来源：Vector and strain optimization for enhanced production of HPV-VLPs in Komagataella phaffii（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
HPV16 L1病毒样颗粒（VLP）是宫颈癌预防性疫苗的核心抗原。本研究系统比较了三种常用毕赤酵母菌株（GS115、X-33、KM71H）在两种启动子（甲醇诱导型AOX1与组成型GAP）驱动下的HPV16 L1表达效果，并引入BioLector XT微型生物反应器进行过程优化。结果显示，GS115菌株搭配AOX1启动子产量最高，达20.50 mg/L，较X-33和KM71H分别提升约1.9倍和3.2倍。该研究为VLP类生物制品生产平台的选择提供了可参考的系统性工作流程。
研究背景
人乳头瘤病毒（HPV）通过性接触传播，可导致宫颈癌、肛门癌及头颈鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤。HPV16是最主要的高危型别，与全球侵袭性宫颈癌的发生密切相关。HPV为直径50–60 nm的小型无包膜病毒，属乳头瘤病毒科，由L1和L2两种衣壳蛋白构成。L1作为主要衣壳蛋白（单体约55 kDa），72个L1五聚体组装成二十面体衣壳。基于L1蛋白自组装形成的病毒样颗粒（VLP）在形态、大小和表面表位方面高度模拟天然病毒，但不含遗传物质，因此不具备复制和感染能力，可诱导强烈免疫应答，是安全有效的疫苗平台。目前已有Gardasil（HPV）、Engerix-B（乙肝）和Hecolin（戊肝）等VLP疫苗上市。在表达系统选择上，毕赤酵母（Komagataella phaffii）相比酿酒酵母具有更高的细胞密度、更好的可放大性和较强的蛋白分泌能力，日益成为VLP生产的优选宿主。本研究旨在通过系统评估宿主菌株、启动子类型和培养条件，建立HPV16 L1-VLP在毕赤酵母中的整合优化策略。
研究方法
菌株、载体与试剂
大肠杆菌DH5α用于克隆和表达载体的扩增。K. phaffii Mut⁺菌株（X-33、GS115）和Mutˢ菌株（KM71H）由印度IIT-Delhi的Saroj Mishra教授提供。质粒pPICZαB和pGAPZa-STE2–1D4购自Addgene（美国）。HPV16 L1基因经密码子优化后由Thermo Fisher Scientific（美国纽约）合成。限制酶和T4连接试剂盒购自NEB（美国），培养基购自Hi Media（印度）。蛋白和DNA ladder购自GeneDirex，质粒提取试剂盒购自Edna BioLabs（印度）。其他化学品和试剂购自Sigma-Aldrich、Merck、Thermo Fisher Scientific和Lonza。HPV16 L1一抗（ab69）和抗小鼠IgG二抗购自Abcam（英国）。
AOX和GAP启动子载体构建
采用pPICZαB和pGAPZa-STE2–1D4质粒在K. phaffii中表达HPV16 L1基因。HPV16 L1基因序列由Thermo Fisher Scientific（美国纽约）合成，经密码子优化（CAI = 0.86），GC含量为47%。在起始密码子上游添加Kozak序列（GAAACG）以增强翻译起始。两种质粒均通过转化大肠杆菌DH5α进行扩增，使用Edna spin质粒提取试剂盒（Edna，印度）提取质粒。通过1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop分光光度法验证纯度和浓度。载体（pPICZαB和pGAPZa-STE2–1D4）与HPV16 L1插入片段用BstBI和KpnI（NEB，美国马萨诸塞州）进行双酶切。酶切片段经1%（w/v）琼脂糖凝胶分离后，使用T4 DNA连接酶（NEB，美国马萨诸塞州）按1:3比例连接，分别生成AOX启动子驱动的pPICZB_HPV16 L1和GAP启动子驱动的pGAPZ-STE2–1D4_HPV16 L1表达载体（参见图1a和b）。连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过BstBI和KpnI双酶切验证阳性克隆。从单个阳性克隆中提取质粒，获得足够浓度用于K. phaffii转化。
