来源：Engineering compartmentalized utilization of acetate with glucose for high-level squalene and C30 carotenoids production in Yarrowia lipolytica（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乙酸作为廉价可持续碳源在生物炼制中备受关注，但其高浓度毒性抑制微生物生长。本研究通过代谢网络重编程、亚细胞区室化工程及葡萄糖-乙酸平行代谢路径的构建，在解脂耶氏酵母中逐步将角鲨烯产量提升至2957.25 mg/L，并进一步利用工程化MspCrtN变体合成C30类胡萝卜素，在1.5 L生物反应器中实现3028.76 mg/L的最高产量。该工作为高价值萜类化合物的绿色生物合成提供了可扩展的平台策略。
研究背景
将可持续低碳原料生物转化为高价值产品，是应对气候变化与推动绿色制造的重要路径。乙酸作为一种廉价碳源（约300–450美元/吨），相较葡萄糖（约500美元/吨）具有显著成本优势，且可来源于合成气、木质纤维素水解液、有机废弃物厌氧消化及CO₂光催化转化等多种可持续渠道。产乙酸菌还能通过Wood–Ljungdahl途径将CO和CO₂等C1气体转化为乙酸，为生物固碳提供了新思路。乙酸经一步或两步酶促反应转化为乙酰辅酶A——萜类和脂肪酸等价值化合物的关键代谢前体，该过程无碳损失，原子经济性高。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为非模式工业宿主，凭借其天然的耐酸能力和乙酰辅酶A衍生代谢物的合成潜力，在乙酸生物转化中展现出突出优势。然而，高浓度乙酸对微生物的毒性抑制仍是制约发酵效率的核心瓶颈。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用及构建的酵母菌株列于表S1。解脂耶氏酵母Po1f KU70ΔKU80Δ作为构建启动子评估工程菌株的亲本菌株，而此前构建的工程菌株YS17作为开发乙酸适应性工程菌株的起始菌株。大肠杆菌TOP10用于质粒构建与扩增。解脂耶氏酵母转化子在缺乏尿嘧啶和亮氨酸的合成 dropout（SD-Ura-Leu）固体平板上筛选。大肠杆菌在添加100 mg/L相应抗生素（氨苄青霉素或卡那霉素）的Luria-Bertani（LB）培养基中，于37°C、250 rpm条件下培养。解脂耶氏酵母菌株在含葡萄糖（YPD，20 g/L葡萄糖）、油酸（YPO，10.45 g/L油酸）、乙酸（YPA，27.4 g/L乙酸钠）、乙酸与油酸（YPAG，27.4 g/L乙酸钠和10.3 g/L葡萄糖）或高浓度乙酸（HYPA，41 g/L乙酸钠）的培养基中，于摇瓶或24深孔板中、30°C、250 rpm条件下培养，初始OD600为0.1。SD-Ura-Leu培养基购自ELITE Biotech（中国上海），氨苄青霉素购自Solarbio（中国北京）。
【数据】培养基：YPD/YPO/YPA/YPAG/HYPA；葡萄糖：20 g/L；油酸：10.45 g/L；乙酸钠：27.4 g/L或41 g/L；温度：30°C（酵母）/37°C（大肠杆菌）；转速：250 rpm；初始OD600：0.1；抗生素：100 mg/L
2.2 质粒与菌株构建
质粒构建采用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme，中国南京）。供体质粒以pUC57为载体骨架生成。pCRISPRyl质粒以购自Addgene的载体（Plasmids #84608-84617）为骨架生成。MspCrtN的定点突变或随机突变通过基于PCR的诱变引入，并经DNA测序验证。异源基因经密码子优化后由Azenta, Inc.合成，其序列列于表S2。启动子、终止子和同源臂的PCR扩增以解脂耶氏酵母基因组DNA为模板。本研究所用引物以CE Design软件设计并由Azenta, Inc.合成。阳性大肠杆菌转化子首先通过菌落PCR鉴定，所有重组质粒随后经DNA测序验证。采用CRISPR-Cas9介导的基因编辑进行解脂耶氏酵母基因组操作。供体质粒和pCRISPRyl质粒通过醋酸锂转化法导入解脂耶氏酵母。阳性转化子通过菌落PCR确认。解脂耶氏酵母基因组DNA使用E.Z.N.A. Yeast DNA Kit（Omega Bio-Tek）按制造商说明书提取。
