来源：Fermentation optimization and scale-up of Bacillus amyloliquefaciens SB005 using milhocina as a low-cost substrate: Multi-enzymatic production and dual biostimulant and nematicidal activity on soybean（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
化学农药的减量需求推动微生物生物投入品研发加速。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）因产孢能力强、酶系丰富而备受关注，但实验室性状向工业化发酵转化常卡在培养基设计与放大环节。本研究从大豆叶片分离出内生菌株SB005，以玉米副产物milhocina为主要碳源，通过旋转中心复合设计优化培养基，在5 L和100 L反应器中逐级放大验证，最终以2.1 mL/kg种子的剂量处理大豆种子，对爪哇根结线虫种群抑制率达67.8%，与化学杀线虫剂效果相当。
研究背景
农业增产与减少化学投入品依赖的双重需求，使微生物生物投入品成为研究热点。此类产品通常源于筛选项目——目标是找到兼具促生性状与工业发酵耐受性的菌株。解淀粉芽孢杆菌是其中最有潜力的候选者之一：它生长快、能分泌高水平胞外水解酶（淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶），且产生高度抗逆的内生孢子，利于制剂化和延长货架期。然而，将实验室优良性状转化为商业化产品仍面临瓶颈——发酵培养基的系统优化与工艺放大是核心难点。培养基组成直接决定生物量积累、产孢效率和次生代谢物合成，合理的培养基设计是建立稳定生物工艺的前提。
研究方法
2.1 内生细菌菌株
内生细菌菌株SB005分离自大豆（Glycine max）叶片，通过部分16S rRNA基因测序鉴定为解淀粉芽孢杆菌。靶区域使用引物PO27F（5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和R1387（5′-GGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3′）扩增。所得核苷酸序列已提交GenBank，登录号为PX956828。菌株SB005保藏于巴西Síntese Agro Science®微生物生物技术实验室的内生与环境微生物保藏中心（CMEA），使用登记于巴西国家遗传遗产管理系统（SISGEN），编号A2E64A3。长期保藏采用含25%（v/v）甘油的TSB培养基（pH 7.3），于−80°C保存。工作菌液通过将等分试样接种至TSB（pH 7.3）并于28°C培养48 h恢复，随后转接至TSA平板（pH 7.3），28°C培养24 h。
【数据】菌株：B. amyloliquefaciens SB005；保藏温度：−80°C；甘油浓度：25%（v/v）；活化温度：28°C；活化时间：48 h（液体）/24 h（固体）；培养基：TSB/TSA（pH 7.3）
2.2 内生细菌分离株的体外生物勘探
无机磷溶解能力采用固体培养基溶磷圈法评估，参照Verma等[23]的方法略作修改。基础培养基组成：葡萄糖10 g/L；NH₄Cl 5 g/L；MgSO₄·7H₂O 1 g/L；CaHPO₄（不溶性磷酸二钙）0.8 g/L；琼脂15 g/L；pH调至7.3。铁载体产生能力在化学成分确定的液体培养基中评估，培养基组成为：葡萄糖1 g/L；(NH₄)₂SO₄ 1 g/L；KH₂PO₄ 1 g/L；MgSO₄ 0.5 g/L；CaCl₂ 0.1 g/L；FeSO₄ 0.002 g/L；ZnSO₄ 0.001 g/L；MnSO₄ 0.001 g/L；CuSO₄ 0.005 g/L；Na₂MoO₄ 0.0001 g/L；L-天冬酰胺2 g/L；pH 7.0。铁载体浓度通过与FeCl₂（0.1 g/L）络合定量，方法参照Melo和Sanhueza[24]。胞外多糖（EPS）产量测定所用培养基含：酵母提取物1 g/L；(NH₄)₂SO₄ 1 g/L；KH₂PO₄ 1 g/L；MgSO₄ 0.5 g/L；CaCl₂ 0.1 g/L；FeSO₄ 0.002 g/L；ZnSO₄ 0.001 g/L；MnSO₄ 0.001 g/L；CuSO₄ 0.005 g/L；Na₂MoO₄ 0.0001 g/L；蔗糖100 g/L；pH 7.0。EPS采用Dubois等[25]的苯酚-硫酸比色法定量。所有生物勘探试验均设三次重复。
