来源：The influence of fermentation process optimization of Bacillus subtilis 1-F-2 on the quality, flavor, and sensory properties of cigar tobacco leaves based on response surface methodology（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
雪茄烟叶发酵是决定其最终品质的关键工序。本研究从烟叶中分离鉴定了一株产香枯草芽孢杆菌1-F-2，通过单因素实验结合响应面法优化其发酵参数，系统考察了接种发酵对烟叶理化性质、挥发性风味化合物及感官品质的影响。优化条件为36°C、接种量2×10⁷ CFU/g、发酵22天。与未接种对照组相比，接种发酵使总挥发性风味化合物含量提升74.51%，新增苯乙酮等关键香气贡献物，感官评价显示香气复杂性、烟气柔和度及余味均显著改善。
研究背景
发酵是调控晾制雪茄烟叶品质的关键环节，通过诱发化学与生理变化，最终改善其抽吸特性和雪茄制造适用性。传统自然发酵依赖烟叶表面固有微生物群落的演替来产生和积累挥发性风味化合物，但周期长、结果不稳定。为对发酵过程实施更精准的控制，研究者尝试引入特定菌株——例如接种产芽孢杆菌可提升微生物多样性、加速发酵速率并促进芽孢杆菌属和棒状杆菌属等有益菌群的优势地位，从而改善挥发性风味化合物组成。更进一步的定向发酵策略则通过主动管理温度、湿度和微生物群落，快速降解淀粉和生物碱等物质，实现品质的显著提升。芽孢杆菌属作为雪茄烟叶上多种发酵和醇化条件下的优势微生物类群，因其强大的分泌胞外酶能力和环境耐受性，成为定向发酵菌种筛选的重要来源。
研究方法
样品采集
供试雪茄烟叶采自山东省沂水县QX103品种，收获于2024年。晾制后烟叶分类为中部叶位，等级II。
菌株特性
菌株分离与鉴定
采用平板划线法将菌株接种于LB琼脂培养基，37°C培养2天。挑选生长旺盛、形态明显的单菌落，经连续两次传代纯化。本研究所用菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 35346。分子鉴定方面，通过PCR扩增16S rDNA并测序，使用MEGA软件以最大似然法进行系统发育分析。PCR扩增条件为：94°C初始变性4 min；30个循环（94°C变性30 s，61°C退火30 s，72°C延伸2 min）；最后72°C终延伸7 min。所用引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT−3′）。扩增产物送青岛蔚蓝生物科技有限公司测序，所得序列经生物信息学软件分析并构建系统发育树。
【数据】培养基：LB琼脂；培养温度：37°C；培养时间：2天；PCR引物：27F/1492R；变性温度：94°C；退火温度：61°C；延伸温度：72°C；循环数：30
种子液制备
用接种环挑取单菌落接种于液体培养基中，37°C、160 rpm振荡培养36 h。随后将菌悬液于4°C、4000 rpm离心10 min，弃上清，沉淀用等体积无菌水重悬即得种子液，保存备用。
【数据】培养温度：37°C；转速：160 rpm；时间：36 h；离心：4000 rpm、4°C、10 min
生长特性与接种液标准化
首先评估B. subtilis 1-F-2的生长特性。挑取单菌落接种LB液体培养基，37°C、180 rpm振荡培养。每隔6小时测定600 nm处光密度（OD₆₀₀），持续48 h绘制生长曲线。为确定温度耐受范围，将菌株接种于LB液体培养基中，分别在20°C至55°C（以5°C递增）范围内、180 rpm振荡培养36 h，以无菌培养基为空白对照测定最终OD₆₀₀。随后制备标准化发酵接种液：挑取单菌落于LB液体培养基中，37°C、160 rpm培养36 h；菌体经4°C、4000 × g离心10 min收集，沉淀洗涤后用无菌水重悬。测定种子液OD₆₀₀，利用预先建立的OD₆₀₀与平板计数之间的标准曲线确定活菌浓度（CFU/mL）。该浓缩菌悬液再用无菌水梯度稀释至精确的目标接种密度，以每克烟叶的菌落形成单位（CFU/g）表示。
