来源：De novo biosynthesis of 3′-sialyllactosamine in Escherichia coli via integrated metabolic and protein engineering（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人乳寡糖（HMOs）中的唾液酸化成员在婴幼儿肠道健康中扮演关键角色，而3′-唾液酸乳糖胺（3′-SLN）作为唾液酸路易斯X的前体，其微生物高效合成长期未被充分开发。本研究在大肠杆菌BL21(DE3)中系统整合了LacNAc合成模块、CMP-Neu5Ac供给模块与末端α2,3-唾液酸化模块，通过AlphaFold指导的饱和突变获得优良唾液酸转移酶变体BtM2，并借助CRISPR-Cpf1实现多拷贝染色体整合与辅因子工程，最终在5-L补料分批发酵中达到14.23 g/L的3′-SLN产量。
研究背景
人乳寡糖是母乳中仅次于乳糖（55–70 g/L）和脂质（16–39 g/L）的第三大固体组分。虽不直接供能，HMOs通过调节肠道菌群组成、阻断病原体黏附、支持免疫系统成熟发挥关键生物学功能。目前已鉴定超过200种结构各异的HMOs，均由五种单糖单元衍生而来。其中，唾液酸化乳寡糖（SMOs）——包括3′-SL、6′-SL、3′-SLN和6′-SLN——能优先刺激有益双歧杆菌增殖，并作为可溶性聚糖模拟物拦截病原-宿主互作。3′-SLN（Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAc）在天然来源中含量极低，牛乳中仅约50 mg/kg，但其结构上与3′-SL的差异赋予其独特的生物学功能。微生物合成HMOs虽已引起广泛关注，3′-SLN的高效从头生物合成却鲜有系统研究。
研究方法
菌株、培养条件与质粒
本研究所用全部微生物菌株列于原文表2。质粒构建策略、培养基配方及确定培养条件均参照先前报道的方法（Luo et al., 2025）。引物与质粒详细信息见原文表S1和S2。摇瓶规模生产3′-SLN时，工程菌株在4 mL含适宜抗生素的LB培养基中、37°C振荡培养。当600 nm光密度（OD600）达到约0.8时，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG，0.5 mM）诱导异源基因表达。随后培养温度降至30°C，继续孵育48小时再进行检测。
【数据】培养基：LB；温度：37°C→30°C；诱导剂：IPTG 0.5 mM；时间：48h；接种量：4 mL
基因组操作
基因组编辑基于pEcCpf1/pcrEG平台的CRISPR-Cpf1（Cas12a）系统，操作流程参照既有方法并稍作修改（Qian et al., 2025; Zhu et al., 2022）。简要流程如下：首先通过化学转化将pEcCpf1质粒导入宿主菌株。转化子在LB培养基中生长，加入阿拉伯糖诱导λ-Red重组系统表达。诱导2小时后收集细胞，用甘油洗涤并制备电转感受态。针对目标基因组位点（如manZ）的修饰，通过反向PCR构建pcrEG质粒以表达靶向该位点的crRNA。同源修复模板通常包含约500 bp上下游侧翼序列及目标插入或删除片段（如neuBCA操纵子），通过重叠延伸PCR组装。将pcrEG质粒与相应修复片段共电转入诱导的感受态细胞。恢复培养后，涂布于含卡那霉素和壮观霉素的LB琼脂平板，37°C培养。正确编辑的菌落通过菌落PCR鉴定并经Sanger测序确认。最后消除质粒获得无标记的基因组编辑菌株。
【数据】编辑系统：CRISPR-Cpf1；同源臂：约500 bp；抗生素：卡那霉素+壮观霉素；温度：37°C；诱导剂：阿拉伯糖；诱导时间：2h
补料分批发酵
工程菌株ESLN15的单菌落划线于LB琼脂平板，随后接种至200 mL LB培养基的摇瓶中。摇瓶培养时，工程菌株在37°C、200 rpm振荡培养至OD600约1.8。所得种子培养物以10%（v/v）接种量直接接种至含1.8 L确定培养基的5-L生物反应器，无需额外预处理，即可支持稳健的细胞生长和生产性能。确定培养基含30 g/L甘油、10 g/L酵母提取物、6.67 g/L KH2PO4、4 g/L (NH4)2SO4、3.55 g/L柠檬酸、2.5 g/L MgSO4·7H2O、4.5 mg/L硫胺素及10 mL/L微量元素溶液。发酵在37°C下进行至OD600约20。此时培养温度降至30°C，加入0.1 mM IPTG诱导蛋白表达。当残余甘油浓度降至5 g/L以下时启动甘油补料。整个发酵过程中溶氧（DO）维持在约30%，通过动态调节搅拌转速与通气量实现——具体而言，随细胞生长需氧量上升相应提高搅拌转速以维持稳定DO。培养pH通过自动添加氢氧化铵控制在6.7。