【数据】溶磷培养基：葡萄糖10 g/L、NH₄Cl 5 g/L、MgSO₄·7H₂O 1 g/L、CaHPO₄ 0.8 g/L、琼脂15 g/L，pH 7.3；铁载体培养基pH 7.0，FeCl₂ 0.1 g/L；EPS培养基：蔗糖100 g/L，pH 7.0；重复：3次
2.3 发酵工艺优化与放大
#### 2.3.1 细菌接种物的制备与活化
在无菌生理盐水（0.85% NaCl）中制备标准化菌悬液，通过紫外-可见分光光度法调整至600 nm处光密度（OD₆₀₀）为0.300。取0.5 mL该悬液转接至含50 mL TGY培养基（胰蛋白胨5 g/L；葡萄糖5 g/L；酵母提取物2.5 g/L；pH 7.0）的250 mL挡板锥形瓶中。于30°C、140 rpm连续振荡培养24 h。所得活化培养物作为后续所有发酵实验的标准接种物。
【数据】接种量：0.5 mL/50 mL；OD₆₀₀：0.300；培养基：TGY（胰蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、酵母提取物2.5 g/L，pH 7.0）；温度：30°C；时间：24 h；转速：140 rpm
#### 2.3.2 基于实验设计的培养基优化
采用Protimiza Experimental Design®软件进行培养基优化，遵循实验设计（DoE）方法。使用旋转中心复合设计（RCCD）评估四个独立营养变量：麦芽提取物、玉米副产物（milhocina）、酵母提取物和蔗糖。每个因子在0–20 g/L的实际浓度范围内考察，对应编码水平为−2、−1、0、+1、+2。设计包含27个析因试验和3个中心点重复；以标准TGY培养基的三次重复试验作为过程对照，共计30个试验组。所有培养基统一补充以下微量元素溶液：MgSO₄·7H₂O 0.3 g/L；K₂HPO₄ 1 g/L；CaCl₂ 0.3 g/L；FeSO₄ 0.3 g/L，参照Harwood和Cutting[26]的方法。完整设计矩阵见补充表S1。每种配方在含50 mL相应培养基的250 mL挡板锥形瓶中评估，以1%（v/v）接种量接入活化培养物（2.3.1）。培养物于30°C、150 rpm连续振荡培养48 h。培养基性能以产孢能力（CFU/mL）[27]及无细胞上清液中淀粉酶[28]、几丁质酶[29]、纤维素酶[30]和蛋白酶的活性进行排序。
响应面法（RSM）用于生成每种培养基配方的三维曲面图，使用Protimiza®软件。酶活数据通过JAMOVI软件（2.7.16版）进行多元协方差分析（MANCOVA）。选择MANCOVA是因为它允许同时检验多个自变量（培养基组分）对一组生理相关的响应变量（四种酶活）的影响，从而控制多个单变量ANOVA固有的I型错误膨胀。多元正态性和方差-协方差矩阵齐性假设通过残差Q-Q图和响应变量散点图矩阵进行图形化评估。为防范潜在违反而采用Pillai's trace作为检验统计量，因其对分布假设的偏离具有公认的稳健性。主成分分析（PCA）作为无监督探索性技术，用于可视化酶活间的潜在相关结构，并根据综合表现对培养基排序。PCA使用PAST软件（4.03版）进行。通过检查相关矩阵验证了PCA的适用性——所有酶对之间均存在有意义的正相关，与协同分泌一致。在所有评估标准中综合表现最优的培养基被选用于5 L和100 L生物反应器的工艺放大。
【数据】设计类型：RCCD；因子数：4；浓度范围：0–20 g/L；编码水平：−2至+2；试验组数：30（27析因+3中心点）；微量元素：MgSO₄·7H₂O 0.3 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L、CaCl₂ 0.3 g/L、FeSO₄ 0.3 g/L；装液量：50 mL/250 mL瓶；接种量：1%（v/v）；温度：30°C；时间：48 h；转速：150 rpm；统计软件：JAMOVI 2.7.16、PAST 4.03
