来源：Fermentation optimization and characterization of extracellular protein-associated antifungal components from Bacillus velezensis SY01 against Cytospora pyri（Physiological and Molecular Plant Pathology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
苹果树腐烂病（Cytospora pyri）长期威胁新疆塔里木盆地苹果产业。本研究以贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）SY01菌株为对象，通过单因素发酵优化、理化稳定性测定、分级透析与蛋白质组学分析，系统解析其胞外蛋白相关抗真菌成分的性质。研究发现，在LB培养基中添加5.00 g/L葡萄糖可将发酵上清液对C. pyri的抑制率从54.6%提升至75.3%。活性成分对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，主要存在于>10 kDa组分中，SDS-PAGE显示富集蛋白条带主要分布在18–55 kDa区间。该研究为苹果腐烂病的蛋白类生物防治策略提供了基础依据。
研究背景
芽孢杆菌属是农业病害生物防治中广泛应用的重要菌群。贝莱斯芽孢杆菌因环境适应性强、定殖速度快、能合成多种抗菌代谢物而备受关注。这些代谢物包括环脂肽类（surfactin、fengycin、bacillomycin D等）以及多种蛋白类抗菌物质（抗菌蛋白、抗菌肽和细胞壁降解酶等）。与低分子量次级代谢产物相比，蛋白类抗菌物质通常具有更高的靶标特异性、更好的生物可降解性，并可直接作用于病原菌细胞壁、细胞膜或关键代谢过程。近年来，多种来源于不同贝莱斯芽孢杆菌菌株的蛋白类抗菌物质已被鉴定。例如，来自B. velezensis BvZ45-1的胞外草酸脱羧酶Odx_S12可降解大丽轮枝菌的毒力因子草酸，从而抑制真菌生长。然而，蛋白类抗真菌物质作为贝莱斯芽孢杆菌生防潜力的重要组成部分，仍未被充分探索。
研究方法
2.1 材料
2.1.1 供试菌株
苹果腐烂病病原菌C. pyri CXTA 329和生防菌B. velezensis SY01均取自喀什大学植物病理学实验室菌种保藏库。C. pyri CXTA 329最初分离自中国新疆塔里木盆地采集的苹果腐烂病病组织，前期研究已基于形态学特征和分子系统发育分析完成鉴定。该菌株在前期致病性测定中对离体苹果枝条表现出稳定且较强的致病性，故本研究选用该菌株。B. velezensis SY01最初分离自健康苹果树皮组织，前期已鉴定为能够诱导苹果抗病相关基因表达并产生脂肽类抗真菌物质的生防菌株。每次实验前，两株菌均从甘油保藏管中复苏以确保生理状态一致。C. pyri CXTA 329在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上维持培养，B. velezensis SY01在Luria–Bertani（LB）琼脂培养基上维持培养。
2.1.2 种子液制备
将真菌斜面培养物和细菌甘油保藏物分别接种至新鲜PDA和LB培养基进行活化。真菌于25°C培养2–3天，细菌于28°C培养24小时。挑取一环活化后的SY01单菌落，接种至含50 mL液体LB培养基的250 mL锥形瓶中，于30°C、200 rpm条件下培养12小时制备种子液。种子液立即用于后续发酵实验。
【数据】活化温度：真菌25°C 2–3天，细菌28°C 24h；种子液：50 mL LB/250 mL锥形瓶，30°C，200 rpm，12h
2.2 发酵培养基组分单因素优化