【数据】生长曲线监测：OD₆₀₀、6 h间隔、48 h；温度范围：20–55°C（5°C梯度）；培养转速：180 rpm；种子液培养：37°C、160 rpm、36 h；离心：4000 × g、4°C、10 min
单因素发酵实验
烟叶初始含水量通过烘箱干燥法测定，以计算所需无菌水体积。完整烟叶喷洒无菌水调节至最终含水量20%。对照组仅喷洒无菌水（CK）。接种处理组中，菌悬液通过离心收集起始培养物菌体并用无菌水重悬制备，按烟叶重量10%（v/w）均匀喷洒，实现2×10⁵至2×10⁸ CFU/g的目标接种浓度。所有处理（含对照）设三次重复（生物学重复），烟叶密封于无菌袋中进行发酵。采用单因素轮换法考察发酵时间（7–35天）、接种浓度（上述设定范围）和发酵温度（25°C至45°C）的影响。发酵结束后，各重复烟叶于60°C烘干至恒重，研磨成细粉并过0.38 mm筛。所得均匀粉末作为一个分析样品，取子样品用于后续化学成分分析和挥发性风味化合物提取。所有样品于−20°C保存。
【数据】烟叶含水量：20%；接种体积：10%（v/w）；接种浓度范围：2×10⁵–2×10⁸ CFU/g；发酵时间范围：7–35天；温度范围：25–45°C；干燥条件：60°C至恒重；筛网孔径：0.38 mm；保存温度：−20°C
响应面法优化
单因素实验后，采用响应面法优化B. subtilis 1-F-2接种发酵雪茄烟叶的参数。实施中心复合设计，考察三个关键变量（接种浓度、发酵温度和发酵时间），各设三个水平，以挥发性风味化合物含量为响应值建模。编码水平及十七组实验方案见表S1。随后在RSM模型确定的最优条件下进行验证发酵：36°C、60%相对湿度、21天。
【数据】RSM设计：中心复合设计；变量数：3；水平数：3；实验组数：17；验证条件：36°C、60% RH、21天
烟叶化学成分测定
烟叶中钾、氯、总氮、烟碱、总糖和还原糖含量分别按以下中国行业标准测定：YC/T 217–2007、YC/T 162–2011、YC/T 161–2002、YC/T 468–2013和YC/T 159–2002。每个测定使用0.5 g样品，所有测量采用三次生物学重复。
【数据】样品用量：0.5 g；生物学重复：3；测定标准：YC/T 217–2007、YC/T 162–2011、YC/T 161–2002、YC/T 468–2013、YC/T 159–2002
挥发性风味化合物测定
HS-SPME-GC-MS分析
挥发性风味化合物采用Agilent 7890B气相色谱仪联用5977A质谱检测器（美国安捷伦科技）分析。取1.0 g样品和2 μL内标（苯乙酸苯乙酯，100 μg/mL甲醇溶液）置于20 mL顶空瓶中。样品瓶在60°C、500 rpm搅拌下平衡30 min。随后用50 μm DVB纤维头（美国Supelco）进行顶空固相微萃取（HS-SPME）25 min。萃取完成后，纤维头在GC进样口240°C解吸10 min。色谱分离在DB-WAX毛细管柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm；安捷伦科技）上进行，不分流进样，进样口温度240°C，氦气为载气，恒定流速1.0 mL/min。柱温箱程序：初始40°C保持3 min；以2°C/min升至120°C保持1 min；再以6°C/min升至240°C保持2 min。传输线温度维持在240°C。质谱检测采用电子轰击（EI）模式，离子源温度230°C，电子能量70 eV，质量扫描范围m/z 35–550。所有分析设三次独立生物学重复。