*K. phaffii*菌株转化
载体构建体pPICZB_HPV16 L1和pGAPZ-STE2–1D4_HPV16 L1分别用ScaI和BspHI限制酶（NEB，美国）线性化，并通过琼脂糖凝胶回收纯化。KM71H、GS115和X-33三种K. phaffii菌株的电感受态细胞按照K. phaffii EasySelect™表达试剂盒方案（Invitrogen，美国）制备，使用LiAc（0.1 M）和DTT（10 mM）处理以提高转化效率。将线性化载体（各1 µg）与80 µL电感受态细胞混合，在2 mm电转杯中使用Bio-Rad Gene Pulser电转仪（2.5 kV，25 μF，200 Ω，5 ms）进行电穿孔。转化细胞在YPDS培养基中先静置孵育1小时，再振荡孵育2小时（180 rpm），然后涂布于含100 µg/mL zeocin的YPDS琼脂平板。平板在30°C培养2–5天。通过影印平板法在zeocin浓度递增（100–2000 µg/mL）的YPDS琼脂上筛选阳性克隆。不同菌株与载体组合构建的K. phaffii克隆汇总于表1。
摇瓶和微型生物反应器培养
摇瓶实验设三次重复，工作体积50 mL。GAP启动子驱动菌株（组1）使用YPD培养基，AOX启动子驱动菌株（组2）使用BMMY培养基。组1中，X-33、KM71H和GS115菌株在10 mL YPD中于28°C、200 rpm振荡过夜培养，然后接种至50 mL YPD中，每24小时补加葡萄糖。组2中，菌株在YPD中过夜培养后收集，重悬于BMGY中过夜培养，再转接至BMMY（OD600 1.0），每24小时添加甲醇（0.5 mL）进行诱导。相同克隆在BioLector XT微型生物反应器中使用MTP_48-FlowerPlate培养板培养，持续监测溶解氧（维持在30%）和pH（控制在5.0）。培养板用F-GP-10封板膜密封，在28°C、1200 rpm、≥85%湿度条件下培养。AOX启动子菌株在1000 µL BMMY（pH 5.0）中培养，GAP启动子菌株在YPD（pH 5.0）中培养，初始OD600为1.0。诱导时，每24小时在观察到溶解氧（DO）尖峰后立即添加1%（v/v）甲醇（AOX菌株）或1%（w/v）葡萄糖（GAP菌株）。96小时后收获培养物，测量OD值，并分析细胞裂解液中的HPV16 L1表达。
细胞密度测定与细胞裂解
使用Multiskan GO微孔板分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）在OD600处测量细胞浓度。湿重（WCW）和干重（DCW）通过离心和干燥培养样品确定。所有测量均设三次重复。胞内VLP通过裂解K. phaffii细胞提取。小规模裂解时，将细胞沉淀与玻璃珠在裂解缓冲液（10 mM磷酸盐缓冲液、5 mM EDTA、50 mM NaCl、8%（v/v）甘油、1 mM PMSF，pH 8）中混合，经15轮珠磨破碎（每轮50秒），期间在冰上冷却。澄清裂解液储存于4°C。明场显微镜分析确认细胞破碎成功。
SDS-PAGE和Western blot分析
细胞裂解液与5× SDS-PAGE上样缓冲液混合后在90°C煮沸15分钟，经10%（w/v）SDS-PAGE分离。蛋白条带用考马斯亮蓝染色观察。Western blot时，蛋白转移至PVDF膜，用含5%（w/v）脱脂奶粉的TBST封闭。膜与HPV16 L1单克隆抗体（CamVir 1，Abcam，1:2000稀释）及过氧化物酶标记的抗小鼠IgG二抗（1:5000稀释）孵育。使用增强化学发光试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）检测阳性条带。