采用完全随机设计的单因素实验进行发酵培养基优化。分别评估葡萄糖、Fe²⁺和Mg²⁺添加对SY01发酵上清液抗真菌活性的影响。每个含100 mL培养基的250 mL锥形瓶视为一个实验单元。各处理中，LB培养基按5%（v/v）接种SY01种子液。不添加额外葡萄糖或金属离子的基础LB培养基作为发酵对照。添加处理包括：葡萄糖2.50、5.00、7.50、10.00 g/L；Fe²⁺以FeSO₄·7H₂O形式添加，浓度分别为0.56、1.68、2.79、3.91 mg/L；Mg²⁺以MgSO₄形式添加，浓度分别为24.3、36.5、48.6、60.8 mg/L。所有处理在相同的两阶段发酵条件下培养：先于36°C、200 rpm培养24小时，再于30°C、200 rpm培养24小时。发酵结束后，培养液于4°C、12,000 × g离心10分钟，上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤获得无细胞发酵上清液。
采用琼脂孔扩散法评估对C. pyri CXTA 329的抗真菌活性。取5 mm的C. pyri CXTA 329菌丝块置于PDA平板一侧，在距菌丝块5 cm处打一个5 mm孔径的孔。向孔中加入20 μL各无细胞发酵上清液。平板于25°C培养96小时。设置病原菌生长对照——孔中加入无菌LB培养基代替发酵上清液——用于计算抑制率。沿菌丝块与孔连线方向测量C. pyri CXTA 329朝向孔方向的径向生长量。抑制率计算公式如下：
抑制率（%）= [(C − T) / C] × 100
其中C代表病原菌生长对照中C. pyri CXTA 329的平均径向生长量，T代表对应处理中的平均径向生长量。每个处理设10个独立生物学重复，每个发酵瓶代表一个生物学重复。每个生物学重复进行3个技术性平板重复，取平均值用于统计分析。通过比较各处理间的抑制率确定最优培养基组分及浓度。
【数据】接种量：5%（v/v）；葡萄糖：2.50–10.00 g/L；FeSO₄·7H₂O：0.56–3.91 mg/L；MgSO₄：24.3–60.8 mg/L；发酵条件：36°C 200 rpm 24h + 30°C 200 rpm 24h；离心：12,000 × g，4°C，10min；孔径：5 mm；上样量：20 μL；培养：25°C，96h；生物学重复：10个；技术重复：3个
2.3 理化稳定性测定
理化稳定性实验采用完全随机设计。除非另有说明，每个处理含10个独立生物学重复。每个生物学重复进行3个技术性平板重复，取3个技术重复的平均值作为一个数据点用于统计分析。未经处理的无细胞发酵上清液作为对照。
2.3.1 热稳定性测定
参照Ansari等方法并略作修改，将SY01无细胞发酵上清液分别在40、60或80°C下加热30分钟。样品冷却至室温后，经0.22 μm无菌滤膜过滤，采用上述琼脂孔扩散法测定抗真菌活性，随后测定残留抗真菌活性。
【数据】热处理温度：40、60、80°C；时间：30min；滤膜：0.22 μm
2.3.2 pH稳定性测定
参照Choyam等方法并略作修改。使用1 M HCl或1 M NaOH将无细胞发酵上清液pH分别调至4、6、7、8或10，于37°C孵育30分钟。随后将样品pH重新调回7.0，于4°C、12,000 × g离心10分钟以去除pH诱导产生的沉淀（变性大分子、细胞碎片和不溶性盐类）。上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤后进行抗真菌活性测定。
【数据】pH处理：4、6、7、8、10；调节试剂：1 M HCl/1 M NaOH；孵育：37°C，30min；离心：12,000 × g，4°C，10min
2.3.3 蛋白酶敏感性分析