【数据】发酵罐：5-L；工作体积：1.8 L；接种量：10%（v/v）；培养基成分：甘油30 g/L、酵母提取物10 g/L、KH2PO4 6.67 g/L、(NH4)2SO4 4 g/L、柠檬酸3.55 g/L、MgSO4·7H2O 2.5 g/L、硫胺素4.5 mg/L、微量元素液10 mL/L；温度：37°C→30°C；IPTG：0.1 mM；DO：约30%；pH：6.7；转速：200 rpm（摇瓶）
分析方法
细胞生长通过分光光度计测定OD600监测，干细胞重量按每OD600单位0.35 g/L的换算系数估算。GlcNAc和甘油浓度采用配备Rezex ROA-Organic Acid H+色谱柱的高效液相色谱（HPLC）在60°C下测定。Neu5Ac、LacNAc和3′-SLN使用配备Zorbax NH2色谱柱（Agilent）的Waters HPLC系统定量。流动相为50%（v/v）乙腈，添加2 mM MgCl2和10 mM H3PO4，流速0.8 mL/min，柱温35°C，方法同前所述（Luo et al., 2026）。
【数据】HPLC柱：Rezex ROA-Organic Acid H+（60°C）、Zorbax NH2（35°C）；流动相：50%乙腈+2 mM MgCl2+10 mM H3PO4；流速：0.8 mL/min；OD600→DCW换算：0.35 g/L/OD
研究结果
工程大肠杆菌BL21(DE3)中3′-SLN从头生物合成途径的组装
以先前开发的大肠杆菌菌株作为构建3′-SLN生产菌株的底盘。由于LacNAc是α2,3-唾液酸化的直接受体底物，稳定高效的LacNAc生物合成是下游3′-SLN生产的前提。在前期工作中，通过敲除lacZ、nagB、nagA、ldhA和nanE，并在染色体上整合单拷贝的glmS*（来自大肠杆菌BL21(DE3)的葡萄糖胺-6-磷酸合酶）、GNA1（来自酿酒酵母S288C的葡萄糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶）和yqaB（来自肠杆菌科的果糖-1-磷酸磷酸酶），对大肠杆菌BL21(DE3)进行了代谢工程改造，实现了稳健的LacNAc生物合成（Luo et al., 2025）。
3′-SLN的从头生物合成途径始于甘油和葡萄糖经糖酵解生成果糖-6-磷酸（Fru-6-P）。Fru-6-P由glmS转化为葡萄糖胺-6-磷酸（GlcN-6-P），后者作为通向Neu5Ac合成的代谢分支点。文献报道了将GlcN-6-P转化为N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）的三条不同途径：neuC途径、nanE途径和AGE途径（Zhang et al., 2021）。neuC途径是最早报道的路线，需要表达外源neuC基因，并依赖内源glmM和glmU活性生成UDP-GlcNAc，随后转化为ManNAc。值得注意的是，该途径不需要GNA1表达。相比之下，nanE和AGE途径都需要GNA1催化GlcN-6-P乙酰化为GlcNAc-6-P，再经额外酶促步骤生成ManNAc（Ma et al., 2025）。尽管上游反应不同，三条途径均汇聚于ManNAc这一Neu5Ac生物合成的共同中间体。ManNAc随后由Neu5Ac合酶（neuB）与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）缩合生成Neu5Ac（图1A）。Neu5Ac再经CMP-Neu5Ac合成酶（neuA）活化生成CMP-Neu5Ac——即唾液酸转移酶的直接供体底物。CMP-Neu5Ac本身不稳定，容易被Btα2,3SiaT利用，将唾液酸部分转移至LacNAc形成3′-SLN（Luo et al., 2026）。重要的是，nanA编码的N-乙酰神经氨酸裂解酶催化可逆反应，将Neu5Ac降解为ManNAc和丙酮酸，形成限制CMP-Neu5Ac积累的无效代谢循环。因此，敲除nanA对防止Neu5Ac降解、增强流向唾液酸化的通量至关重要。