RP-HPLC和质谱分析
含HPV VLP的细胞裂解液用30%（w/v）硫酸铵沉淀，4°C孵育过夜，离心收集沉淀。沉淀重悬于含8 M GuHCl和100 mM DTT的缓冲液中，将VLP解聚为L1蛋白。RP-HPLC分析使用XBridge BEH300 C4色谱柱（3.5 µm，4.6 × 150 mm，300 Å；部件号186004504，Waters），流动相A为含0.1%甲酸（FA）的MilliQ水，流动相B为含0.1% FA的乙腈（ACN）。分离采用流动相B从2%到90%（v/v）的线性梯度，运行30分钟，随后在2% B条件下再平衡色谱柱10分钟。流速维持在0.5 mL/min，柱温保持60°C。分析在Thermo Dionex Ultimate 3000系统上进行，检测波长为215 nm，数据由Chromeleon软件分析。以Gardasil（Merck，美国）——一种商业化VLP型HPV疫苗——作为定量标准品。所有实验设三次重复。
完整质量分析：纯化的HPV样品（100 μg/mL）经缓冲液交换至适合质谱的溶液（0.1% FA、96.9%水、3% ACN，v/v）。取100 ng样品，使用LC-MS（Agilent 1290 Infinity液相色谱系统和Agilent 6550 iFunnel Q-TOF，配Agilent JetStream，美国）进行完整质量分析。
肽图分析：切取约55 kDa的凝胶条带，用100 mM碳酸氢铵与100%（v/v）乙腈的1:1混合液脱色30分钟，然后在真空浓缩仪中干燥15分钟。凝胶块与胰蛋白酶缓冲液（13 ng/µL胰蛋白酶、10 mM碳酸氢铵、10%（v/v）ACN）在冰上孵育90分钟，随后在37°C过夜酶解。离心后收集上清液用于质谱分析。
HPV VLP透射电镜（TEM）分析
使用浓缩纯化的HPV-VLP样品进行TEM分析。将碳支持膜铜网（200目，Agar Scientific，英国）进行辉光放电处理，取5 µL HPV-VLP样品（1 µg/mL）吸附2分钟。用无菌水洗涤铜网两次以去除多余样品，随后进行负染观察。
【数据】菌株：E. coli DH5α、K. phaffii X-33/GS115/KM71H；质粒：pPICZαB、pGAPZa-STE2–1D4；密码子优化：CAI=0.86，GC=47%；Kozak序列：GAAACG；酶切位点：BstBI/KpnI；线性化酶：ScaI/BspHI；电转化参数：2.5 kV，25 μF，200 Ω，5 ms；zeocin浓度：100–2000 µg/mL；培养温度：28°C；摇瓶转速：200 rpm；微型生物反应器转速：1200 rpm；DO：30%；pH：5.0；甲醇诱导：1%（v/v）/24h；葡萄糖添加：1%（w/v）/24h；培养时间：96h；裂解缓冲液：10 mM磷酸盐、5 mM EDTA、50 mM NaCl、8%甘油、1 mM PMSF，pH 8；珠磨：15轮×50s；SDS-PAGE浓度：10%；一抗稀释度：1:2000；二抗稀释度：1:5000；硫酸铵沉淀：30%（w/v）；GuHCl浓度：8 M；DTT浓度：100 mM；HPLC流速：0.5 mL/min；柱温：60°C；检测波长：215 nm；梯度：2–90% B/30min；TEM样品量：5 µL（1 µg/mL）
研究结果
载体构建与转化子确认
含有HPV16型密码子优化L1基因的DNA片段被插入pPICZB和pGAPZ-STE2–1D4质粒中。通过限制性酶切确认cDNA在载体中的插入。重组质粒首先通过热激法转化大肠杆菌以扩增质粒DNA，然后通过氯化锂法电穿孔转化K. phaffii GS115、X-33和KM71H菌株。
摇瓶与微型生物反应器培养