【数据】质粒骨架：pUC57/pCRISPRyl（Addgene #84608-84617）；克隆试剂盒：ClonExpress MultiS；转化方法：醋酸锂法；验证方法：菌落PCR+DNA测序
2.3 分析方法
细胞生长通过UV–Vis分光光度计（UV-5100，元析，中国上海）测定OD600监测。细胞干重（DCW）在发酵液加热干燥后测定。GFP荧光强度使用酶标仪在激发波长485 nm和发射波长528 nm下测定。培养液中乙酸浓度通过分光光度法量化。在指定时间间隔收集1 mL发酵液样品。细胞在5000 ×g离心10 min去除，所得上清液转移至新鲜微量离心管中用于分析。随后，将0.1 mL上清液和0.04 mL 19.2 N硫酸加入0.3 mL乙二醇中。混合物短暂涡旋后在100°C水浴中孵育3 min。冷却至室温后，依次加入0.1 mL盐酸羟胺、0.4 mL 4.5 N氢氧化钠和2 mL 5%酸化氯化铁。所得溶液在495 nm处用分光光度计测定吸光度。发酵液中葡萄糖浓度通过分光光度法测定。配制不同浓度葡萄糖标准溶液：将100 μL各葡萄糖标准溶液（0.0625 g/L、0.125 g/L、0.25 g/L、0.5 g/L和1 g/L）转移至1.5 mL微量离心管中。随后向每管加入200 μL DNS试剂，充分涡旋混合。将试管煮沸5 min并冷却至室温。取100 μL反应混合物，用酶标仪在540 nm处测定吸光度。记录值用于生成标准曲线。发酵液中葡萄糖浓度测定：发酵液样品在12,000 rpm离心，所得上清液稀释50倍。取100 μL稀释溶液与200 μL DNS试剂混合，涡旋后煮沸5 min，冷却至室温。随后将100 μL反应混合物转移至酶标仪，在540 nm处测定吸光度。原始（未稀释）发酵液中的葡萄糖浓度基于标准曲线计算。乙酰辅酶A含量使用市售检测试剂盒（目录号ADS-F-S009，24样品UV法，Adszyn Biotechnology Co., Ltd.，中国）按制造商说明书稍作修改进行测定。约5 × 10⁶个细胞或细菌通过离心收集，沉淀重悬于1 mL提取缓冲液中。悬浮液在冰上超声处理（200 W，3 s脉冲，10 s间隔，重复30次），然后在12,000 ×g、4°C离心10 min。上清液置于冰上用于分析。340 nm处吸光度增加值（ΔA）与乙酰辅酶A含量成正比。脂肪酸分析使用配备火焰离子化检测器（FID）和熔融石英毛细管柱（SH-2560，100 m × 0.25 mm内径 × 0.20 μm膜厚，Shimadzu，日本）的气相色谱仪（GC-2014，Shimadzu Corporation，日本）。取1 mL样品与9 mL生理盐水（0.9% NaCl）混合。从该稀释混合物中取0.250 mL转移至螺口管中。通过依次加入8 mL氢氧化钠-甲醇溶液和7 mL三氟化硼-甲醇溶液进行脂肪酸的皂化和甲基化。衍生化后加入10 mL正庚烷并充分涡旋。随后加入10 mL饱和氯化钠溶液促进相分离。收集上层有机相并与3.970 g无水硫酸钠混合脱水。静置后小心吸取澄清上清液用于GC分析。色谱条件如下：载气（氮气）流速16.3 mL/min；进样量1 μL；分流比10:1。柱温箱程序从100°C起始（保持4 min），以2.9°C/min升温至240°C（保持15 min）。进样器温度设定为230°C，总运行时间67.28 min。FID检测器温度维持在240°C，氢气、空气和补充气（氮气）流速分别为40、400和30 mL/min。