【数据】样品量：1.0 g；内标：苯乙酸苯乙酯2 μL（100 μg/mL）；平衡：60°C、500 rpm、30 min；萃取：50 μm DVB纤维、25 min；解吸：240°C、10 min；色谱柱：DB-WAX（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）；载气流速：1.0 mL/min；升温程序：40°C（3 min）→2°C/min至120°C（1 min）→6°C/min至240°C（2 min）；离子源温度：230°C；电子能量：70 eV；扫描范围：m/z 35–550
挥发性风味化合物定性与定量
挥发性风味化合物通过将质谱图与NIST 20谱库比对（最低匹配相似度80%），并比较计算所得Kovats保留指数（RI）与文献报道值进行鉴定。RI使用C8–C19正构烷烃同系物标准品（100 μg/mL）计算。定量采用内标法，内标为苯乙酸苯乙酯（100 μg/mL）。RI计算公式为：RI = 100b + (ta − tb)/(tb+1 − tb) × 100；定量公式为：Mi = Ni/Nx × Mx。其中ta、tb和tb+1分别代表待测组分保留时间（min）、前一正构烷烃保留时间和后一正构烷烃保留时间（min），且b + 1 > a > b；Mi为待测组分浓度；Nx、Ni和Mx分别代表苯乙酸苯乙酯峰面积、苯乙酸苯乙酯浓度和待测组分峰面积。
【数据】质谱库：NIST 20；匹配阈值：≥80%；内标浓度：100 μg/mL；正构烷烃范围：C8–C19
相对气味活度值
通过计算相对气味活度值（ROAV）确定对整体挥发性风味化合物有主要贡献的关键香气化合物。
图片占位
图1 | 产香菌株B. subtilis 1-F-2的生理学与系统发育特征。(A) LB琼脂上的菌落形态；(B) 光学显微镜下的细胞形态；(C) 1-F-2的生长曲线；(D) 基于16S rRNA基因序列的系统发育树；(E) 温度耐受性
研究结果
菌株特性分析
菌株鉴定结果
分离菌株1-F-2形成的菌落不透明、乳白色，呈椭圆形至不规则形，边缘整齐，中心微凸（图1A和图1B）。基因组DNA提取后，用通用引物PCR扩增16S rDNA基因。测序及NCBI数据库BLAST分析显示，所得16S rDNA序列与多株枯草芽孢杆菌具有100%一致性。为进一步确认系统发育位置，使用MEGA11软件以BLAST获得的相近序列构建最大似然（ML）系统发育树。树图显示菌株1-F-2与枯草芽孢杆菌参考菌株聚于同一分支（图1D）。综合形态学特征和16S rDNA序列分析，该菌株被确认为枯草芽孢杆菌。
【数据】16S rDNA同源性：与多株B. subtilis 100%一致
生长曲线与温度耐受性分析
B. subtilis 1-F-2的生长曲线如图1C所示。菌株在0至18 h处于迟滞期，18至36 h进入对数期，此后进入稳定期，OD₆₀₀稳定在约0.85。这一典型生长模式反映了细菌在给定培养条件下的适应与增殖过程，符合经典微生物生长动力学。温度实验（图1E）显示，20°C至35°C之间生长速率呈指数上升，40°C以上受到抑制。最大OD₆₀₀值在35°C时达到0.881 ± 0.023，显著高于其他温度，确定35°C为最适生长温度。B. subtilis 1-F-2在25°C至50°C的宽温度范围内均表现出生长活性。值得注意的是，其在30°C至40°C之间保持旺盛生长（OD₆₀₀ > 0.6）。然而，50°C时生长减弱（OD₆₀₀ = 0.518 ± 0.029），20°C和55°C时生长基本停止。上述结果确定其功能生长范围为25°C至50°C。跨越25°C的生长能力凸显了该菌株显著的热适应性，这可能有利于其在波动环境或多种生物技术应用中的存活与功能发挥。因此，选择涵盖最适温度的范围（25°C至50°C）用于后续单因素发酵实验。
【数据】最适生长温度：35°C（OD₆₀₀ = 0.881 ± 0.023）；迟滞期：0–18 h；对数期：18–36 h；稳定期OD₆₀₀：约0.85；50°C时OD₆₀₀ = 0.518 ± 0.029；生长温度范围：25–50°C
图2 | 不同发酵参数对雪茄烟叶挥发性风味化合物的影响。(A) 不同发酵温度下挥发性风味化合物的种类；(B) 不同发酵温度下挥发性风味化合物含量；(C) 不同接种浓度下挥发性风味化合物的种类；(D) 不同接种浓度下挥发性风味化合物含量