为筛选HPV16L1产量最高的K. phaffii克隆，使用标准化接种物（OD600 = 1）在摇瓶和微型生物反应器孔中筛选重组菌落。在24、48、72和96小时取样，通过OD600测量监测生长。每个时间点收集10 µL培养样品——摇瓶在200 rpm条件下取样，微型生物反应器在1200 rpm条件下取样——最终96小时样品用于HPV16 L1-VLP产量分析。与预期一致，微型生物反应器中的生物量较摇瓶显著增加（图2a–d）。携带AOX驱动HPV克隆的GS115菌株在96小时培养样品中达到最高OD和干重（DCW），摇瓶中分别为56.32和14.46 mg/mL，微型生物反应器中分别为93.68和24.36 mg/mL（见图S3和图2a–b）。
【数据】接种OD600：1.0；取样时间点：24/48/72/96h；最高OD（摇瓶）：56.32；DCW（摇瓶）：14.46 mg/mL；最高OD（微型生物反应器）：93.68；DCW（微型生物反应器）：24.36 mg/mL；菌株：GS115（AOX启动子）
*K. phaffii*细胞破碎与胞内蛋白提取
K. phaffii细胞破碎裂解条件的优化显著提高了HPV16 L1-VLP的回收率。使用珠磨仪进行15轮50秒的小规模破碎，与较短时间的破碎处理相比，HPV16 L1-VLP释放量增加了约2倍。在优化条件下，细胞破碎效率（CDE）超过80%，表明大部分细胞被有效破碎。细胞破碎效率以破碎细胞占显微镜评估总细胞群的百分比计算。完全破碎（定义为100%破碎）在处理后未观察到完整细胞时确定，并作为计算相对破碎效率的参考值。显微镜分析进一步证实了优化破碎条件的有效性。破碎前，细胞呈完整、轮廓清晰的椭圆形结构；珠磨处理后，可清晰观察到破碎的细胞壁和分散的细胞碎片（图S4）。破碎后，定量总蛋白浓度和HPV16 L1-VLP产量。Bradford法测定的总蛋白浓度达到48.87 mg/L，RP-HPLC定量的HPV16 L1蛋白浓度为20.50 mg/L。这些结果表明，K. phaffii细胞破碎过程的优化有效提高了胞内HPV16 L1-VLP的释放，支持VLP的高效回收以用于下游应用。
【数据】珠磨循环：15轮×50s；VLP释放增加：约2倍；细胞破碎效率：>80%；总蛋白浓度：48.87 mg/L；HPV16 L1浓度：20.50 mg/L
SDS-PAGE和Western blot分析
K. phaffii细胞裂解液的SDS-PAGE分析显示，在约55 kDa处存在HPV 16 L1单体蛋白条带。图3a–c展示了组成型GAP启动子控制下X-33、GS115和KM71H菌株在微型生物反应器中的HPV-VLP生产情况。相比之下，图3d–f展示了诱导型AOX启动子控制下相同菌株在受控条件的微型生物反应器中的HPV-VLP生产情况。摇瓶生产HPV-VLP（图S5）的结果显示，来源于K. phaffii GS115菌株、受诱导型AOX启动子控制的克隆20获得了最高的HPV 16 L1 VLP产量。该高产量克隆经Western blot进一步评估，证实了HPV-VLP的产生，如图3g所示。这些结果凸显了优化条件及GS115菌株在实现HPV 16 L1 VLP高水平表达方面的有效性。
【数据】L1单体分子量：~55 kDa；最高产量克隆：克隆20（GS115菌株，AOX启动子）；表达系统：摇瓶
目标HPV 16L1蛋白的RP-HPLC定量
对硫酸铵沉淀的K. phaffii细胞裂解液进行HPV-VLP的RP-HPLC分析。沉淀重悬于含GuHCl和DTT的缓冲液中以分离单体VLP。使用XBridge BEH300 C4色谱柱和Thermo UHPLC + Dionex Ultimate 3000系统进行表征，以Gardasil作为比较分析的标准品。在诱导型AOX1启动子和组成型GAP启动子控制下含有HPV-VLP基因的克隆之间观察到显著的表达水平差异。在K. phaffii各菌株中，GS115菌株的HPV-VLP产量最高，在微型生物反应器中达20.50 mg/L，而X-33为11.54 mg/L，KM71H为6.49 mg/L；在摇瓶中，产量分别为12.08、3.83和2.85 mg/L（图4）。