#### 2.3.3 5 L生物反应器中的实验室规模发酵
通过DoE确定的优化培养基转移至5 L BIOENG-B生物反应器（ENGCO），于121°C原位灭菌30 min。随后容器冷却至60°C，通过循环水浴平衡至目标培养温度30°C。配置蠕动泵用于pH调节，输送已灭菌的0.05 M NaOH和0.065 M磷酸，流速50 mL/min（设定值：pH 7.0）。所有培养参数稳定后（温度30°C；搅拌120 rpm；pH 7.0；DO 98.9%），将预培养的细菌接种物（OD₆₀₀ = 0.300；2.3.1）经蠕动泵以20 mL/min无菌导入，达到1%（v/v）的最终接种率。DO使用可灭菌的极谱电极连续监测。发酵期间不启用主动pH控制。在42 h内每2 h从发酵液中取样一次。每个时间点按2.3.2所述方法测定无细胞上清液中的酶活。发酵结束时，计数总营养细胞和孢子浓度（CFU/mL）[27]。pH、温度和DO的时间曲线通过MANCOVA和单变量ANOVA分析，评估其作为酶产量决定因素的显著性。统计分析使用JAMOVI软件（2.7.16版）。
【数据】反应器：5 L BIOENG-B（ENGCO）；灭菌：121°C、30 min；培养温度：30°C；搅拌：120 rpm；pH设定：7.0；NaOH：0.05 M；磷酸：0.065 M；流速：50 mL/min；初始DO：98.9%；接种物流速：20 mL/min；接种率：1%（v/v）；取样间隔：2 h；总时长：42 h
#### 2.3.4 放大至100 L生物反应器的中试规模发酵
该生物工艺放大至标称工作体积100 L，使用BIOENG-P生物反应器（ENGCO），配备综合工艺基础设施，包括加压压缩空气供应、专用冷却塔和蒸汽发生能力。所有关键工艺参数——温度、pH、搅拌速率、通气量、溶解氧和泡沫控制——均通过集成传感器阵列和级联控制系统自动调节。
（注：原文此节后续内容在节选中未完整呈现，具体控制参数原文未详述。）
【数据】反应器：100 L BIOENG-P（ENGCO）；工作体积：100 L；参数控制方式：自动（传感器阵列+级联控制）
研究结果
3.1 促生相关的体外生物勘探试验
解淀粉芽孢杆菌SB005菌株基于三项关键体外活性表现出良好的促生特性。该菌株展现出显著的溶磷能力（溶解指数 = 2.2 cm）、高胞外多糖产量（870 µg/mL）以及铁载体合成能力（8.2%螯合潜力）。
【数据】溶磷指数：2.2 cm；EPS产量：870 µg/mL；铁载体螯合率：8.2%
3.2 基于实验设计（DoE）的培养基优化
培养基组成对四种酶活的联合效应具有高度显著的多元影响（Pillai's trace = 2.71，F = 6.54，p < 0.001）。该结果经单变量ANOVA证实，每种酶均表现出显著效应（所有p < 0.001）。效应大小在不同酶间差异明显：蛋白酶响应最强（F = 95.73），其次是淀粉酶（F = 22.80）、几丁质酶（F = 5.54）和纤维素酶（F = 3.91）。图1展示了milhocina、酵母提取物、蔗糖和麦芽提取物对孢子浓度影响的响应面。
为整合这些结果，进行了主成分分析（PCA），结果见图2。第一主成分（PC1）解释了总方差的81.3%，作为整体酶生产力的综合轴（补充表S2）。所有PC1载荷均为正值——蛋白酶（0.94）、淀粉酶（0.20）、纤维素酶（0.16）和几丁质酶（0.19）——表明四种酶活之间呈正相关（补充表S3）。
基于PC1得分（补充表S4），30种培养基被分为四个性能组。高综合性能组（PC1 > 0.60）为培养基24和6，二者同时促进四种酶的高水平产生。中性能组（PC1 > 0.40）包括培养基1、2、10、11、14和25。低性能组（PC1 > 0.20）为培养基4、5、8、9、12、15、16、17、18、20和26。极低性能组（PC1 < 0.20）为培养基3、7、13、19、21、22、23和27。第二主成分（PC2）占总方差的11.6%，捕捉酶谱中更细微的差异。载荷为：蛋白酶（−0.26）、淀粉酶（0.92）、纤维素酶（0.05）和几丁质酶（0.27）（补充表S4）。两种培养基在该轴上表现出非典型谱型，值得注意的是，培养基21的PC2得分异常高（1.183）。表1列出了每种培养基的完整数据集，包括酶活（淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶）、总细胞数（营养细胞加孢子）和活孢子数（CFU/mL）。各培养基中每种酶形成的降解圈代表性图像见图3。