在三条Neu5Ac生物合成途径中，neuC途径在唾液酸化HMOs（包括3′-SL、6′-SL、LST-c和LST-a）的生产中得到了最广泛的优化（Liu et al., 2025b; Sheng et al., 2025）。相比之下，nanE途径（GlcNAc-6-P→ManNAc-6-P→ManNAc→Neu5Ac）的探索较少，而直接从GlcNAc起始的AGE途径在枯草芽孢杆菌中显示出潜力。例如，Zhang等（2021）在枯草芽孢杆菌中系统比较了AGE、neuC和nanE途径，分别获得3.94、5.67和0.19 g/L的Neu5Ac产量，凸显了neuC途径的优越效率。
以ELNA菌株为起点，进一步微调代谢网络以实现3′-SLN的从头生物合成。对neuC和AGE两条途径均进行了评估。将neuBCA基因簇整合至染色体以增强CMP-Neu5Ac合成。菌株EL1作为构建基于neuC的3′-SLN生产菌株的亲本菌株。将六个额外途径基因——来自空肠弯曲杆菌的neuB、neuC和neuA，来自大肠杆菌BL21(DE3)的glmM和glmU，以及来自Bibersteinia trehalosi的Btα2,3SiaT——组装至pETDuet-1载体，生成pET-BCAmuBt（图1B）。对于AGE途径，引入来自Anabaena sp. CCY 9910（GenBank: WP_414754157.1）的AGE，构建质粒pET-BCAmuBtage，对应菌株ESLN2。由于大肠杆菌BL21(DE3)本身具有内源glmM和glmU，这些构建体的主要区别在于是否通过质粒表达进一步强化前体合成。然而，过度增强CMP-Neu5Ac合成被发现与LacNAc形成存在竞争。摇瓶发酵（图1C）显示ESLN1和ESLN2产生了相当的3′-SLN产量（约0.7 g/L）。值得注意的是，未进行AGE途径强化的ESLN1表现出显著高于ESLN2的LacNAc积累（ESLN1为5.58 g/L，ESLN2为3.87 g/L）。ESLN1表现出与ESLN2相当的生物量但显著更高的LacNAc积累，表明其代谢通量更高效地流向产物形成。相反，在ESLN2中引入AGE途径可能施加了额外的代谢负担并破坏了通量平衡。此外，AGE途径将共同前体GlcNAc分流至Neu5Ac生物合成，从而减少了用于LacNAc形成的底物可用性。这种双重效应可能同时限制了细胞性能和前体积累。因此，选择neuC途径作为在工程大肠杆菌BL21(DE3)中构建3′-SLN从头生物合成途径的最佳路线。
【数据】3′-SLN产量（ESLN1/ESLN2）：约0.7 g/L；LacNAc积累：ESLN1为5.58 g/L，ESLN2为3.87 g/L；Neu5Ac产量对比（枯草芽孢杆菌中）：AGE途径3.94 g/L、neuC途径5.67 g/L、nanE途径0.19 g/L；敲除基因：lacZ、nagB、nagA、ldhA、nanE、nanA
通过丙氨酸扫描结构引导鉴定Btα2,3SiaT关键残基
为引导Btα2,3SiaT的理性工程改造，使用AlphaFold 3预测其三维结构。将建模的酶结构连同辅因子CMP-Neu5Ac和受体底物LacNAc一起，使用AutoDock Tools进行分子对接。鉴于直接参与底物结合和催化的活性位点残基通常是决定酶性能的关键因素，结合口袋内的残基被视为工程改造的优选靶点。对接分析显示，Btα2,3SiaT容纳体积较大的LacNAc底物时空间余量有限，提示受体结合口袋内的空间位阻可能限制催化效率。共鉴定出十个氨基酸残基——D132、N101、H104、R47、K71、Y18、F103、F261、N262和N305——位于LacNAc或CMP-Neu5Ac的4 Å范围内（图2A）。这些残基主要位于柔性环区或α-螺旋与β-折叠的界面，包括loop101–103和loop301–307，这些区域通常与底物识别和构象动态相关。