取1 mL发酵液中的细胞，在1 mL十二烷（用于角鲨烯）或乙酸乙酯（用于C30类胡萝卜素）存在下，用1.5 g氧化锆珠（0.5 mm）破碎。破碎在−4°C、55 Hz条件下使用冷冻研磨机（上海净信，中国）进行30 min。离心（13,000 rpm，10 min）后回收上层有机层（200 μL）。角鲨烯含量参照文献用GC（Agilent 7820A）测定。C30类胡萝卜素使用LC-MS/MS（Thermo Fisher Scientific）鉴定和定量，采用Waters HSS T3色谱柱（1.7 μm，2.1 × 100 mm），柱温40°C。LC梯度使用溶剂A（0.1%甲酸水溶液）和B（100%甲醇），流速0.3 mL/min。Q Exactive质谱仪在DDA模式（top 10前体，m/z 100–1500）下运行，采用阶梯NCE（10%、30%、55%）。常规筛选在470 nm处进行。
【数据】OD600测定：UV-5100分光光度计；GFP荧光：激发485 nm/发射528 nm；乙酸测定：495 nm吸光度；葡萄糖测定：540 nm吸光度（DNS法）；乙酰辅酶A：340 nm吸光度；超声破碎：200 W，3 s脉冲/10 s间隔×30次；脂肪酸GC：FID检测器，100°C保持4 min→2.9°C/min→240°C保持15 min；细胞破碎：−4°C、55 Hz、30 min；角鲨烯提取：十二烷；C30类胡萝卜素提取：乙酸乙酯
研究结果
3.1 解脂耶氏酵母诱导型可切除标记回收系统的开发
在前期工作中，我们采用标准化无标记基因整合方法进行解脂耶氏酵母的途径工程[13]。该方案虽能实现快速的目标基因整合，但在大片段DNA（18.0 kb）整合中效率较低，且在质粒去除过程中整合的表达 cassette 频繁丢失。为解决上述局限，我们开发了一种将Cre/loxP重组与CRISPR/Cas9偶联的精细化系统，以在解脂耶氏酵母中实现更快速、更可靠的途径工程（图1a）。在该系统中，CRISPR/Cas9在引导RNA（gRNA）引导下于特定基因组位点引入DNA双链断裂（DSB），随后通过同源定向修复（HDR）利用提供的诱导型可切除供体模板进行修复。首先，cre基因表达置于铜诱导启动子pMT-2控制下，从而可通过廉价高效的诱导剂Cu²⁺激活[14]。其次，原始URA选择 cassette 的两侧分别连接异源lox位点序列lox71（5′）和lox66（3′）[15]。第三，针对三个不同基因组位点（AXP、D1和E9）的靶向片段分别克隆入质粒pCRECu，生成位点特异性载体pCRECu-AXP、pCRECu-D1和pCRECu-E9。
为表征pMT-2的诱导特性，通过定量MspCrtN报告基因的表达水平来评估其强度。表达水平通过监测所得C30类胡萝卜素在470 nm处的吸光度评估——这是一种无需酶处理的直接检测方法。启动子强度与培养基中CuSO₄浓度相关，表现出低背景表达和严格的诱导剂依赖性调控（图1b）。
在尿嘧啶缺陷培养基（不含Cu²⁺）上的初始筛选期间，启动子保持失活状态。随后转移至含Cu²⁺的培养基中诱导cre表达，催化lox71与lox66位点之间的重组，进而切除Cre-URA cassette。该过程实现了解脂耶氏酵母中尿嘧啶营养缺陷型标记的高效回收。我们采用Cre/loxP URA标记回收与CRISPR/Cas9载体组合进行基因组编辑。三个不同的巨型DNA片段（各29 kb）作为供体DNA分别克隆入靶向载体pCRECu-AXP、pCRECu-D1和pCRECu-E9（图1d、e、f）。各质粒在其预期位点的成功基因组整合首先通过PCR验证。经验证的各基因座URA⁺转化子随后转移至含Cu²⁺的YPD培养基中进行24小时诱导。诱导后将培养物划线接种于含5-氟乳清酸（5-FOA）的YPD平板上。所得菌落无法在尿嘧啶缺陷（URA⁻）培养基上生长，表明标记已被有效切除。跨编辑位点的PCR产物测序确认了lox位点处的精确切除。结果显示，近100%失去URA原养型表型的菌落已切除标记cassette（图1c）。上述结果表明，Cu²⁺诱导型Cre/loxP URA标记回收系统为解脂耶氏酵母中巨型DNA片段的稳定整合提供了高效平台。
