来源：Enhanced production of rare ginsenosides in ginseng aged under five years via fermentation optimization with Aspergillus cristatus（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
稀有皂苷因生物利用度显著优于主要皂苷而备受功能食品行业关注，但栽培人参中其天然含量极低。本研究对茯砖茶优势菌冠突散囊菌（Aspergillus cristatus）进行基因组分析，发现其携带GH1和GH3家族糖苷水解酶基因且无已知毒力因子与生物胺合成途径，据此开发发酵策略将五年以下人参中主要皂苷转化为稀有皂苷。通过单因素实验与响应面法优化，在14天、35°C、3%接种量、40%含水量的最优条件下，七种稀有皂苷总量达3.8908 ± 0.0797 mg/g，较未处理对照提高约10倍。
研究背景
栽培人参（Panax ginseng C.A. Meyer），尤其是五年以下根，自中国卫生部批准为新食品原料及药食同源物质后受到广泛关注。人参主要生物活性成分为糖基化的主要皂苷，包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1；而去糖基化的稀有皂苷通常含量极低甚至缺失。稀有皂苷因分子量降低和亲水性减弱，肠道通透性和全身分布得以改善，表现出更优的药理活性和生物利用度。然而幼龄人参根主要以鲜食方式消费，亟需提升其生物活性的加工策略。益生菌发酵是提高皂苷生物利用度和治疗潜力的可行途径——某些乳酸菌产生的β-葡萄糖苷酶可水解C-20位β-糖苷键，将Rb1、Rb2、Rc等主要皂苷转化为Rg3、F2、化合物K等活性稀有皂苷。冠突散囊菌作为茯砖茶优势益生菌，虽已应用于人参发酵并显示出与真菌来源聚酮化合物相关的抗衰老作用，但其在稀有皂苷定向转化方面的系统研究仍属空白。
研究方法
2.1 材料
皂苷标准品Rg2(S)、Rg2(R)、Rg3(S)、Rg3(R)、Rg5、Rg6和Rk1购自源叶生物科技有限公司。五年以下人参根采自白山桂峰特产有限公司。为保证一致性，去除侧根，主根用去离子水充分冲洗，切为2–3 cm小段，60°C烘箱干燥18 h。冠突散囊菌CGMCC21026由本实验室从茯砖茶中分离。菌株在马铃薯蔗糖琼脂平板（300.0 g/L马铃薯、100.0 g/L蔗糖、28.6 g/L NaCl、20.0 g/L琼脂）上经高压灭菌后无菌培养。28°C培养7天后收集孢子，悬浮于无菌去离子水中，血球计数板计数调整浓度至1 × 10⁸–10⁹ CFU/mL，作为后续发酵实验的接种物。
【数据】材料：人参根（<5年）；干燥条件：60°C、18h；孢子浓度：1×10⁸–10⁹ CFU/mL；培养基：马铃薯蔗糖琼脂（300 g/L马铃薯、100 g/L蔗糖、28.6 g/L NaCl、20 g/L琼脂）；培养条件：28°C、7天
2.2 冠突散囊菌全基因组测序、组装、注释与功能分析
冠突散囊菌完整基因组由诺禾致源（北京）测序。使用SMRT Link v5.0对测序读段进行de novo组装。基因结构预测采用整合策略，结合de novo预测（Augustus）、同源预测（GeneWise）及转录组预测（TransDecoder、Glimmer、SNAP算法）。功能注释聚焦于鉴定参与碳水化合物代谢和发酵过程中皂苷水解的潜在糖苷水解酶。通过KEGG、CAZy和KOG数据库比较分析鉴定候选基因。
【数据】测序平台：诺禾致源（北京）；组装软件：SMRT Link v5.0；注释数据库：KEGG、CAZy、KOG
2.3 冠突散囊菌发酵人参根
取10 g干燥人参段（干重计），复水至指定含水量。含水量定义为添加水量相对于人参干重的比值（g水/g干人参 × 100%）。复水样品转入100 mL锥形瓶，121°C高压灭菌15 min。冷却后按指定接种比加入冠突散囊菌孢子悬浮液。发酵温度范围为25°C至40°C，由后续单因素实验确定。接种比定义为每10 g干燥人参段对应的孢子悬浮液体积（mL/g，v/w）。例如，3%接种比对应每10 g干燥人参加入0.3 mL孢子悬浮液。
【数据】样品量：10 g干燥人参段/瓶；灭菌：121°C、15 min；发酵温度范围：25–40°C；接种比定义：mL孢子液/10 g干人参（v/w）
2.4 皂苷提取与定量