单因素发酵实验分析
发酵温度的影响
在接种浓度和发酵时间分别固定为2×10⁷ CFU/g和21天的条件下考察发酵温度的影响。该过程表现出明显的温度依赖性（图2A和图2B）。随着温度从25°C升至35°C，挥发性风味化合物的多样性和总含量先增加，在35°C达到峰值。在此最适温度下，关键挥发性风味化合物的积累达到最大，与此前实验中确定的菌株35°C最适生长温度一致。35°C下代谢产物的增强归因于微生物生长和活性的峰值，促进了香气前体物质的水解和转化。相反，35°C以上的温度抑制了生长和代谢活性，使挥发性风味化合物含量降低。因此，选择30°C至40°C范围进行进一步优化。
【数据】固定条件：2×10⁷ CFU/g、21天；最适发酵温度：35°C；优化温度范围：30–40°C
接种浓度的影响
在固定发酵条件（40°C、21天）下，接种浓度显著影响挥发性风味化合物（图2C和图2D）。总挥发性风味化合物含量随接种浓度增加而升高，在2×10⁷ CFU/g时达到最大值。该最优处理比对照多产生12.88 μg/g的总挥发性风味化合物，且关键香气活性烃类和酮类浓度最高。此浓度下挥发性风味化合物的峰值归因于最佳细胞密度驱动的代谢活性增强。因此，选择涵盖该最优值的接种浓度范围进行RSM进一步优化。
【数据】固定条件：40°C、21天；最适接种浓度：2×10⁷ CFU/g；最大增幅：+12.88 μg/g（ vs 对照）
发酵时间的影响
在固定条件（2×10⁷ CFU/g、35°C）下评估发酵时间对接种B. subtilis 1-F-2的雪茄烟叶挥发性风味化合物的影响。五大类挥发性风味化合物（酮类、醛类、酸类、酯类和醇类）的多样性和浓度随时间显著变化（图2E）。总挥发性风味化合物含量先升后降，第21天达到峰值33.53 μg/g（图2F）。峰值与醛类和酮类浓度最高时期重合，确定第15天至第21天为其积累的关键期。后续下降的原因可能是这些化合物被进一步代谢或转化。值得注意的是，虽然单因素分析中21天为峰值，但后续RSM建模由于温度与接种浓度的交互效应确定了略微偏移的最优值。因此，选择14–28天的发酵周期进行后续RSM实验，以捕捉这一动态趋势和产量峰值。
【数据】固定条件：2×10⁷ CFU/g、35°C；最大总VFCs含量：33.53 μg/g（第21天）；关键积累期：第15–21天；RSM实验时间范围：14–28天
RSM优化结果
RSM方差分析
B. subtilis 1-F-2发酵工艺的优化基于Box-Behnken设计原理进行。该实验设计在拟合二次响应面方面效率高，特别适合以最少实验次数确定最优条件，是发酵工艺优化中广泛采用的策略。以挥发性风味化合物含量（Y）为响应值，优化三个工艺参数：发酵时间（A）、接种浓度（B）和发酵温度（C）（表S3）。按照设计统计要求对实验数据进行多元非线性回归，得到拟合经验模型：Y = +29.86 + 0.7384A + 0.4685B + 0.6019C + 0.3309AB + 0.2018AC + 0.3340BC − 2.03A² − 1.76B² − 2.10C²。回归模型方差分析（ANOVA）见表1。模型高度显著（P < 0.001），失拟项不显著，表明模型拟合充分。在所测因素中，发酵时间（A）对挥发性风味化合物的影响最强，其次为温度（C）和接种浓度（B）。这一影响层级可能反映了基本的微生物生理学：发酵时间直接决定生物量积累和代谢物合成的时长；温度不仅控制细胞生长速率，还影响蛋白酶、果胶酶和糖苷酶等关键胞外酶的表达与催化效率，这些酶从烟叶基质中释放并转化非挥发性风味前体。观察到的36°C最适温度可能反映了最大酶活与持续细胞代谢通量之间的平衡。接种浓度主要影响初始生长动力学，一旦达到某一阈值后边际影响可能递减。所有线性项和二次项以及AB和BC交互项均显著。各因素二次项的显著性证实了实验域内存在明确的优化点，超过该点后挥发性风味化合物产量下降。显著的AB（时间×接种浓度）和BC（接种浓度×温度）交互作用表明，一个因素对挥发性风味化合物的影响依赖于另一因素的水平。不显著的AC交互作用（P > 0.05）表明，在测试范围内发酵时间和温度的影响基本相互独立。该模型展现了优异的预测能力。