【数据】诱导剂：Cu²⁺（CuSO₄）；标记回收效率：近100%；巨型DNA片段：29 kb×3；诱导时间：24 h；筛选：5-FOA平板
3.2 代谢网络重编程增强解脂耶氏酵母的乙酸同化能力
鉴于乙酸（HAc）的pKa相对较低（4.75）[16]，工程菌株使用41 g/L乙酸钠（NaAc）培养，相当于30 g/L乙酸（HAc）。但发酵培养基中高浓度乙酸会抑制微生物生长并损害代谢效率。此前构建的工程菌株YS17在41 g/L乙酸中72 h达到最大OD600为8.33，产生281.87 mg/L角鲨烯[17]。该性能显著低于其在常规碳源上的生长——在20 g/L葡萄糖中最大OD600为24.55，角鲨烯产量为847.47 mg/L。
为缓解乙酸毒性并提高耐受性，我们将编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶（ackA-pta）的大肠杆菌基因引入细胞质，以增强胞质乙酸代谢途径（图2a）。据报道，该间接途径在解脂耶氏酵母中比直接的乙酰辅酶A合酶（ACS）途径更有利于乙酸利用[6]。当乙酸作为碳源时，两种菌株均主要利用乙醛酸支路和糖异生途径。乙醛酸循环是三羧酸循环的一种变体，允许细胞在缺乏单糖的情况下利用乙酸满足代谢需求，在解脂耶氏酵母的过氧化物酶体中运行。两条途径均起始于乙酰辅酶A。
为优化这一中心节点，我们创建了针对乙酰辅酶A的靶向代谢捷径。首先，将来自肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）的异源反馈抑制不敏感型乙酰辅酶A合酶变体（L641P）（SeACSL641P）靶向至过氧化物酶体[18]。其次，将天然消耗ATP的乙酰辅酶A合酶（ACS）靶向至线粒体——ATP生成的主要场所——以创建局部捷径。如图所示，菌株YAS03中这些对乙酸摄取途径的修饰显著改善了性能，将OD600提升至17.31，角鲨烯滴度提升至651.93 mg/L。
为进一步阐明乙酸同化能力的提高归因于区室特异性乙酰辅酶A库的扩大还是碳通量分布的改变，我们在72小时时间点测定了相关浓度（图S1）。此外，我们以乙酰辅酶A衍生脂质的积累作为替代指标（图S2）。值得注意的是，脂肪酸积累从YS17到YAS03逐渐增加，而乙酰辅酶A水平则反向下降。这种反向关系表明，工程化修饰（胞质AckA-Pta、过氧化物酶体SeACSL641P和线粒体ACS）增强了乙酰辅酶A向下游产物的代谢通量，而非仅增加其总库。稳态乙酰辅酶A浓度降低伴随脂质产量升高，表明乙酰单元被更有效地引导至合成代谢途径，从而支撑了YAS03中观察到的更高角鲨烯滴度。
接下来，为增强糖异生并促进NAD(P)H生成，我们过表达了两个关键酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（Pck1）[19]——催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）——通过磷酸戊糖途径增加NADPH再生[20]。菌株YAS05中的这一修饰使角鲨烯产量较基础菌株YAS03提高了13.58%。
为进一步改善乙酸利用并鉴定额外瓶颈，我们筛选了一系列具有不同代谢功能的基因，评估它们对角鲨烯滴度和细胞适应性的影响。靶向策略及其原理包括：表达磷酸酮醇酶（Xpk）将磷酸戊糖途径中间体转化为乙酰磷酸[21]，过表达过氧化氢酶（CTT1）以缓解氧化应激，以及转录激活因子HAA1以增强膜完整性[22,23]，引入NADH激酶（POS5）将NADH转化为NADPH[24]，调节整合膜蛋白Gpr1以改变乙酸胁迫敏感性[25]。在这些干预措施中，过表达内源质膜蛋白Gpr1效果最为显著，3天时OD600提升至17.88，角鲨烯滴度提升至766.43 mg/L（171.06 mg/g DCW）（图2b），5天时OD600提升至20.46，角鲨烯滴度提升至968.01 mg/L（196.41 mg/g DCW）（图2c）。此前的亚细胞分级鉴定将Gpr1p确认为一种促进乙酸摄取的整合膜羧酸转运蛋白，其缺失已被证明会延迟对乙酸的适应。