【数据】Pillai's trace：2.71；F = 6.54；p < 0.001；蛋白酶F = 95.73；淀粉酶F = 22.80；几丁质酶F = 5.54；纤维素酶F = 3.91；PC1方差解释率：81.3%；PC2方差解释率：11.6%；PC1载荷：蛋白酶0.94、淀粉酶0.20、纤维素酶0.16、几丁质酶0.19；培养基21的PC2得分：1.183
3.3 使用培养基配方24的5 L生物反应器实验室规模发酵
MANCOVA表明，温度、pH和溶解氧（DO）对联合产酶谱产生显著且不同的影响。三个变量均检测到显著的多元效应：温度（Pillai's trace = 0.671，F = 30.1，p < 0.001）、DO（Pillai's trace = 0.590，F = 21.2，p < 0.001）和pH（Pillai's trace = 0.447，F = 11.9，p < 0.001）。随后的单变量分析揭示了明显的酶学特异性模式。温度显著影响全部四种水解酶活（p < 0.001），对几丁质酶（F = 99.8）和淀粉酶（F = 73.8）的效应尤为强烈，其次是蛋白酶（F = 47.0）和纤维素酶（F = 19.8）。DO也显著影响四种酶，对纤维素酶的效应最强（F = 45.3，p < 0.001），其次是蛋白酶（F = 31.9，p < 0.001）、淀粉酶（F = 12.4，p < 0.001）和几丁质酶（F = 11.1，p = 0.001）。相比之下，pH表现出明显的酶选择性：显著影响几丁质酶（F = 7.30，p = 0.009）和淀粉酶（F = 6.52，p = 0.013），但对纤维素酶（F = 0.251，p = 0.618）和蛋白酶（F = 0.982，p = 0.325）无检测到的影响。表2详述了培养期间酶活的时间演变。图3展示了各酶在代表性时间点对应的水解圈。
发酵结束时（42 h），平板计数得到总细胞浓度为2.2 × 10⁹ CFU/mL（营养细胞加孢子），其中活孢子为2.0 × 10⁹ CFU/mL。
【数据】温度效应：Pillai's trace = 0.671，F = 30.1，p < 0.001（几丁质酶F = 99.8、淀粉酶F = 73.8、蛋白酶F = 47.0、纤维素酶F = 19.8）；DO效应：Pillai's trace = 0.590，F = 21.2，p < 0.001（纤维素酶F = 45.3、蛋白酶F = 31.9、淀粉酶F = 12.4、几丁质酶F = 11.1）；pH效应：Pillai's trace = 0.447，F = 11.9，p < 0.001（几丁质酶F = 7.30，p = 0.009；淀粉酶F = 6.52，p = 0.013；纤维素酶p = 0.618；蛋白酶p = 0.325）；总细胞：2.2 × 10⁹ CFU/mL；活孢子：2.0 × 10⁹ CFU/mL；发酵时长：42 h
3.4 放大至100 L生物反应器的中试规模发酵（培养基24）
实验室规模优化后，发酵工艺放大至100 L，以评估中试规模下酶生产的可重复性。MANCOVA显示温度（Pillai's trace = 0.610，F = 7.43，p < 0.001）、DO（Pillai's trace = 0.949，F = 87.8，p < 0.001）和pH（Pillai's trace = 0.597，F = 7.04，p = 0.001）对联合酶谱具有显著的多元效应。单变量分析证实，三个参数均显著影响每种酶活。在评估的工艺变量中，溶解氧是主导因素，对四种酶均表现出最强的效应（p < 0.001）：纤维素酶（F = 162.8）、蛋白酶（F = 157.2）、淀粉酶（F = 145.0）和几丁质酶（F = 98.7）。表3列出了培养期间酶活的时间演变。
发酵结束时（30 h），平板计数得到总细胞浓度为7.2 × 10⁸ CFU/mL，活孢子数为3.1 × 10⁸ CFU/mL。
【数据】温度：Pillai's trace = 0.610，F = 7.43，p < 0.001；DO：Pillai's trace = 0.949，F = 87.8，p < 0.001（纤维素酶F = 162.8、蛋白酶F = 157.2、淀粉酶F = 145.0、几丁质酶F = 98.7）；pH：Pillai's trace = 0.597，F = 7.04，p = 0.001；总细胞：7.2 × 10⁸ CFU/mL；活孢子：3.1 × 10⁸ CFU/mL；发酵时长：30 h