为确定抗真菌活性是否与蛋白类物质相关，将无细胞发酵上清液分别用蛋白酶K或胰蛋白酶处理。具体操作：取5 mL无细胞上清液与等体积蛋白酶K或胰蛋白酶溶液混合，使酶终浓度为10 mg/mL，于37°C孵育1小时。未经处理的上清液与等体积Tris–HCl缓冲液混合作为CK1，Tris–HCl缓冲液单独作为CK2，上清液于100°C加热10分钟作为CK3。处理后所有样品于4°C、12,000 × g离心10分钟，上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤。采用上述琼脂孔扩散法评估抗真菌活性。
【数据】酶终浓度：10 mg/mL；孵育：37°C，1h；CK3热处理：100°C，10min；离心：12,000 × g，4°C，10min
2.4 抗真菌活性成分的分子量分级
2.4.1 透析膜预处理
参照Li等方法，截留分子量（MWCO）为1、3.5和10 kDa的纤维素透析膜（Spectra/Por®；Spectrum Laboratories，美国）按以下步骤预处理：在含1 mM EDTA的2%（w/v）NaHCO₃中煮沸10分钟，用蒸馏水冲洗3次，在1 mM EDTA中煮沸5分钟，于4°C保存。使用前用无菌蒸馏水彻底冲洗以去除残留EDTA。
【数据】预处理：2% NaHCO₃ + 1 mM EDTA煮沸10min；1 mM EDTA煮沸5min；保存：4°C
2.4.2 多级透析
采用多级透析将SY01发酵上清液分离为不同分子量组分。无细胞发酵上清液首先装入1 kDa MWCO透析袋，于4°C条件下对50 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5）透析。每8小时更换一次缓冲液，共更换3次。透析外液（<1 kDa）收集为A组分，袋内截留物（>1 kDa）收集为B组分。随后将B组分转移至3.5 kDa MWCO透析袋，于4°C条件下对20 mM Tris–HCl缓冲液（pH 7.5）透析18小时。缓冲液在4小时后更换一次，此后每6小时更换一次，共更换3次。透析外液（1–3.5 kDa）收集为C组分，袋内截留物（>3.5 kDa）收集为D组分。随后将D组分转移至10 kDa MWCO透析袋，于4°C透析12小时，每3小时更换一次缓冲液。透析外液（3.5–10 kDa）收集为E组分，袋内截留物（>10 kDa）收集为F组分。
【数据】透析温度：4°C；MWCO：1、3.5、10 kDa；缓冲液：50 mM/20 mM Tris–HCl（pH 7.5）；换液间隔：8h/4h+6h/3h
研究结果
3.1 发酵条件优化
采用琼脂孔扩散法评估了葡萄糖、Fe²⁺和Mg²⁺添加对B. velezensis SY01发酵上清液抗真菌活性的影响。CK组为在不添加葡萄糖或金属离子的基础LB培养基中培养的SY01。如图1a所示，Fe²⁺处理组中，抗真菌率随Fe²⁺浓度从0.56 mg/L增至2.79 mg/L而升高，在2.79 mg/L时达到最大值59.4%。进一步将Fe²⁺浓度提高至3.91 mg/L则降低了抗真菌活性。根据Tukey HSD检验，图1a中标注不同小写字母的处理间在p ≤ 0.05水平差异显著。
葡萄糖添加方面，抗真菌率随葡萄糖浓度变化而变化（图1b）。在5.00 g/L葡萄糖时观察到最高抗真菌率为75.3%，在所有测试浓度中活性最强。处理间的显著差异以图1b中不同小写字母标示（p ≤ 0.05）。
Mg²⁺添加方面，抗真菌率在36.5 mg/L时达到60.7%（图1c）。与Fe²⁺和葡萄糖处理相比，Mg²⁺处理间的变异较小。Mg²⁺处理与CK组间的统计比较见图1c。CK发酵上清液的抗真菌率为54.6%。
在所有测试的培养基组分中，添加5.00 g/L葡萄糖产生了最高的抗真菌活性。因此，该处理被选用于后续实验，下文简称优化发酵组（YH）。
【数据】CK抗真菌率：54.6%；Fe²⁺最优浓度：2.79 mg/L，抑制率59.4%；葡萄糖最优浓度：5.00 g/L，抑制率75.3%；Mg²⁺最优浓度：36.5 mg/L，抑制率60.7%；统计方法：Tukey HSD，p ≤ 0.05
3.2 抗真菌活性的理化稳定性
3.2.1 蛋白酶处理效应
