来源：Hemoglobin secretion in Pichia pastoris via integration site and expression strength optimization（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
巴斯德毕赤酵母是成熟的真核蛋白表达宿主，但多基因途径整合位点有限、异源蛋白表达受染色质环境及辅因子供应制约，限制了其作为细胞工厂合成复杂蛋白的潜力。本研究系统筛选了21个基因组整合位点及多种启动子与终止子，鉴定出兼顾高表达与低代谢负担的Int D位点及pGCW14、pAOX1等优势调控元件。以赤豆血红蛋白VaHB为模型蛋白，通过多拷贝整合与杂合血红素生物合成途径的代谢工程改造，胞外产量达到188.1 mg/L且无需外源血红素补充，为依赖辅因子的复杂蛋白合成提供了可推广的工程框架。
研究背景
毕赤酵母因具有强诱导型启动子（如AOX1）、高效的蛋白质折叠与分泌途径以及可规模化高密度发酵能力，被广泛应用于医药、食品和工业酶领域。近年来，利用甲醇等可持续原料，将毕赤酵母改造为合成高价值化学品和天然产物的细胞工厂受到关注。与单基因蛋白表达不同，此类化合物的生物合成通常需要多基因途径的协调表达。游离质粒在毕赤酵母中分离稳定性差，尤其当携带多基因时更为明显，因此基因组稳定整合是首选策略。然而，HIS4、AOX1、GAP等传统整合位点数量有限，成为组装复杂代谢途径的瓶颈。此外，异源表达水平受局部染色质环境、基因拷贝数及侧翼调控序列的显著影响，合理选择整合位点与调控元件对构建高效细胞工厂至关重要。
研究方法
2.1 材料、菌株与培养条件
氯化血红素购自源叶生物科技有限公司（S19203，上海），δ-氨基乙酰丙酸（ALA）购自阿拉丁生化科技股份有限公司（A107209，上海）。蛋白表达使用巴斯德毕赤酵母GS115（Invitrogen，北京），其ku70位点已在前期研究中敲除（Lu et al., 2025）。种子培养物接种于1 mL酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（YPD，含20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物），在220 rpm、30°C条件下培养16–24 h，随后转接至缓冲甘油复合培养基（含10 g/L甘油、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L酵母氮碱、4 × 10⁻⁴ g/L生物素、12.8 g/L KH₂PO₄和1.0 g/L K₂HPO₄，pH 6.0）培养24 h，之后每天添加1%甲醇进行诱导（共四次添加）。组成型表达使用YPD培养基培养96 h。大肠杆菌DH5α用于质粒扩增，在LB培养基中于37°C、250 rpm条件下培养。发酵12–16 h后，使用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取质粒。
【数据】菌株：毕赤酵母GS115（ku70敲除）、大肠杆菌DH5α；培养基：YPD、缓冲甘油复合培养基、LB；温度：30°C（酵母）/37°C（大肠杆菌）；转速：220 rpm（酵母）/250 rpm（大肠杆菌）；时间：16–24 h（种子）/24 h（甘油培养）/96 h（组成型表达）；甲醇诱导：1%每日一次共四次；pH 6.0
2.2 质粒构建
为构建表达载体，编码超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP；FPbase ID: B4SOW）和植物来源血红蛋白VaHB（NCBI: XP_017409386.1）的基因经密码子优化并在C端添加六聚组氨酸标签（His-tag），全长基因由生工生物工程股份有限公司合成。值得注意的是，VaHB基因在其N端与α-因子信号肽序列融合，并设计了三种密码子优化版本（VaHB1、VaHB2和VaHB3），具有不同的GC含量，以防止后续组装三拷贝串联表达盒时发生同源重组。合成的片段分别克隆至通用克隆载体pUC19中。为实现多个预定位点的靶向基因组整合，设计了相应的单链引导RNA（sgRNA）序列（表1），并克隆至表达Cas9核酸酶的CRISPR质粒中，实现定点整合。同源臂（800–900 bp）、内源启动子和终止子通过聚合酶链式反应（PCR）从毕赤酵母GS115基因组DNA扩增获得。异源终止子tCYC1从酿酒酵母中扩增。参与血红素生物合成的内源基因（HEM1、HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14、HEM15）通过PCR从GS115基因组DNA扩增（图S1）。其他关键异源血红素合酶基因来源于类球红细菌（HEMA，NCBI RefSeq: WP_119005527.1；HEMY，WP_011840208.1）、金黄色葡萄球菌亚种（HEMH，YP_500460.1）和枯草芽孢杆菌（HEMQ，UniProt ID: P39645）。这些基因序列经密码子优化后由生工生物合成。所有DNA片段，包括合成基因、同源臂、启动子、终止子和筛选标记，均使用ClonExpress多片段重组克隆试剂盒（Vazyme）进行一步法组装，生成最终的表达或整合质粒。详细质粒信息和引物序列见补充表S1和S2。
