来源：Regulation of rice bran physicochemical properties, bioactive components and functional properties by synergistic fermentation of Bacillus subtilis and Aspergillus niger（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
米糠是稻米加工的主要副产物，富含膳食纤维、多酚、黄酮、GABA等多种生物活性成分，但其致密的细胞壁结构限制了营养物质的释放与生物利用。本研究采用枯草芽孢杆菌、黑曲霉单菌及混合发酵策略处理米糠，系统考察了发酵对米糠微观结构、理化性质、活性成分及功能特性的调控效应。结果显示，混合发酵通过双菌酶系的协同互补作用，有效降解细胞壁多糖，使可溶性膳食纤维含量从7.865%提升至13.776%，GABA、多酚、黄酮等活性成分同步富集，抗氧化与吸附能力显著增强，为米糠的高值化利用提供了可行技术路径。
研究背景
米糠占稻米总质量的10%–12%，是极具高值开发潜力的农业副产物。除淀粉和膳食纤维等基础营养素外，米糠还富含多酚、黄酮、GABA以及钾、镁、磷等矿物质，这些成分赋予其抗氧化、代谢调节及吸附有害物质（如亚硝酸盐）等潜在功能，在功能食品、保健补充剂和饲料添加剂领域应用前景广阔。然而，米糠致密的细胞壁结构以及纤维素、半纤维素等难降解大分子的存在，阻碍了内部营养与生物活性成分的释放，降低了生物利用度。此外，米糠中淀粉和脂肪使其易于霉变，粗糙的质构和较差的溶解性进一步限制了其在食品工业中的规模化应用。因此，寻求高效、绿色、温和的改性技术以突破米糠利用瓶颈，提升其营养品质、生物活性和功能特性，实现资源化利用，成为当前研究的热点方向。
研究方法
2.1 材料
五常糙米购自当地。枯草芽孢杆菌ATCC 6633和黑曲霉CGMCC 3.4309购自上海微生物菌种保藏中心。耐高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。其余试剂均为分析纯。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌ATCC 6633、黑曲霉CGMCC 3.4309；试剂来源：上海源叶生物科技有限公司；试剂纯度：分析纯
2.2 米糠的分离与发酵
将糙米水分含量调节至14%。使用碾磨机（Quadrumat Junior，Brabender，德国）碾磨，过40目筛获得粗米糠。将粗米糠在5倍体积的正己烷中搅拌2 h，过滤除去正己烷，重复两次后风干。经80目筛粉碎后，获得米糠（RB）。基于前期实验结果，并参考Wang等（2025a）的方法稍作修改。将米糠置于培养皿中，高压灭菌（121°C，20 min）。在层流超净工作台中充分活化冻存菌株；枯草芽孢杆菌接种量设为10⁸ CFU/g，黑曲霉接种量设为10⁶ CFU/g；加入无菌水调节水分含量至1:1（v/w）；将菌液接种至米糠中，充分混匀。置于恒温恒湿培养箱（YJHS-70，上海一恒科技有限公司，中国）中，30°C、80%相对湿度条件下培养24、48和72 h。根据接种菌株和发酵时间，样品命名如下：对照组（CKRB）、无菌水发酵组（WFRB-24、WFRB-48和WFRB-72）、枯草芽孢杆菌发酵组（BFRB-24、BFRB-48和BFRB-72）、黑曲霉发酵组（AFRB-24、AFRB-48和AFRB-72）和混合发酵组（MFRB-24、MFRB-48和MFRB-72）。发酵结束后，样品冷冻干燥保存。
【数据】水分含量：14%；筛网：40目、80目；正己烷体积：5倍；提取时间：2h/次，重复2次；灭菌条件：121°C、20 min；接种量：枯草芽孢杆菌10⁸ CFU/g、黑曲霉10⁶ CFU/g；水分比：1:1（v/w）；发酵条件：30°C、80% RH；发酵时间：24、48、72 h