发酵后人参样品冻干。取0.5 g干燥匀浆样品，以40.0 mL甲醇-水（70:30，v/v）提取。混合液超声处理30 min，静置平衡12 h，再超声10 min。提取液经0.22 µm PTFE滤膜过滤后进行HPLC-MS分析。皂苷定量使用Agilent 1200系列高效液相色谱系统，配备二极管阵列检测器（DAD）和1946D单四极杆质谱仪（Agilent，美国）。分离采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm），柱温30°C。流动相为含0.05%甲酸的水溶液（A）和含0.05%甲酸的乙腈溶液（B）。梯度洗脱程序如下：0 min为10% B；线性升至30 min时30% B、60 min时55% B、70 min时80% B；随后100% B冲洗色谱柱（71–81 min），再平衡至10% B（82–88 min）。流速1.0 mL/min，进样量10 µL。质谱检测采用负离子电喷雾电离（ESI）模式及选择离子监测（SIM）。监测离子为Rg5、Rg6、Rk1的m/z 765.5，以及Rg2(S)、Rg2(R)、Rg3(S)、Rg3(R)的m/z 783.5。化合物通过与标准品的保留时间和质谱图比对进行鉴定。该HPLC-MS方法可同时检测和定量七种稀有皂苷。校准曲线在5–500 ng范围内线性良好（R² > 0.9990）。代表性色谱图（包括差向异构体对）显示基线分离，Rg2(S)/Rg2(R)分离度（Rs）为2.23，Rg3(S)/Rg3(R)为3.32，确认充分基线分离（Rs > 1.5）。虽然未进行完整方法验证——因该方法用于相对定量——但SIM检测的灵敏度足以可靠定量发酵样品中的所有目标化合物。
【数据】提取溶剂：甲醇-水（70:30 v/v）；提取体积：40.0 mL；超声时间：30 min + 10 min；平衡时间：12h；色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；柱温：30°C；流速：1.0 mL/min；进样量：10 µL；监测离子：m/z 765.5（Rg5/Rg6/Rk1）、m/z 783.5（Rg2/Rg3系列）；线性范围：5–500 ng；R²>0.9990；分离度：Rg2(S)/Rg2(R) Rs=2.23，Rg3(S)/Rg3(R) Rs=3.32
2.5 单因素实验设计
预实验基于稀有皂苷产量确定各因素的适宜范围。选定基线条件为发酵14天、32°C、40%含水量、2%接种比。在此条件下，稀有皂苷总量达3.2000 ± 0.1438 mg/g。Rg2(S)、Rg2(R)、Rg3(S)、Rg3(R)、Rg5、Rg6、Rk1的单独产量分别为0.5191 ± 0.0322 mg/g、0.1005 ± 0.0010 mg/g、0.4523 ± 0.0324 mg/g、0.3834 ± 0.0443 mg/g、0.1108 ± 0.0016 mg/g、0.7907 ± 0.0667 mg/g、0.8431 ± 0.0385 mg/g。与未处理对照相比，这些数值分别增加7.9、2.9、2.5、17.7、14.2、0.07、29.4、52.0倍。
【数据】基线条件：14天、32°C、40%含水量、2%接种比；总稀有皂苷：3.2000 ± 0.1438 mg/g；各组分产量：Rg2(S) 0.5191±0.0322、Rg2(R) 0.1005±0.0010、Rg3(S) 0.4523±0.0324、Rg3(R) 0.3834±0.0443、Rg5 0.1108±0.0016、Rg6 0.7907±0.0667、Rk1 0.8431±0.0385 mg/g；较对照倍数：7.9、2.9、2.5、17.7、14.2、0.07、29.4、52.0倍
2.6 实验设计与Box-Behnken设计（BBD）
发酵条件优化使用Design-Expert软件（Design-Expert 13.0.1.0，State-Ease Inc.，美国）。选取四个自变量：发酵时间（A）、发酵温度（B）、含水量（C）和接种比（D），各设三个水平。构建含27次实验的Box-Behnken设计。响应值包括总稀有皂苷（Y1）、Rg2(S)（Y2）、Rg2(R)（Y3）、Rg3(S)（Y4）、Rg3(R)（Y5）、Rg5（Y6）、Rg6（Y7）和Rk1（Y8）。所有实验设三次重复，结果以平均值±标准差表示（n = 3）。各响应值赋予相等权重，以反映最大化整体稀有皂苷谱的目标。对每个响应值进行方差分析（ANOVA），详细统计结果（包括平方和、自由度、均方、F值、p值和失拟检验）见补充表S3–S10。
