来源：Optimization of combined germination and co-culture solid-state fermentation for glucosinolate reduction and metabolomic profiling of moringa seed flour（LWT）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
辣木籽粉营养丰富，但高含量硫代葡萄糖苷带来的苦味严重制约了其在食品工业中的应用。本研究将萌发与米曲霉—黑曲霉共培养固态发酵串联，借助Box–Behnken设计与响应面法系统优化工艺参数。在最优条件下（萌发8天、发酵4天、菌种比2:1），硫代葡萄糖苷含量下降约62.9%，黑芥子酶活性提升5.53倍。非靶向LC-MS代谢组学分析鉴定出67种代谢物，揭示萌发主要富集氨基酸，发酵则深刻重塑脂质与次生代谢通路。
研究背景
辣木（Moringa oleifera）原产于印度喜马拉雅山麓，因对干旱及半干旱气候的非凡适应性而在全球广泛种植。其种子富含蛋白质、维生素、矿物质及脂肪酸、生育酚、酚类等生物活性成分，被视为极具潜力的食品强化原料。然而，硫代葡萄糖苷赋予的强烈苦味严重影响了消费者接受度，限制了辣木籽的商业化应用。萌发与发酵作为两种传统的生物加工手段，均已被证实可单独促进辣木籽苦味物质的降解。本研究将两种工艺串联，以硫代葡萄糖苷降解率和黑芥子酶活性为响应指标，系统优化萌发时间、发酵时间及双菌共培养比例，并对最优工艺样品开展非靶向代谢组学分析，以全面评估加工过程对代谢物谱的塑造作用。
研究方法
2.1 材料
辣木（Moringa oleifera Lam.）种子购自泰国那空叻差是玛府Dan Khun Thot县Dan Nok街道Ban Dan Nok村的当地农业供应商（15.1764° N, 101.8347° E）。供应商将该植物材料称为"Kaset Tawai"。种子为商业采购，供应商未提供正式登记品种或凭证标本信息，植物材料依据供应商提供的信息进行鉴定。因材料为商业购买，无需特定采集许可。成熟种子在室温下储存至使用。米曲霉（Aspergillus oryzae, AO）与黑曲霉（Aspergillus niger, AN）菌株来自KMITL食品科学与技术实验室菌种保藏库。使用的化学试剂包括：370 g/L盐酸（RCl Labscan，爱尔兰）、四氯钯酸钠（Sigma-Aldrich，美国）、黑芥子苷（Sigma-Aldrich，美国）、Folin-Ciocalteu试剂（Carlo Erba，法国）、γ-氨基丁酸（Sigma-Aldrich，美国）、没食子酸（Sigma-Aldrich，美国）、鞣酸（Fluka，瑞士）、Trolox（Sigma-Aldrich，美国）、2,4,6-三吡啶基-s-三嗪（Sigma-Aldrich，美国）及2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（Sigma-Aldrich，美国）。
【数据】种子产地：泰国那空叻差是玛府（15.1764° N, 101.8347° E）；盐酸浓度：370 g/L；菌株：米曲霉、黑曲霉（KMITL食品科学与技术实验室）
2.2 样品制备
#### 2.2.1 辣木籽萌发
辣木籽萌发参照Saa等（2022）的方法并加以修改。辣木种子首先剥离白色表面种皮（外种皮），用自来水清洗，然后以种子与蒸馏水1:6（w/v）的比例浸泡24小时，浸泡水每2小时更换一次以防止发酵。浸泡后将种子沥干，置于带孔容器中以尽量减少多余水分。萌发在黑暗环境中、室温（30°C）、70%相对湿度下分别孵育4天、6天或8天。萌发结束后，种子在热风干燥箱（Binder，德国）中于60°C干燥，手工脱壳，用研磨机（Panasonic，泰国）粉碎，过450 μm不锈钢筛（Endecotts Ltd.，英国）以获得均匀粒径。所得萌发辣木籽粉随后按Box-Behnken设计优化的条件进行发酵。萌发种子在发酵前粉碎，以提供具有更大表面积的均质底物，从而增强固态发酵过程中微生物的定殖并改善酶对底物的可及性。此外，在粉状物料上进行发酵，以更好地代表其作为食品配料的预期用途。
【数据】浸泡比例：种子:水=1:6 (w/v)；浸泡时间：24h（每2h换水）；萌发温度：30°C；萌发时间：4/6/8天；相对湿度：70%；干燥温度：60°C；筛网孔径：450 μm