蛋白酶K和胰蛋白酶处理降低了SY01发酵上清液对C. pyri CXTA 329的抗真菌活性。如图2所示，蛋白酶K和胰蛋白酶处理样品的抑制率分别为35.6%和37.4%，均低于未处理发酵上清液。CK2（Tris–HCl缓冲液）未检测到抗真菌活性，CK3（100°C加热10分钟的SY01发酵上清液）同样未检测到活性。这些结果表明，SY01发酵上清液的抗真菌活性对蛋白酶消化和高温处理敏感，支持蛋白类成分的参与。
【数据】蛋白酶K处理抑制率：35.6%；胰蛋白酶处理抑制率：37.4%；CK2活性：未检出；CK3活性：未检出
3.2.2 热稳定性
不同温度处理后的SY01无细胞发酵上清液抗真菌活性如图3所示。40°C处理的样品保留了与室温对照相似的抗真菌活性。60°C处理后抗真菌活性下降，而80°C处理后仅检测到很少或没有活性。这些结果表明SY01发酵上清液的抗真菌活性具有热敏感性，尤其是在高温处理条件下。
【数据】40°C处理：活性与室温对照相近；60°C处理：活性下降；80°C处理：活性极低或丧失
3.2.3 pH稳定性
SY01无细胞发酵上清液在不同pH条件下的代表性抗真菌活性如图4所示。在pH 7.0时观察到最高抗真菌活性，表明活性成分在中性条件下最稳定。定量测定显示，碱性条件下抗真菌率在pH 8.0时降至39.7%，在pH 10.0时降至20.3%。酸性条件下，抗真菌率在pH 6.0时降至43.6%，在pH 4.0时完全丧失。这些结果表明SY01发酵上清液的抗真菌活性对强酸和强碱条件均敏感，最适活性在近中性pH范围。
【数据】最适pH：7.0；pH 8.0抑制率：39.7%；pH 10.0抑制率：20.3%；pH 6.0抑制率：43.6%；pH 4.0抑制率：0%
3.3 分子量分级与抗真菌活性
采用多级透析将SY01无细胞发酵上清液分离为不同分子量组分，并使用琼脂孔扩散法评估各组分的抗真菌活性。如图5所示，<1 kDa组分（A组分）对C. pyri CXTA 329未显示可见的抗真菌活性。1–3.5 kDa组分（C组分）保留了较弱的抗真菌活性，抑制率为20.4%，而3.5–10 kDa组分（E组分）未检测到活性。相比之下，>10 kDa组分（F组分）保留了与未分级无细胞发酵上清液对照相当强的抗真菌活性。这些结果表明SY01发酵上清液的主要抗真菌活性主要与大于10 kDa的组分相关。
【数据】A组分（<1 kDa）：无活性；C组分（1–3.5 kDa）抑制率：20.4%；E组分（3.5–10 kDa）：无活性；F组分（>10 kDa）：强活性，与未分级对照相当
3.4 蛋白分离与鉴定
3.4.1 SDS-PAGE分析
采用SDS-PAGE比较不同处理组>10 kDa组分的蛋白条带图谱。分析进一步将活性分子量范围缩小至18–55 kDa，多个蛋白条带在优化发酵组中特异性富集。如图6所示，YH样品在18–55 kDa范围内呈现丰富的蛋白条带分布，包含多条清晰条带，提示具有潜在抗菌活性的中分子量蛋白得到富集。相比之下，对照组——即CK1（离心和透析后的发酵上清液）、CK2（经0.22 μm膜过滤未经热处理、随后离心和透析的无细胞上清液）和CK3（经0.22 μm膜过滤未经pH调节、随后离心和透析的无细胞上清液）——蛋白条带较少且强度较弱，主要条带约在23、30和55 kDa处检出。在优化发酵条件下，YH组（添加5.00 g/L葡萄糖并经0.22 μm过滤和透析处理）的蛋白条带数量和强度均显著增加。这些发现与多级透析结果一致，表明抗真菌活性主要与含胞外蛋白相关组分的>10 kDa部分相关。这为后续蛋白鉴定和功能分析奠定了基础。
【数据】活性分子量范围：18–55 kDa；YH组：条带丰富；CK1/CK2/CK3主要条带：约23、30、55 kDa
3.4.2 蛋白鉴定与质量控制