【数据】同源臂长度：800–900 bp；VaHB密码子优化版本：3种；来源菌株：毕赤酵母GS115、酿酒酵母、类球红细菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；组装方法：ClonExpress一步法
2.3 菌株构建
为系统评估基因组整合位点，构建了组成型pGAP1-sfGFP-tGAP1表达盒。含有靶向Int A至Int U位点（以先前研究中的Int6为对照）（Gao et al., 2022）同源臂的供体片段通过PCR扩增。对于每个位点，将500 ng对应的Cas9-sgRNA质粒和1000 ng供体同源臂片段共同电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中。转化子在添加G418（500 μg/mL）的YPD平板上筛选，获得一组在每个指定基因组位点整合pGAP1-sfGFP-tGAP1表达盒的菌株（所有菌株记录于表S3）。随后进行启动子和终止子筛选。对于启动子评估，携带由不同组成型启动子（p0472、pGCW14、pGAP1、pPDC1、pTEF1、p0065）或甲醇诱导型启动子（pAOX1、pAOX2、pDAS1、pDAS2、pFLD1、pALD6）驱动的sfGFP表达盒（各与tGAP终止子配对）的供体片段，使用相应的Cas9-sgRNA系统整合至Int D位点。对于终止子筛选，含有pGAP启动子与不同终止子（tGAP1、tCYC1、tAOX1、tGCW14、tDAS1、tFLD1）组合的供体片段同样整合至Int D位点，产生具有不同启动子-终止子构型的菌株。基于筛选结果，选择强诱导型启动子（pAOX1、pFLD1、pDAS1）和组成型启动子（p0472、pGCW14、pGAP1），与终止子（tGAP1、tCYC1、tAOX1）组合构建单拷贝VaHB表达盒（VaHB1基因），整合至Int D位点。为提高基因剂量，将相同的VaHB表达盒同时整合至Int D和Int F位点，产生菌株Z3、Y3、Z6和Y6，分别携带三拷贝和六拷贝VaHB表达，受组成型或诱导型调控。对于血红素生物合成途径的模块化组装，采用分步整合策略。首先，将表达盒pAOX1-HEM1-tAOX1、pAOX1-HEMA-tAOX1、pAOX1-HEM1-tAOX1-pAOX1-HEM2-tAOX1或pAOX1-HEMA-tAOX1-pAOX1-HEM2-tAOX1整合至Int I位点，产生菌株1、A、1+2和A+2。随后，将pAOX1-HEM3-tAOX1-pAOX1-HEM4-tAOX1整合至菌株1+2的Int J位点，产生菌株3+4。接着，将pAOX1-HEM12-tAOX1-pAOX1-HEM13-tAOX1或pAOX1-HEM12-tAOX1-pAOX1-HEMY-tAOX1整合至菌株3+4的Int M位点，分别产生菌株12+13和12-Y。最后，将pAOX1-HEM14-tAOX1-pAOX1-HEM15-tAOX1或pAOX1-HEMH-tAOX1-pAOX1-HEMQ-tAOX1整合至12+13和12-Y的Int H位点，产生菌株14+15和H+Q。每个整合步骤均使用位点特异性Cas9-sgRNA质粒，并通过PCR和测序验证，获得一系列血红素途径工程菌株。菌株信息列于表S3。
【数据】电转化用量：Cas9-sgRNA质粒500 ng、供体片段1000 ng；筛选浓度：G418 500 μg/mL；整合位点：Int A–U、Int D、Int F、Int I、Int J、Int M、Int H；拷贝数：1、3、6拷贝
2.4 整合效率测定
为评估所选基因组位点的整合效率，将Cas9-sgRNA表达质粒与其对应的sfGFP供体片段通过电穿孔共转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中。转化子在添加G418（500 μg/mL）的YPD琼脂平板上筛选，于30°C培养3–5天。对于每个整合位点，随机挑取20个独立菌落，接种至1 mL YPD液体培养基中。培养物在30°C、220 rpm振荡培养48 h。培养结束后，测量sfGFP荧光以鉴定荧光阳性菌落。这些荧光阳性菌落随后通过PCR进一步验证，仅两种方法均呈阳性的菌落被视为真正的整合子。每个位点的整合效率随后计算为PCR确认阳性菌落数占筛选总菌落数的百分比。