2.3 基本成分测定
米糠水分、蛋白质、灰分和淀粉含量的测定方法参照中国国家标准：GB/T 10362-2008（干燥法）、GB 5009.5-2016（凯氏定氮法）、GB 5009.4-2016和GB 5009.9-2016（酸水解法）。
【数据】测定方法：GB/T 10362-2008（水分，干燥法）、GB 5009.5-2016（蛋白质，凯氏定氮法）、GB 5009.4-2016（灰分）、GB 5009.9-2016（淀粉，酸水解法）
2.4 表面观察
样品研磨后置于导电胶上，喷金处理，在扫描电子显微镜（×2000，SU8600，HITACHI，日本）下拍照。样品用卡尔科弗卢尔白和罗丹明B染料染色，置于载玻片上，使用激光共聚焦扫描显微镜（LEICA TCS SP8，Leica，德国）在488 nm和561 nm激发波长下拍照。
【数据】SEM放大倍数：×2000；CLSM激发波长：488 nm、561 nm；仪器：SU8600（HITACHI）、LEICA TCS SP8（Leica）
2.5 理化与结构性质
#### 2.5.1 色度值
将样品置于色差仪（CS-820，CHN Spec，中国）中测定L、a、b*和ΔE值。
【数据】仪器：CS-820色差仪（CHN Spec，中国）；指标：L、a、b*、ΔE
#### 2.5.2 水分分布
将预称重的样品置于样品瓶中，放入永磁台式核磁共振分析仪（NMI20-015V-I，NIUMAG，中国）。水分分布测定参数设置如下：回波时间0.02 s，回波重复次数10,000。
【数据】回波时间：0.02 s；回波重复次数：10,000；仪器：NMI20-015V-I（NIUMAG，中国）
#### 2.5.3 纤维素组成与膳食纤维比例
纤维素含量、半纤维素含量和木质素含量分别使用Solarbio试剂盒BC 4280、BC 4445和BC 4200（北京索莱宝科技有限公司，中国）测定。可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维含量按照中国国家标准（GB 5009.88-2023）测定。
【数据】试剂盒：BC 4280（纤维素）、BC 4445（半纤维素）、BC 4200（木质素）；膳食纤维测定标准：GB 5009.88-2023
2.6 生化指标测定
#### 2.6.1 还原糖含量
采用DNS法测定，参照Wang等（2025b）的方法。
【数据】测定方法：DNS法
#### 2.6.2 GABA含量
将1 g样品与10 mL蒸馏水混合，在60°C下振荡2 h。离心后取0.5 mL上清液，加入0.2 mL 0.2 M硼酸盐缓冲液（pH 10.0）和1 mL 6%苯酚。在冰水浴中加入0.4 mL NaClO。室温静置10 min后，置于60°C水浴10 min，再置于冰浴10 min。待溶液变蓝绿色后，加入2 mL 60%乙醇。在645 nm处测定吸光度。同时制备标准曲线进行计算。
【数据】样品量：1 g；提取液：10 mL蒸馏水；提取条件：60°C、2 h；上清液：0.5 mL；硼酸盐缓冲液：0.2 mL、0.2 M、pH 10.0；苯酚：1 mL、6%；NaClO：0.4 mL；室温静置：10 min；水浴：60°C、10 min；冰浴：10 min；乙醇：2 mL、60%；检测波长：645 nm
#### 2.6.3 植酸含量
将0.5 g样品与30 mL 0.5 M硝酸混合，在30°C下振荡4 h，然后用水定容至50 mL。离心后，取0.15 mL上清液加入2.4 mL 0.5 M硝酸和0.6 mL硫酸亚铁铵（0.76 mM）。混合物在沸水浴中加热20 min，然后冷却至室温。加入0.2 mL 10%硫氰酸铵溶液，充分混匀，离心后在500 nm处测定吸光度。同时测定植酸钠标准溶液，绘制标准曲线。