不同克隆的RP-HPLC分析见图S7。微型生物反应器培养较摇瓶培养产生了更高的HPV-VLP表达，这可能是由于微型生物反应器的受控环境（图4a–d）。RP-HPLC分析还证实，来源于K. phaffii GS115菌株、受诱导型AOX启动子调控的克隆20表现出最高的HPV 16 L1 VLP产量。这种提高的生产力可归因于GS115菌株优越的生长特性，包括更快的生长速率、更高的细胞密度以及对高密度培养需求的更强耐受性。
【数据】GS115产量（微型生物反应器）：20.50 mg/L；X-33产量（微型生物反应器）：11.54 mg/L；KM71H产量（微型生物反应器）：6.49 mg/L；GS115产量（摇瓶）：12.08 mg/L；X-33产量（摇瓶）：3.83 mg/L；KM71H产量（摇瓶）：2.85 mg/L；相对提升：GS115较X-33约1.9倍（原文摘要数据），GS115较KM71H约3.2倍（原文摘要数据）
TEM、完整质量和肽图分析
通过多种分析技术确认了HPV-VLP的结构完整性和组装状态。醋酸铀负染的TEM分析显示，VLPs呈球形、大小均一，形态与天然病毒样颗粒一致（图5a）。ESI-TOF-MS鉴定了L1衣壳蛋白（约55 kDa）（图5b）。通过胶内酶解和质谱进行的互补肽图分析实现了HPV 16L1蛋白91.2%的序列覆盖率，与计算机模拟的HPV-VLP序列匹配（图5c）。这些发现共同验证了HPV-VLP的精确组装和结构完整性，支持其在疫苗和诊断应用中的潜力。
【数据】TEM染色：醋酸铀；L1蛋白分子量：~55 kDa；序列覆盖率：91.2%；VLP形态：球形、均一
讨论与解读
VLP疫苗在传染病预防中具有巨大潜力，但其商业化生产受限于表达系统的复杂性和规模化难题。目前，Gardasil®（HPV疫苗）和Mosquirix™（疟疾疫苗）采用酿酒酵母生产，Cervarix®（HPV疫苗）在昆虫细胞中生产，乙肝疫苗Engerix-B®和Recombivax HB®利用酿酒酵母，戊肝疫苗Hecolin®和Cecolin®在大肠杆菌中生产。近期，上海泽润生物科技有限公司已在K. phaffii中开发了二价HPV疫苗并进入临床前研究。在酵母表达系统中，K. phaffii因具有更好的可放大性、高细胞密度、易于培养和基因组整合能力，以及利用一碳底物生长的特性，正逐渐取代酿酒酵母成为VLP疫苗生产的优选平台。异源蛋白在K. phaffii中的成功表达受启动子选择和宿主遗传背景等生物与过程参数的关键影响。本研究通过系统比较三种菌株和两种启动子的组合，确立了GS115菌株搭配AOX1启动子在微型生物反应器培养条件下的最优组合。
编译者解读
本研究的意义在于将"菌株-启动子-培养方式"三个维度纳入同一比较框架，避免了传统单因素优化容易陷入的局部最优陷阱。BioLector XT微型生物反应器的引入尤其值得关注——它用高通量方式逼近了发酵罐的受控环境，使筛选结果更贴近工业放大的真实需求。GS115/AOX1组合的优势可能与其Mut⁺表型带来的较强甲醇代谢能力有关，但原文未详述该机制的分子证据。一个潜在局限是：本研究聚焦胞内表达，而VLP的下游纯化（裂解、组装、回收）在工业规模上仍是成本瓶颈。后续研究若能在发酵罐规模验证该组合的可放大性，并评估纯化工艺的经济性，将更具转化价值。
参考来源
Rani AK. Vector and strain optimization for enhanced production of HPV-VLPs in Komagataella phaffii. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110386
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110386