶用量下，Cellusec®4.0在48小时内实现最高8.0%（v/v）的乙醇滴度，相当于理论最大产率的83%，且残余糖积累极少。
【数据】甘蔗渣SSF/39°C：中酶用量(15.1FPU/g)下乙醇达8.0%(v/v)/48h，产率83%；低酶用量(3.6FPU/g)下无糖检测到
讨论与解读
对工业纤维素酶分泌型二代生物乙醇菌株Cellusec®3.3进行全基因组转化（WGT），产生了多个在高温混合糖发酵中性能改善的分离株。性能最佳的Cellusec®4.0在工业相关条件下对高粱浆的SSF中保持了这一表型，显著超越亲本菌株Cellusec®3.3。在预处理软木的补料分批SSF中，40°C较35°C的乙醇滴度大幅提升，证实了在使用足够耐热的酵母菌株时高温运行的优势。最终，使用自产酶制剂和Cellusec®4.0在39°C下对碱预处理甘蔗渣进行SSF，48小时内获得8.0%（v/v）乙醇，残余糖积累极少，产率达理论最大值的83%，凸显了该菌株的工业应用潜力。这些发现表明WGT是增强工业酵母菌株耐热性的有效方法。与高效混合糖利用和高抑制物耐受性相结合，它能够在高温补料分批SSF中实现更高的乙醇产量。Cellusec®4.0因此代表了应用于工业二代生物乙醇生产的强健且极具前景的菌株。
编译者解读
本研究的技术路线值得关注：WGT将远缘菌株的耐热性直接导入工业底盘，绕开了复杂的多基因编辑流程，且筛选在40.5°C固体培养基上进行——值得注意的是，结果中部分分离株在高温平板上生长良好但发酵性能反而下降，这提示"生长耐热"与"发酵耐热"可能由不同遗传位点控制。该方法的价值在于保留了亲本已优化的木糖利用和酶分泌等工业性状。局限在于WGT引入的遗传改变不明确，后续工业化应用可能面临调控合规性审查。从合成生物学应用角度看，该策略为工业菌株的性状改良提供了快速迭代的可行路径。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135490
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135490