【数据】实验设计：Box-Behnken（27次实验）；自变量：发酵时间（A）、温度（B）、含水量（C）、接种比（D），各3水平；重复：3次（n=3）；统计方法：ANOVA
研究结果
3.1 基因组分析
冠突散囊菌基因组特征显示基因组大小为28.5 Mbp，GC含量49.7%，完整度高达99.0%。组装基因组N50值为5064,045 bp，最大重叠群长度为6009,761 bp。基因预测鉴定出9491个蛋白编码基因，略低于已报道的冠突散囊菌CGMCC 7.193。但与参考基因组的序列比对表明，该基因组与该物种典型基因组特征总体一致。KEGG通路注释将5320个蛋白编码基因归入六大功能类别：细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和生物体系统（图1A）。KOG注释将2280个蛋白编码基因分为25个功能亚类，进一步归为五个主要功能域：能量产生与转化；氨基酸运输与代谢；翻译、核糖体结构与生物发生；翻译后修饰、蛋白质周转与伴侣蛋白；一般功能预测。真菌介导的皂苷生物转化主要由糖苷水解酶驱动，特别是属于GH1和GH3家族的β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）。基于CAZy的分析在冠突散囊菌基因组中鉴定出55个不同的GH家族，包括编码GH1和GH3酶的基因。这些β-葡萄糖苷酶编码基因的存在支持了皂苷去糖基化的基因组潜力（图1B）。然而，由于GH1和GH3在曲霉属物种中广泛分布，它们并不代表菌株特异性决定因素。虽然这些发现提示酶学能力，但将特定酶直接归属于各转化步骤仍需进一步的生化验证。这些酶促过程的效率强烈依赖于发酵条件，包括时间、温度、含水量和接种比。发酵时间控制微生物生长、酶分泌和多步去糖基化级联的进程。皂苷生物转化本质上是时间依赖性的，需要足够的时间使培养物从初级生长过渡到次级代谢，此时酶产量达到最大。例如，在嗜热子囊菌中，约需96小时孵育才能达到最佳β-葡萄糖苷酶产量，而更长时间可能导致营养耗竭和活性降低。温度是另一个关键参数，影响酶促反应速率和蛋白质稳定性。参与皂苷转化的β-葡萄糖苷酶通常在特定温度范围内表现出最佳活性。曲霉属来源的酶常在40–55°C显示最大活性，而植物来源的β-葡萄糖苷酶可能在稍高温度（55–60°C）下发挥最佳功能。然而，全细胞发酵系统通常在嗜温范围（30–40°C）内运行以维持微生物活力。因此，最佳温度选择需在酶活性与宿主微生物的细胞生理完整性之间取得平衡。含水量在固态发酵中同样关键，决定水活度、底物可及性和氧气扩散。充足的水分支持微生物代谢和酶功能，而水分过多可能降低孔隙率并限制氧气传递。已有研究表明，黑曲霉中β-葡萄糖苷酶产量在含水量约65–75%时达到最大，但最佳条件可能因底物和系统配置而异。接种比决定初始生物量并影响后续微生物动态。适当的接种水平确保快速定殖和充足酶产量，而过度接种可能导致营养竞争和代谢效率降低。例如，据报道硬毛韧革菌JE0512的皂苷转化最佳接种比为20%。
【数据】基因组大小：28.5 Mbp；GC含量：49.7%；完整度：99.0%；N50：5064,045 bp；最大contig：6009,761 bp；蛋白编码基因：9491个；KEGG注释：5320个基因；KOG注释：2280个基因；CAZy GH家族数：55个
3.2 冠突散囊菌安全性评价
在食品发酵中，冠突散囊菌通常被认为是有益微生物，有助于产品安全、品质和营养价值。然而，与毒力因子或不良代谢物相关的潜在风险要求在工业应用前进行全面安全性评估。与真菌毒力因子数据库（DFVF）的比较基因组分析显示，冠突散囊菌基因组中无已知毒力因子相关基因。同样，也未鉴定出参与生物胺生物合成的关键基因。这些发现表明其在基因组水平上具有良好的安全性。然而，注释基因的缺失并不绝对保证安全性。曲霉属物种能够产生包括真菌毒素在内的多种次级代谢产物，这些可能无法被当前数据库完全覆盖。由于本研究未进行实验性毒素分析或代谢物谱分析，需要进一步验证。未来工作应包括靶向毒素筛选和非靶向代谢组学分析，以确认其工业应用安全性。除毒力问题外，发酵过程中产生的生物胺可能带来健康风险，包括高血压和神经系统症状。这些化合物通常通过氨基酸脱羧产生。与CAZy数据库的比较基因组分析确认，冠突散囊菌缺乏参与生物胺生物合成的关键生物合成基因，进一步支持其适用于发酵应用，但实验确认仍然必要。