【数据】YS17在41 g/L乙酸中：OD600=8.33（72 h），角鲨烯281.87 mg/L；YS17在20 g/L葡萄糖中：OD600=24.55，角鲨烯847.47 mg/L；YAS03：OD600=17.31，角鲨烯651.93 mg/L；YAS05较YAS03提高13.58%；Gpr1过表达（3天）：OD600=17.88，角鲨烯766.43 mg/L（171.06 mg/g DCW）；Gpr1过表达（5天）：OD600=20.46，角鲨烯968.01 mg/L（196.41 mg/g DCW）
3.3 区室化乙酸与葡萄糖利用工程实现角鲨烯高产
在获得乙酸适应性增强的菌株后，我们进一步探索了在解脂耶氏酵母中通过区室化策略实现乙酸和葡萄糖的并行利用。该策略的核心设计理念是：将葡萄糖代谢和乙酸代谢分别定位于不同的亚细胞区室中，从而避免两种底物竞争同一代谢途径时产生的通量冲突。通过这种方式，葡萄糖可以在细胞质中经糖酵解途径代谢，而乙酸则在过氧化物酶体或线粒体中被高效同化，两条途径各自独立运行但又共同为角鲨烯合成提供乙酰辅酶A前体。
构建区室化工程菌株后，我们在含葡萄糖和乙酸钠的复合培养基中评估了各菌株的生长和角鲨烯产量。结果显示，通过将乙酸同化途径锚定于过氧化物酶体、将葡萄糖代谢保留于细胞质，工程菌株YAS13实现了两种碳源的协同利用，角鲨烯产量进一步提升至2957.25 mg/L（371.84 mg/g DCW）。
【数据】YAS13角鲨烯产量：2957.25 mg/L（371.84 mg/g DCW）
3.4 葡萄糖与乙酸共利用对角鲨烯生物合成的影响
为系统评估葡萄糖和乙酸共利用对角鲨烯生物合成的影响，我们设计了对照实验，比较了不同碳源组合下的发酵性能。结果显示，仅以葡萄糖为单一碳源时，工程菌株的角鲨烯产量和生物量均低于葡萄糖-乙酸共利用条件。这表明乙酸的补充不仅没有与葡萄糖竞争碳通量，反而通过提供额外的乙酰辅酶A前体，增强了整体代谢效率。
进一步分析显示，在葡萄糖-乙酸共利用条件下，菌株能够在发酵早期优先消耗乙酸，随后转向葡萄糖代谢，形成一种天然的序贯利用模式。这种碳源利用的动态调控有利于维持胞内乙酰辅酶A和能量水平的稳定，从而支持更高水平的角鲨烯合成。
【数据】碳源：葡萄糖+乙酸钠；共利用模式：序贯利用（先乙酸后葡萄糖）
3.5 通过MspCrtN分子工程提升C30类胡萝卜素产量
在获得高效角鲨烯生产平台菌株YAS13后，我们将其用作合成下游C30类胡萝卜素的底盘菌株。C30类胡萝卜素由角鲨烯经脱氢角鲨烯合成酶（CrtM）和脱氢角鲨烯去饱和酶（CrtN）催化合成。其中MspCrtN（来自Methylomonas sp.的CrtN同源物）的催化效率对该途径的通量至关重要。
我们首先建立了基于颜色的高通量筛选方法——由于C30类胡萝卜素具有特征性的黄色至红色色素，菌落颜色可直接反映MspCrtN的催化活性。通过易错PCR对MspCrtN全基因进行随机突变，构建突变体文库后涂布筛选，获得了多个催化活性提高的变体。进一步对酪氨酸残基进行定点饱和突变，鉴定出关键酪氨酸位点的最优替换组合。最终工程化MspCrtN变体的引入使C30类胡萝卜素产量达到150.99 mg/L（18.37 mg/g DCW）。
【数据】C30类胡萝卜素产量：150.99 mg/L（18.37 mg/g DCW）；筛选方法：颜色高通量筛选+易错PCR+定点饱和突变
3.6 通过MspCrtN表达调控提升C30类胡萝卜素产量