3.5 粗发酵液的农艺潜力
#### 3.5.1 对大豆萌发的剂量-效应
用解淀粉芽孢杆菌SB005发酵液处理种子对大豆下胚轴和胚根伸长产生剂量依赖性效应（图4B）。下胚轴生长最适合用三次多项式模型描述（y = 0.0867x³ − 0.5568x² + 0.9148x + 8.2366；R² = 0.9857），表明最适剂量约为1.1 mL/kg种子。胚根长度符合二次模型（y = −0.1429x² + 0.6029x + 10.386；R² = 0.3967；p < 0.05），预测最适剂量为2.1 mL/kg种子。这些剂量-响应趋势在沙土和土壤基质中独立进行的萌发试验中得到支持。施用胚根最适剂量（2.1 mL/kg）在沙土（图4C）和土壤（图4D）中均显著增加了总根系长度，相对于未处理对照（表4）。
#### 3.5.2 对爪哇根结线虫的杀线虫活性
除促生效应外，相同剂量（2.1 mL/kg种子）处理赋予了对爪哇根结线虫显著的杀线虫活性。与未处理对照相比，发酵液将线虫总种群减少67.8%，每克根线虫数减少69.5%，繁殖因子降低67.0%。这些减少在统计学上与阳性对照（商业化学杀线虫剂）观察到的效果相当（表5；图4E）。
【数据】下胚轴最适剂量：1.1 mL/kg（R² = 0.9857）；胚根最适剂量：2.1 mL/kg（R² = 0.3967，p < 0.05）；线虫总种群减少：67.8%；每克根线虫数减少：69.5%；繁殖因子降低：67.0%
讨论与解读
菌株SB005的体外特征揭示出良好的促生潜力：无机磷溶解（SI = 2.2 cm）、高EPS产量（870 µg/mL）和铁载体合成（8.2%螯合率）。溶磷能力比此前报道的解淀粉芽孢杆菌（Matos等[32]和Abdallah等[33]记录的溶磷圈均低于2.0 cm）高出约60%。EPS滴度约为Deka等[34]（220 µg/mL）的4倍，接近Sánchez-León等[35]（490 µg/mL）报道值的2倍。这些性状具有功能意义：溶磷增强根系发育的磷素可利用性，高EPS产量则促进生物膜形成、根际定殖和抗非生物胁迫能力。综合来看，SB005具备开发农业生物投入品的良好促生表型。
本研究的核心目标是将这一表型潜力转化为可放大的发酵工艺，同时维持高细胞密度和明确的多酶谱。通过DoE优化培养基并以MANCOVA评估，证实培养基组成对联合产酶具有高度显著效应（Pillai's trace = 2.71，p < 0.001）。PCA强化了这一发现：PC1捕获了总方差的81.3%，且所有载荷为正，说明四种酶存在协同分泌机制。5 L与100 L两级放大均保持酶活水平，且溶解氧在放大后被识别为主导工艺变量——这一信息对工业规模的过程控制策略具有直接指导价值。农艺验证中，2.1 mL/kg剂量的发酵液兼具促根和杀线虫双重功效，后者与化学对照相当，为生物杀线虫剂的开发提供了实证基础。
编译者解读
该研究最值得借鉴之处在于"以副产物为底物、以多酶协同为靶标"的培养基设计逻辑——用玉米加工副产物milhocina替代纯糖碳源，既降成本又契合循环农业理念。统计框架上，MANCOVA+PCA的组合有效处理了多响应变量间的相关性，避免了逐个酶单独优化可能导致的相互矛盾。放大过程中DO被识别为主导变量，提示工业规模需优先保障传氧效率。局限在于农艺试验仅测了萌发期与线虫抑制，田间复杂条件下的定殖动态与持久性尚待验证。对合成生物学应用而言，该菌株的四酶协同分泌机制若结合启动子工程，或可进一步提升产酶谱的可调性。
参考来源
Matos, G.G.F. Fermentation optimization and scale-up of Bacillus amyloliquefaciens SB005 using milhocina as a low-cost substrate: Multi-enzymatic production and dual biostimulant and nematicidal activity on soybean. Process Biochemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.procbio.2026.05.013
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.05.013