【数据】安全性分析：DFVF数据库比对（无毒力因子基因）；生物胺合成基因：未检出
3.3 发酵过程中皂苷谱的变化
图2展示了发酵过程中皂苷组成的动态变化。七种化合物——Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd——被鉴定为主要皂苷（图2A）。这些化合物的浓度随发酵时间延长逐渐降低。相比之下，七种稀有皂苷在发酵过程中显著积累（图2B），包括Rg2(S)、Rg2(R)、Rg3(S)、Rg3(R)、Rg5、Rg6和Rk1。选择这七种化合物进行靶向定量基于两方面考虑。第一，初步HPLC-MS分析表明它们是所测发酵条件下的主要产物。第二，这些化合物是微生物生物转化研究中最常报道的稀有皂苷，便于与现有文献比较。化合物K、Rh2和苷元衍生物未被纳入，因为在初步分析中它们不是主要产物。这可能反映了冠突散囊菌糖苷水解酶的底物特异性，或缺乏C-3位进一步去糖基化所需的酶活性。已有研究表明，多种微生物（包括黑曲霉、冬虫夏草、蜜环菌、乳酸乳球菌和嗜热菌属）具有通过C-3或C-20位水解进行皂苷生物转化的酶学能力，产生稀有皂苷或苷元衍生物。例如，Fu等人鉴定出一株内生细菌（Burkholderia sp. GE 17–7），能够产生β-葡萄糖苷酶并在最佳条件（pH 7.0，30°C）下15 h内将Rb1转化为Rg3，转化率达98%。相比之下，冠突散囊菌的胞外酶制剂在本研究测定条件下将Rb1转化为Rg3(S)（图3），与曲霉属物种典型的C-20去糖基化活性一致。
【数据】主要皂苷：Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd（随发酵时间递减）；稀有皂苷产物：Rg2(S)、Rg2(R)、Rg3(S)、Rg3(R)、Rg5、Rg6、Rk1（随发酵时间累积）；对照文献转化率：98%（pH 7.0、30°C、15 h）
讨论与解读
本研究证明，传统上与茶发酵相关的益生真菌冠突散囊菌能够对五年以下幼龄人参中的主要皂苷进行生物转化，这是此前未见报道的新应用。基因组分析揭示的多样化糖苷水解酶基因库（如GH1和GH3家族）为发酵优化提供了理论依据。通过单因素实验与响应面法联用，确定了关键工艺参数——发酵时间、温度、含水量和接种比。最优条件（14天、35°C、40%含水量、3%接种量）下，七种定量稀有皂苷总量达3.8908 ± 0.0797 mg/g，较未发酵人参提高约10倍。特别值得注意的是，Rg3(S)和Rk1等特定化合物表现出28至42倍的显著增强，凸显了该工艺生产高价值生物活性皂苷的效率。由于缺乏主要残留皂苷的定量数据，无法建立完整质量平衡和总转化效率，但稀有皂苷的显著积累清楚表明，五年以下人参的发酵是一种可行的增值策略。
【数据】最优条件：14天、35°C、40%含水量、3%接种量；总稀有皂苷：3.8908 ± 0.0797 mg/g；较对照提高：约10倍；Rg3(S)和Rk1增强倍数：28–42倍
编译者解读
本研究亮点在于以基因组数据驱动发酵工艺设计——先确认菌株携带GH1/GH3糖苷水解酶基因且无安全风险基因，再据此有的放矢地优化发酵参数，这种"基因型→表型"的理性路径值得合成生物学借鉴。10倍总稀有皂苷提升和特定组分最高42倍的增幅，展示了固态发酵在天然产物增值中的实用价值。局限同样明显：质量平衡未建立，转化路径中具体酶与产物的对应关系仍停留在推测层面；基因组安全性判断也需实验毒理学数据支撑。后续若能将冠突散囊菌的糖苷水解酶基因导入工程菌株实现异源表达，或可突破固态发酵批次差异大的瓶颈，推动稀有皂苷的标准化生物制造。
参考来源
Wang Zhenfei. Enhanced production of rare ginsenosides in ginseng aged under five years via fermentation optimization with Aspergillus cristatus. Process Biochemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.procbio.2026.05.003
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.05.003