BCA蛋白定量显示，优化发酵组（YH）的胞外总蛋白浓度为CK组的1.82倍。LC-MS/MS分析在YH组中鉴定出221个蛋白和439条肽段，而CK组中鉴定出123个蛋白和279条肽段。因此，YH组鉴定到的蛋白数和肽段数分别为CK组的1.80倍和1.57倍。蛋白和肽段使用MaxQuant软件检索UniProt中B. velezensis参考蛋白质组数据库进行鉴定，肽段和蛋白水平的FDR均控制在0.01以下。质量控制分析显示，肽段质量偏差主要分布在±20 ppm以内，多数鉴定肽段长度为7–30个氨基酸。多数蛋白的序列覆盖度超过10%。此外，89.4%的蛋白由至少2条唯一肽段支持，37.6%的蛋白由至少5条唯一肽段支持。
【数据】YH总蛋白浓度/CK：1.82倍；YH鉴定蛋白数：221个；YH鉴定肽段数：439条；CK鉴定蛋白数：123个；CK鉴定肽段数：279条；蛋白数倍数：1.80倍；肽段数倍数：1.57倍；FDR：<0.01；质量偏差：±20 ppm；肽段长度：7–30 aa；≥2条唯一肽段支持的蛋白占比：89.4%；≥5条唯一肽段支持的蛋白占比：37.6%
3.4.3 CK与YH样品间唯一肽段支持度比较
CK组与YH组间唯一肽段计数的比较显示，鉴定蛋白的肽段支持度存在明显差异。如图7所示，位于y = x参考线下方的蛋白在YH组中的唯一肽段数高于CK组，而位于线上方的蛋白在CK组中具有更高的唯一肽段数。包括groEL、fusA、pnpA和sodA在内的多个蛋白在YH组中表现出更高的肽段支持度，表明这些蛋白在优化发酵样品中得到了更强的呈现。相比之下，hag和pruA等蛋白在CK组中表现出更高的唯一肽段支持度。
【数据】YH组高支持度蛋白：groEL、fusA、pnpA、sodA；CK组高支持度蛋白：hag、pruA
3.5 差异丰度蛋白分析
如图8所示，对CK组与YH组间差异丰度蛋白进行层次聚类热图分析。蛋白丰度基于肽段峰强度总和进行相对定量。分析纳入Score ≥ 20且在YH组中丰度较高的蛋白。热图显示，YH组中多个蛋白的表达模式与CK组明显不同，进一步证实了葡萄糖优化对胞外蛋白组的显著影响。
【数据】筛选标准：Score ≥ 20且YH组丰度较高
讨论与解读
芽孢杆菌属的生物防治涉及多种机制，包括环脂肽产生、水解酶分泌、营养与生态位竞争、生物膜形成以及诱导宿主抗性等。surfactin、iturin、fengycin和bacillomycin D等环脂肽被广泛认为是芽孢杆菌生防系统中的主要抗真菌代谢物。然而，本研究的多个独立观察结果表明，胞外蛋白类物质与B. velezensis SY01对C. pyri CXTA 329的抗真菌活性密切相关：蛋白酶K和胰蛋白酶处理后抗真菌活性下降；主要活性保留在>10 kDa组分中；富集蛋白条带主要分布在18–55 kDa之间；LC-MS/MS分析也鉴定到多种酶相关候选蛋白。这一发现值得关注——以往对贝莱斯芽孢杆菌的研究主要集中于低分子量次级代谢产物（尤其是环脂肽）作为主要抗真菌因子。这些化合物通常通过改变膜通透性和完整性来破坏真菌细胞膜。相比之下，SY01的抗真菌活性对蛋白酶处理、高温和极端pH敏感，更符合蛋白类抗真菌因子的特征。这些结果表明，胞外蛋白或蛋白复合物可能参与了苹果腐烂病病原菌的抑制过程。
编译者解读
该研究的方法学链条——发酵优化→理化表征→分级透析→SDS-PAGE→LC-MS/MS——为挖掘生防菌中的蛋白类活性因子提供了可复制的技术路径。将活性范围锁定在>10 kDa且18–55 kDa区间，并借助蛋白质组学锁定groEL、sodA等候选蛋白，为后续基因敲除或异源表达验证指明了方向。值得注意的是，作者在讨论中坦诚指出候选蛋白与抗真菌活性之间目前仅为相关性证据，直接功能验证尚待开展。若后续能结合蛋白纯化回补实验或基因突变体表型分析，将有望把这些候选蛋白转化为苹果腐烂病绿色防控的真正武器。
参考来源
期刊：Physiological and Molecular Plant Pathology, 2026
DOI: 10.1016/j.pmpp.2026.103330
DOI: 10.1016/j.pmpp.2026.103330