采用丙氨酸扫描突变系统评估各残基的贡献，因为丙氨酸替换去除了侧链相互作用同时将结构扰动降至最低，是鉴定参与催化和底物结合残基的常用策略（Gang Son et al., 2026）。为评估这些残基的功能重要性，基于质粒pETDuet-BCAmuBt使用QuikChange方法构建了初始单位点丙氨酸扫描突变文库。所得质粒分别转化至菌株EL2，生成一系列工程菌株，包括EL2-D132A、EL2-N101A、EL2-H104A、EL2-R47A、EL2-K71A、EL2-Y18A、EL2-F103A、EL2-F261A、EL2-N262A和EL2-N305A（原文表2）。如图2B所示，EL2-D132A和EL2-N262A在上清液中检测不到3′-SLN产生，表明这些残基对维持催化活性或结构完整性至关重要。这一观察与同源α2,3-唾液酸转移酶的机制见解一致。在来自多杀性巴氏杆菌（PmST1）的充分表征酶中，保守残基Asp141已被鉴定为关键催化残基，作为通用碱激活受体羟基（Ni et al., 2007）。该位置的突变（D141A或D141N）导致酶活性完全丧失。基于结构比对（图S1），Btα2,3SiaT中的D132占据对应位置，提示类似的催化作用。D132A突变体观察到的活性丧失因此支持其关键性。
【数据】丙氨酸扫描位点：D132、N101、H104、R47、K71、Y18、F103、F261、N262、N305；筛选距离：4 Å；完全失活突变：D132A、N262A
有益突变体组合与动力学特征
（基于图3所示结果）将有益突变进行组合，评估其对3′-SLN生产的协同效应。以对照菌株EL2-101C/103Y为基准，通过单因素方差分析（one-way ANOVA）评估统计显著性（p < 0.001, p < 0.01, p < 0.05）（图3A）。同时，对野生型（WT）与突变体的均方根波动（RMSF）谱进行了分析（图3B），以揭示突变对酶构象动态的影响。
【数据】统计方法：one-way ANOVA；显著性水平：p < 0.001、p < 0.01、p < 0.05；对照菌株：EL2-101C/103Y
多拷贝染色体整合与基因组工程
通过将neuBCA、BtM2、neuBCA和cmK整合至manZ、ilvG、xylB和caiB位点，在J23119启动子控制下进行基因组工程（图4A）。对携带整合构建体的工程大肠杆菌菌株发酵后，测定培养上清液中残余3′-SLN浓度（图4B）。
【数据】整合位点：manZ、ilvG、xylB、caiB；整合基因：neuBCA、BtM2、cmK；启动子：J23119
5-L生物反应器补料分批发酵
工程菌株ESLN15在5-L生物反应器中进行补料分批培养，实现了3′-SLN的生物合成。图5展示了甘油、GlcNAc、LacNAc、Neu5Ac和3′-SLN的浓度曲线以及细胞生长（OD600）曲线。IPTG添加时间以黑色箭头标示。
【数据】发酵规模：5-L；产物：3′-SLN；监测指标：甘油、GlcNAc、LacNAc、Neu5Ac、3′-SLN浓度及OD600
（原文图6未提供图注，在此插入对应占位）
讨论与解读
本研究通过代谢途径构建、酶工程和基因组水平优化的系统整合，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功建立了3′-SLN的从头生物合成平台。关键α2,3-唾液酸转移酶的鉴定与结构引导优化显著提升了末端唾液酸化步骤的效率，而途径基因的多拷贝染色体整合与辅因子工程进一步改善了流向3′-SLN的代谢通量。工程菌株在补料分批发酵中实现了高水平的3′-SLN生产，验证了规模化微生物合成的可行性。该工作为获取结构明确的唾液酸化HMOs提供了有效策略，也为复杂糖分子的生物合成提供了有价值的见解。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"酶工程+代谢工程"双轮驱动的典型范例——AlphaFold 3预测与丙氨酸扫描的结合使关键酶的改造不再依赖盲目随机突变，而CRISPR-Cpf1多拷贝整合策略则有效解决了途径基因表达稳定性与拷贝数的平衡问题。值得注意的是，研究者在neuC与AGE途径的比较中明确指出了前体竞争这一代谢工程中的普遍矛盾，这种"选择最优路线而非堆砌全部基因"的设计思路值得借鉴。14.23 g/L的产量对于结构复杂的唾液酸化三糖而言已达较高水平，但3′-SLN的下游纯化工艺与规模化经济性评估原文未详述，或为后续产业化研究的重点方向。
参考来源
Luo, G. (2026). De novo biosynthesis of 3′-sialyllactosamine in Escherichia coli via integrated metabolic and protein engineering. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134665
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134665