【数据】筛选菌落数：20个/位点；培养条件：30°C、220 rpm、48 h；筛选浓度：G418 500 μg/mL；验证方法：荧光检测+PCR双重确认
2.5 定量荧光与细胞密度分析
培养48 h后，取400 μL培养物，在室温下以8000 × g离心5 min。细胞沉淀用无菌去离子水洗涤一次，重悬于400 μL水中以标准化光学干扰。重悬样品转移至96孔透明底板中，同时测量荧光和光密度。sfGFP荧光强度使用Varioskan LUX多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific）定量，激发波长488 nm，发射波长510 nm，带宽10 nm。为估算细胞密度，在适当稀释后（通常用水稀释10倍）测量600 nm处的光密度（OD600）。所有荧光值均归一化至OD600以校正细胞密度差异。
【数据】离心条件：8000 × g、5 min、室温；激发波长：488 nm；发射波长：510 nm；带宽：10 nm；稀释倍数：10倍；归一化方法：荧光值/OD600
研究结果
3.1 高效整合基因间区筛选与表征
为鉴定适合高效稳定异源蛋白表达的基因组位点，使用CRISPR/Cas9技术系统筛选了21个预选的基因间区（表1）。首先，通过递送携带不同sgRNA的Cas9质粒，在目标基因间区特定位点引入DNA双链断裂。随后，由pGAP1启动子驱动的sfGFP报告基因和tGAP1终止子组成的标准化表达盒，通过同源重组精确整合至相应基因组位点，该过程由与切割位点侧翼序列同源的上游（HU）和下游同源臂（HD）介导（图1a）。通过测量sfGFP荧光强度评估各整合位点的蛋白表达水平，同时通过PCR和测序验证确定位点特异性整合效率。
结果揭示不同位点间的整合效率存在显著差异（图1b）。具体而言，Int H、I、J、P、Q和S位点表现出极高的整合效率（均>90%），其中Int H、I、J和S位点与对照位点Int6相比具有统计学显著增加（p < 0.01），表明这些区域的同源重组途径高度活跃。相比之下，Int B、C、E、G、L和R位点的整合效率低于10%，暗示这些位点可能位于重组机制难以接近或DNA修复活性较低的基因组区域。就表达水平而言，各整合位点驱动的sfGFP荧光强度也表现出显著异质性（图1c）。值得注意的是，Int U位点产生最强的荧光信号，显著超过先前研究中报道的常用高表达位点Int6（对照）（p < 0.01）（Gao et al., 2022）。然而，这种高表达能力伴随着相对较低的整合效率（<20%）和明显的宿主细胞生长抑制（图1d），表明在该位点整合可能施加了显著的代谢负担或破坏了关键的基因组功能。另一方面，Int D和Int T位点表现出与对照Int6相当的表达水平（p > 0.05），且不对细胞生长产生不利影响。特别是，在Int D位点整合的菌株在发酵过程中的OD600高于大多数其他整合菌株（图1d），表明Int D可能代表一个“中性”位点，在表达强度与细胞适应性之间实现了最佳平衡。此外，Int N位点的整合意外地导致OD600较对照显著增加（p < 0.01），暗示破坏该基因间区可能无意中激活了对细胞生长或代谢有益的途径，其具体机制值得进一步研究。
为探索潜在的基因组决定因素，分析了每个整合位点最近必需基因及其距离（表1）。然而，整合效率和表达强度均与这些基因组特征无明确相关性，表明可能有其他因素决定这些位点的功能结果。研究结果强调，基因组整合位点的选择从根本上决定了工程菌株中重组蛋白的表达水平和整合效率。观察到的性能异质性似乎与若干基因组和生理决定因素相关。表现出最优特征的位点（如Int D和Int T）可能位于可及的染色质结构域内，有利于转录机器结合和重组复合物活性。此外，与高活性转录单元的邻近可能赋予有利的表观遗传环境，增强异源表达。然而，表达强度必须与细胞代谢能力相平衡，如Int U所示——最大表达伴随生长受损和整合频率降低，这是资源分配冲突的表现。值得注意的是，还观察到位点特异性多效性效应；Int N的整合意外增强了生长动力学，暗示对邻近代谢途径可能存在顺式调控影响。这些结果共同表明，理想的整合位点必须满足多重标准：染色质可及性、转录容许性和最小代谢干扰。
【数据】整合效率>90%的位点：Int H、I、J、P、Q、S；整合效率<10%的位点：Int B、C、E、G、L、R；Int U荧光最强（p<0.01 vs Int6）；Int U整合效率<20%；Int D和Int T表达与Int6相当（p>0.05）；Int N的OD600显著增加（p<0.01）