【数据】样品量：0.5 g；硝酸：30 mL、0.5 M；提取条件：30°C、4 h；定容体积：50 mL；上清液：0.15 mL；硝酸：2.4 mL、0.5 M；硫酸亚铁铵：0.6 mL、0.76 mM；沸水浴：20 min；硫氰酸铵：0.2 mL、10%；检测波长：500 nm
2.7 功能活性测定
#### 2.7.1 总多酚和黄酮含量
参照Kukhtenko等（2024）的方法，采用Folin-Ciocalteu法和芦丁法分别测定多酚和黄酮含量。
【数据】多酚测定：Folin-Ciocalteu法；黄酮测定：芦丁法
#### 2.7.2 抗氧化活性
DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和总抗氧化能力（FRAP法）分别使用Solarbio BC4750、BC4770和BC1315试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，中国）测定。
【数据】试剂盒：BC4750（DPPH）、BC4770（ABTS）、BC1315（FRAP）
2.8 吸附能力测定
#### 2.8.1 胆固醇吸附
采用邻苯二甲醛法测定胆固醇吸附能力。简要步骤：蛋黄用去离子水稀释10倍，与样品以1:20（m/v）比例混合。混合物调节至pH 2和pH 7，在37°C下振荡2 h。离心后，取0.5 mL上清液与1 mL显色剂（0.1%邻苯二甲醛）和1 mL浓硫酸混合。混合物在37°C避光反应15 min，然后在500 nm处测定吸光度。同时建立胆固醇标准曲线。
【数据】蛋黄稀释倍数：10倍；样品比例：1:20（m/v）；pH：2和7；反应条件：37°C、2 h；上清液：0.5 mL；显色剂：1 mL、0.1%邻苯二甲醛；浓硫酸：1 mL；显色条件：37°C避光、15 min；检测波长：500 nm
#### 2.8.2 葡萄糖吸附
采用DNS法测定葡萄糖吸附能力。样品与50 mM葡萄糖溶液以1:40（m/v）比例混合，在37°C下振荡2 h。离心后，取0.2 mL上清液稀释至2 mL，加入1.5 mL DNS溶液，煮沸5 min，最后定容至25 mL。在540 nm处测定吸光度。同时制备葡萄糖标准曲线。
【数据】葡萄糖浓度：50 mM；样品比例：1:40（m/v）；反应条件：37°C、2 h；上清液：0.2 mL；DNS溶液：1.5 mL；煮沸时间：5 min；定容体积：25 mL；检测波长：540 nm
#### 2.8.3 亚硝酸盐吸附
将20 mg样品加入20 mL NaNO₂溶液（20 μg/mL）中，分别调节至pH 2和pH 7，在37°C下振荡2 h。离心后取2 mL上清液，加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸，混匀孵育5 min，然后加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺。反应15 min后在538 nm处测定。同时制备标准曲线。
【数据】样品量：20 mg；NaNO₂溶液：20 mL、20 μg/mL；pH：2和7；反应条件：37°C、2 h；上清液：2 mL；对氨基苯磺酸：2 mL、0.4%；孵育时间：5 min；盐酸萘乙二胺：1 mL、0.2%；反应时间：15 min；检测波长：538 nm
2.9 统计分析
所有试验重复3次（n = 3），数据以平均值±标准差表示。使用Minitab 18.0进行Tukey检验分析差异（p < 0.05），使用Origin 2021绘图。
【数据】重复次数：3次（n = 3）；统计方法：Tukey检验；显著性水平：p < 0.05；软件：Minitab 18.0、Origin 2021
研究结果
3.1 基本成分分析