【数据】回归模型：Y = +29.86 + 0.7384A + 0.4685B + 0.6019C + 0.3309AB + 0.2018AC + 0.3340BC − 2.03A² − 1.76B² − 2.10C²；模型显著性：P < 0.001；因素影响排序：时间(A) > 温度(C) > 接种浓度(B)；最优温度：36°C
图3 | 响应面图展示发酵参数间交互作用对雪茄烟叶挥发性风味化合物含量的影响。(A) 时间与温度交互分析；(B) 时间与温度等高线分析；(C) 温度与接种浓度交互分析
图4 | 优化条件与对照条件下B. subtilis 1-F-2发酵雪茄烟叶的化学成分。(A) 氯、(B) 钾、(C) 氮、(D) 烟碱、(E) 还原糖和(F) 总糖。不同小写字母表示差异具有统计学显著性（P < 0.05）
图5 | 最优发酵工艺参数对雪茄烟叶挥发性风味化合物的影响。(A) 挥发性风味化合物种类；(B) 挥发性风味化合物总含量；(C) 关键香气活性化合物ROAV气泡图。在(C)中，气泡大小与对应化合物的ROAV值成正比。不同小写字母表示差异具有统计学显著性
图6 | 最优条件下B. subtilis 1-F-2发酵雪茄烟叶的感官评价。(A) 感官属性评分雷达图；(B) 香气特征强度评分雷达图
讨论与解读
本研究确立了利用产香菌株B. subtilis 1-F-2发酵雪茄烟叶的最优工艺参数。RSM揭示最优条件为36°C、2×10⁷ CFU/g、22天，其中发酵时间影响最大，其次为温度和接种浓度。与对照组相比，B. subtilis 1-F-2组的烟碱、总氮、钾、还原糖和总糖含量分别下降1.57%、0.96%、0.37%、0.12%和0.13%。鉴定到的挥发性风味化合物数量从75种增至87种，总含量提升74.51%。β-大马酮在两组中均为主导气味贡献物（ROAV = 100），苯乙酮作为新关键贡献物（ROAV = 1.64）仅存在于B. subtilis 1-F-2组，(E)-6,10-二甲基-5,9-十一碳二烯-2-酮的ROAV从0.54升至1.26。感官评价证实B. subtilis 1-F-2组烟叶的香气复杂性、柔和度和余味显著增强。这些发现为通过微生物发酵改善雪茄烟叶品质提供了实践基础，值得进行中试规模验证。
编译者解读
本研究巧妙地将产香菌株筛选与响应面工艺优化串联，形成了一条从"菌株到产品"的完整技术链条。值得注意的是，作者不仅关注挥发性风味化合物总量的提升，更通过ROAV分析揭示了香气贡献结构的重组——β-大马酮始终主导，而苯乙酮的"从无到有"和十一碳二烯酮衍生物的ROAV跃升（0.54→1.26）共同塑造了新的感官特征。这种"总量+结构"双重评价策略值得同类研究借鉴。不足之处在于，化学成分的下降（如烟碱降低1.57%）虽有利于口感改善，但降解机制尚未深入解析——究竟是菌株直接代谢还是酶促转化，原文未详述。此外，从实验室规模到工业化应用，发酵均一性控制和批次稳定性仍是待跨越的鸿沟。
参考来源
Qi H. The influence of fermentation process optimization of Bacillus subtilis 1-F-2 on the quality, flavor, and sensory properties of cigar tobacco leaves based on response surface methodology[J]. Industrial Crops and Products, 2026. DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124208
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124208