3.2 启动子与终止子表征
为进一步评估遗传调控元件对蛋白表达的影响，以sfGFP荧光强度为输出，系统筛选了六个诱导型启动子（pAOX1、pAOX2、pDAS1、pDAS2、pFLD1、pALD6）、六个组成型启动子（p0472、pGCW14、pGAP1、pPDC1、pTEF1、p0065）和六个终止子（tGAP1、tCYC1、tAOX1、tGCW14、tDAS1、tFLD1）（图2a–e）。在诱导型启动子中，pAOX1表现出最强活性，其次是pDAS1和pFLD1（图2a）。对于大多数菌株，OD600未观察到显著差异（p > 0.05）；然而，携带pFLD1的菌株与对照相比显示出统计学显著差异（p < 0.01）（图2b）。在组成型启动子组中，pGCW14产生最高表达，超过pGAP1和p0472（图2c），同样，这些启动子均未显著影响细胞生长（p > 0.05）（图2d）。对于终止子，tGAP1、tCYC1和tAOX1支持最高的sfGFP强度，所有测试终止子变体间的细胞密度保持相当（p > 0.05）（图2e）。
这一系统表征揭示了诱导型和组成型启动子家族及终止子间不同的性能层级。pAOX1的优越活性与其作为酵母表达系统中强效、严格调控启动子的既定角色一致，而pGCW14的强组成型活性表明其作为常用启动子（如pGAP1）的宝贵替代品具有潜力。值得注意的是，所有测试元件对生长的影响极小，表明在测试水平下，这些调控元件的表达在实验条件下未施加显著的代谢负担。终止子性能的显著差异进一步强调了它们的功能非等价性，可能归因于mRNA稳定性、3′端加工效率或转录通读抑制的差异。这些结果共同为启动子和终止子选择提供了定量、情境特异性的资源，使后续代谢工程工作中异源表达更加可预测和优化。
【数据】诱导型启动子活性排序：pAOX1 > pDAS1 > pFLD1；组成型启动子活性排序：pGCW14 > pGAP1 > p0472；最强终止子：tGAP1、tCYC1、tAOX1；pFLD1菌株OD600与对照差异p<0.01；其余启动子/终止子对生长影响p>0.05
3.3 重组VaHB生产用表达盒筛选与评估
为鉴定异源生产血红蛋白VaHB的最优调控元件，构建了一系列具有组成型（如pGAP）或诱导型（如pAOX1）启动子的表达盒，如图3a所示。这些表达盒随后整合至毕赤酵母基因组中。发酵分析揭示了表达水平的显著差异（图3c）。最高的VaHB胞外产量为33.1 mg/L，由pGCW14启动子系统实现。常规强醇氧化酶启动子pAOX1以27.9 mg/L的产量位居第二。值得注意的是，所有其他测试启动子……
【数据】最高VaHB胞外产量：33.1 mg/L（pGCW14启动子）；第二高：27.9 mg/L（pAOX1启动子）
讨论与解读
本研究建立了在毕赤酵母中系统构建高效异源蛋白合成细胞工厂的策略。首先筛选并鉴定了具有高表达和低代谢负担的基因组整合位点（如Int D）。随后通过对多种调控元件的系统评估，确定pGCW14和pAOX1分别为组成型和诱导型表达的最优启动子。在此基础上，以血红蛋白VaHB为模型蛋白，证明将多拷贝基因组整合与血红素生物合成途径的代谢工程相结合——特别是引入细菌来源的HEMY、HEMH和HEMQ基因——可显著提升VaHB产量至188.1 mg/L，且无需外源血红素补充。该研究为毕赤酵母中复杂异源蛋白（特别是依赖辅因子的蛋白）的理性设计与高水平表达提供了系统性解决方案和技术平台。
编译者解读：该研究最值得借鉴之处在于将“在哪里表达”与“用什么表达”两个基础问题做了系统量化——Int D位点的筛选逻辑（高表达且不影响生长）和pGCW14启动子的发现，为后续多拷贝整合提供了可复用的标准化底盘元件。针对血红素这类辅因子依赖蛋白，作者巧妙采用毕赤酵母内源途径与细菌异源基因（HEMY、HEMH、HEMQ）的杂合组装策略，绕开了外源血红素添加的成本瓶颈。不足之处在于Int U这类超高表达位点的代谢负担机制尚未阐明，位点选择仍依赖经验筛选而非序列特征预测。未来若能将染色质可及性与表达效率的关联规律解析清楚，将进一步提升该平台的理性设计能力。
参考来源
Lu, Z. (2026). Hemoglobin secretion in Pichia pastoris via integration site and expression strength optimization. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109303
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109303