不同发酵处理对米糠基本成分的影响如表1所示。与对照组（CKRB）相比，所有发酵组的水分含量均显著降低。黑曲霉发酵组（AFRB）水分含量持续下降，在72 h时达到最低点。相反，枯草芽孢杆菌发酵组（BFRB）的水分含量随时间推移而增加。混合发酵组（MFRB）的水分含量维持在中等水平，反映了两种微生物菌株之间的协同平衡。就粗蛋白而言，CKRB含量最低，而所有发酵组均呈现不同程度的增加。混合发酵组（MFRB）蛋白质含量最高，归因于发酵过程中微生物生物量的持续积累和蛋白质的持续合成。微生物蛋白酶将大分子蛋白质水解为易同化的小分子氮源，可能促进其积累。在淀粉样品中，CKRB含量最高。发酵后所有发酵组的淀粉含量均有所下降，但差异不显著，反映了微生物将淀粉作为碳源利用。灰分含量在整个发酵过程中基本保持不变，表明微生物活性对无机成分的影响极小。
【数据】水分含量：AFRB持续下降至72 h最低；粗蛋白：MFRB最高；淀粉：CKRB最高，发酵后下降但差异不显著；灰分：发酵前后基本不变
3.2 表面观察
#### 3.2.1 扫描电镜（SEM）
SEM结果（图1A）显示，CKRB呈现相对致密、紧实且光滑的表面形态。经不同发酵处理后，米糠的微观结构发生了变化。与对照组相比，WFRB的结构变化相对较小，仅呈现轻微的表明皱缩。这归因于水分蒸发等物理过程对细胞壁的影响有限。BFRB表面呈现大量细小孔隙，与蛋白酶和淀粉酶等水解酶对大分子物质的降解有关。AFRB表面呈现广泛的海绵状孔洞，这是黑曲霉分泌的纤维素酶和果胶酶有效破坏细胞壁致密结构的结果。MFRB表现出更明显的疏松化和多孔结构，这是两种真菌酶系统互补协同作用的结果。这种结构有利于内部营养物质和生物活性成分的释放，增强其生物利用度。
#### 3.2.2 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）
CLSM图像直观展示了不同发酵处理对米糠微观结构和元素分布的影响（图1B–D）。卡尔科弗卢尔白染色产生的蓝色荧光标记纤维素等细胞壁多糖；红色荧光标记蛋白质。WFRB的荧光信号分布与CKRB无显著差异，表明单纯水处理并未破坏细胞壁与蛋白质之间的结合状态。BFRB组中，红色荧光的分布范围略有扩大，而蓝色荧光（细胞壁多糖）区域收缩，可能与枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶降解作用有关。AFRB组的荧光信号呈现碎片化模式。MFRB组蓝色荧光强度降低且分布更加弥散，表明发酵过程中微生物分泌的水解酶部分降解了细胞壁多糖，破坏了其连续结构。
【数据】CKRB：表面致密、紧实、光滑；WFRB：轻微表面皱缩；BFRB：大量细小孔隙；AFRB：海绵状孔洞；MFRB：明显疏松化、多孔结构
3.3 理化与结构性质
#### 3.3.1 色度值
不同发酵处理显著改变了米糠的色度参数（L、a、b）和总色差（ΔE）（p < 0.05）（表2和图2A）。CKRB表现出最高的亮度值（L），而所有发酵组的L值均显著降低。这主要归因于发酵前高压灭菌引发的初始褐变，发酵过程中微生物代谢和美拉德反应进一步加深了色泽。就红绿值（a）而言，CKRB的a值最低，而发酵组显著升高，其中BFRB-72最高。这表明发酵米糠的红度增加，与微生物产生生物活性化合物和色素积累相关。黄蓝值（b）在发酵组中呈现不同程度的升高，MFRB与单菌发酵组相比无显著差异。就总色差（ΔE）而言，所有发酵组与CKRB均存在显著差异，其中BFRB-72的ΔE最高。这与枯草芽孢杆菌发酵过程中强烈的代谢活性和褐变反应有关。
#### 3.3.2 水分分布
低场核磁共振（LF-NMR）结果如图2B所示。CKRB中的水分主要以结合水（0.1–1 ms）和弱移动水（1–100 ms）形式存在，自由水（100–1000 ms）信号较弱。这表明天然米糠中的水分与大分子物质紧密结合，移动性较差。与CKRB相比，所有发酵组的结合水信号强度均显著降低。这主要是由于发酵前高压灭菌过程中结合水的损失，同时高温也破坏了大分子与水分之间的结合位点。发酵过程中，微生物分泌的水解酶进一步破坏了米糠的紧密结构，增强了非移动水和自由水的信号，同时将弛豫时间向更长方向移动。这表明发酵削弱了水分与大分子的结合，提高了水分的移动性。其中，MFRB的自由水信号增强最为显著。这归因于两种菌株的协同作用，破坏了细胞壁结构，改善了物料的持水与释放能力，与SEM和CLSM观察到的结构疏松化结果一致。