在获得MspCrtN催化活性增强的变体后，我们进一步优化了其在YAS13底盘中的表达水平。首先，设计并构建了脂肪酸响应型启动子——利用脂肪酸合成途径的天然调控元件，使MspCrtN的表达与细胞内脂肪酸代谢状态偶联，从而实现表达水平的动态调控。以hrGFP荧光强度评估启动子活性，筛选出具有适当表达强度和响应特性的启动子变体。
其次，设计并构建了蛋白质标签系统，通过融合不同稳定性的蛋白降解标签来调节MspCrtN在细胞内的半衰期，从而在不同时间尺度上控制其表达水平。此外，还构建了多拷贝表达模块以增加MspCrtN的基因剂量。通过上述表达调控策略的组合优化，C30类胡萝卜素产量在摇瓶水平得到进一步提升。
【数据】启动子类型：脂肪酸响应型；评估方法：hrGFP荧光强度；调控策略：蛋白标签+多拷贝表达
3.7 C30类胡萝卜素工程菌株的生物反应器发酵
在摇瓶水平完成菌株优化后，我们进行了生物反应器放大试验。首先设计并构建了C30类胡萝卜素模块质粒，将优化的MspCrtN变体及其表达调控元件组装为一个完整的合成模块。随后，在1.5 L生物反应器中采用葡萄糖-乙酸共底物补料分批发酵策略，考察了工程菌株的发酵动力学。
发酵过程中定期取样监测细胞生长、底物消耗和产物积累。在优化的补料策略下，工程菌株在生物反应器中展现出优异的发酵性能。最终发酵液呈现深黄色至橙红色的特征性色素积累。C30类胡萝卜素的最大产量达到3028.76 mg/L（59.26 mg/g DCW），较摇瓶水平提高了约20倍。
【数据】反应器规模：1.5 L；发酵策略：葡萄糖-乙酸共底物补料分批；C30类胡萝卜素最大产量：3028.76 mg/L（59.26 mg/g DCW）
讨论与解读
乙酸作为一种来源于农工业残留物的丰富低成本碳源，在生物炼制中具有广阔前景。然而其固有毒性通过抑制微生物代谢和底物同化构成重大挑战。解脂耶氏酵母凭借其适度的耐酸能力和从可持续底物生产乙酰辅酶A衍生化学品的天然能力，已成为下一代底盘菌株。尽管近年来的代谢工程和微生物电合成（MES）策略显著提高了该宿主的乙酸利用效率[6]，但MES系统的复杂性增加了下游处理负担和电力成本，削弱了低物料成本和高生产能力优势，限制了其工业应用。
本研究通过整合遗传工程、代谢重连和区室化工程的迭代策略，开发了一系列高盐适应性解脂耶氏酵母菌株。该策略获得了对高盐环境适应性增强且保留工业相关特性的平台菌株。从最初的乙酸同化代谢重编程（YAS03），到Gpr1过表达（YAS05），再到区室化双底物利用策略（YAS13），角鲨烯产量从281.87 mg/L逐步提升至2957.25 mg/L，实现了超过10倍的增产。在此基础上，通过MspCrtN分子工程和表达调控，成功将高产的角鲨烯合成通量引导至C30类胡萝卜素合成，并在生物反应器放大中验证了该策略的可行性。
编译者解读
该研究的核心价值在于其"代谢重编程→区室化→产物通道重定向"的三级递进策略。通过将乙酸同化途径分别定位于过氧化物酶体和线粒体，巧妙规避了胞质中葡萄糖代谢与乙酸代谢的通量竞争——这种空间分离思路对合成生物学中多底物共利用问题具有普适参考意义。值得注意的是，Gpr1作为膜转运蛋白的过表达能同时提升生长和产物合成，提示底物摄取往往是真核细胞工厂中被忽视的限速环节。MspCrtN的颜色高通量筛选策略则为非模式酵母中酶定向进化提供了低成本范式。局限在于，当前乙酸耐受机制的理解仍以表型为主，深层调控网络尚待解析；生物反应器放大虽达3 g/L级，但乙酸投加策略的精细优化仍有空间。
参考来源
Zhu K. Engineering compartmentalized utilization of acetate with glucose for high-level squalene and C30 carotenoids production in Yarrowia lipolytica. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.180852
DOI: 10.1016/j.cej.2026.180852