【数据】CKRB水分分布：结合水0.1–1 ms、弱移动水1–100 ms、自由水100–1000 ms信号弱；MFRB自由水信号增强最显著
#### 3.3.3 纤维素组成
如表2所示，不同发酵处理显著调控了米糠细胞壁三大核心组分（纤维素、半纤维素和木质素）的含量（p < 0.05），直接反映了微生物对米糠细胞壁结构的降解作用（图3A）。CKRB的纤维素含量最高，半纤维素水平也相对较高。这与天然米糠细胞壁的特征性致密网络结构一致——纤维素构成骨架，半纤维素充当连接组分。相比之下，虽然CKRB的纤维素含量最高，但所有发酵组的纤维素水平均显著降低。这种降低与微生物分泌的纤维素酶等水解酶对纤维素的降解有关。所有发酵组的半纤维素含量均显著下降，表明发酵有效降解了半纤维素并破坏了米糠细胞壁的致密结构。木质素含量在各发酵组中有所差异，其中MFRB呈现相对升高。这是由于纤维素和半纤维素的降解提高了木质素的相对比例，而非其绝对含量的增加。
【数据】纤维素：CKRB最高，发酵组显著降低；半纤维素：发酵组均显著下降；木质素：MFRB相对升高（因纤维素/半纤维素降解导致比例上升）
#### 3.3.4 膳食纤维比例
不同发酵处理显著改变了米糠中膳食纤维的组成比例。
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究系统考察了枯草芽孢杆菌和黑曲霉单菌及混合发酵对米糠结构、理化性质和功能活性的影响。结果表明，发酵部分破坏了米糠致密的细胞壁结构，促进了纤维素和半纤维素的降解（分别从515.46降至355.51 mg/g和从91.40降至57.15 mg/g），同时增加了可溶性膳食纤维含量（从7.865%增至13.776%）。与此同时，发酵显著富集了功能成分（GABA、多酚、黄酮），并提高了对葡萄糖、亚硝酸盐和胆固醇的吸附能力。值得注意的是，与单菌发酵相比，混合发酵通过枯草芽孢杆菌和黑曲霉的协同作用，实现了对细胞壁多糖更高效的降解和生物活性成分的释放。该方法同时改善了理化性质、富集了功能成分并增强了多维功能性，从而协同优化了米糠的营养与功能品质。本研究为米糠资源的绿色转化与应用提供了参考。然而，未来研究应深入探讨其与食品体系的相容性及调控机制，以全面评估其应用潜力。
编译者解读
本研究采用双菌混合发酵策略，巧妙利用了枯草芽孢杆菌与黑曲霉酶系的互补性——前者侧重蛋白降解，后者擅长纤维素瓦解，协同效果在SEM图像中清晰可见。从合成生物学应用角度看，该策略规避了基因工程改造的安全顾虑，以天然微生物组合实现了米糠细胞壁的靶向拆解，是一种"绿色低成本"的生物加工方案。值得关注的是，混合发酵在功能成分释放（GABA、多酚、黄酮）和吸附性能提升上的协同增益，为农业副产物的原位增值提供了可复制的范式。不过，研究仍停留在表观现象与成分分析层面，发酵过程中酶系的动态变化与菌群互作机制尚待深入解析。
参考来源
Zhao, W. (2026). Regulation of rice bran physicochemical properties, bioactive components and functional properties by synergistic fermentation of Bacillus subtilis and Aspergillus niger. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109609
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109609