#### 2.2.2 辣木籽发酵
采用米曲霉（AO）与黑曲霉（AN）共培养体系对预先制备的萌发辣木籽粉进行固态发酵（SSF）。发酵条件通过Box-Behnken方法选定。操作流程为：称取5 g萌发辣木籽粉，加入0.5 mL蒸馏水调节水分含量。混合物在高压灭菌锅（Tomy，日本）中于121°C灭菌15分钟。灭菌后样品冷却，以三种比例接种共培养孢子悬液：AO:AN 1:2、AO:AN 1:1和AO:AN 2:1，最终孢子浓度均为1.5 × 10⁶孢子/g底物。微生物浓度及共培养比例基于前期研究（Puspitasari等，2024）确定，该研究证实在相似加工条件下固态发酵辣木籽粉可获得良好的发酵性能与硫代葡萄糖苷降解效果。所选接种量被认为足以支持整个发酵过程中微生物的生长和酶活性。随后将接种样品在培养箱（Accuplus，泰国）中分别孵育不同时长（2天、3天或4天）进行发酵。发酵结束后，辣木籽粉在烘箱中于60°C干燥24小时，粉碎过筛。发酵粉密封于聚乙烯袋中，置于密闭容器内，于−20°C保存至进一步分析，以减少储存期间的生化与微生物变化。
【数据】样品量：5 g；加水量：0.5 mL；灭菌：121°C，15 min；孢子浓度：1.5 × 10⁶孢子/g；菌种比例：AO:AN 1:2、1:1、2:1；发酵时间：2/3/4天；干燥：60°C，24h；储存温度：−20°C
2.3 优化方法
萌发-发酵工艺优化采用RSM结合Box-Behnken设计（BBD）的系统方法。BBD适用于受限实验范围内涉及生物过程的优化研究。所选因素包括萌发时间、发酵时间和共培养比例，需要受控的实验条件以维持处理过程中工艺的稳定性和生物可行性。此外，BBD避免了极端因子水平的实验组合，从而最大限度地降低了在萌发和发酵过程中可能对微生物活性、种子品质或工艺一致性产生不利影响的条件出现的可能性。同时，BBD能高效估计二次响应曲面并减少优化所需的实验次数。本方法考察三个自变量：萌发时间（X1）、发酵时间（X2）以及米曲霉与黑曲霉的共培养比例（X3），如表1所示。萌发时间（X1）和发酵时间（X2）被选为自变量，是因为它们对黑芥子酶活性和硫代葡萄糖苷降解有显著影响，而这两者是本优化研究的主要响应目标（Liu等，2025；Puspitasari等，2024）。此外，这些处理可能影响微生物代谢及萌发和发酵种子材料中生物活性化合物的形成（Coello等，2020；Liu等，2025）。所选实验范围基于初步实验及前期研究报告的有效加工时长确定，这些报告证实了加工时长对改善种子基质营养与功能特性的作用（Puspitasari等，2024）。加工时间过短可能限制生化修饰，而处理时间过长则可能对产品质量和工艺稳定性产生不利影响。实验框架旨在评估这些因素对工艺结果的综合影响。根据Box-Behnken矩阵，共进行15次实验运行，以有效探索因子相互作用及其对目标响应的影响，详见表S1。实验运行按照RSM模型生成的Box-Behnken设计进行，包含重复中心点。每项响应的分析测量均进行三次重复。此外，在优化工艺条件下的验证实验独立进行三次重复，结果以平均值±标准差表示。总硫代葡萄糖苷含量和黑芥子酶活性被选为主要优化响应，因为硫代葡萄糖苷被认为是辣木籽中主要的抗营养化合物，且与其特征性苦味密切相关，可能限制其在食品应用中的广泛使用（Coello等，2021, 2022）。此外，所采用的生物加工处理——即萌发和发酵——已知通过黑芥子酶介导的酶促水解反应直接影响硫代葡萄糖苷代谢。作为参与硫代葡萄糖苷降解的关键酶，黑芥子酶活性为加工过程中硫代葡萄糖苷生物转化的程度提供了重要信息（Puspitasari等，2024；Tie等，2020）。因此，总硫代葡萄糖苷含量和黑芥子酶活性被认为是最关键的优化响应指标。
【数据】实验设计：Box-Behnken设计（RSM）；自变量：萌发时间(X1)、发酵时间(X2)、共培养比例(X3)；实验运行次数：15次；重复：响应测量3次、验证实验3次（结果以均值±标准差表示）
2.4 代谢组学分析（原文未详述具体步骤）
对最优条件下制备的萌发-发酵辣木籽粉（GFMSF）进行非靶向LC-MS代谢组学分析。代谢物经数据过滤后共鉴定出67种。差异代谢物分析及通路富集分析基于HMDB注释进行。
【数据】代谢物鉴定数量：67种（数据过滤后）
研究结果
本研究分多个阶段进行：第一阶段为萌发处理，设三个萌发时间水平；第二阶段为固态发酵（SSF）处理，同时考虑三个发酵时间水平和三个真菌菌株比例水平；随后进行优化，以确定在总硫代葡萄糖苷降低和黑芥子酶活性方面产生最有利响应的条件；最后对最优条件下制备的萌发-发酵辣木籽粉（GFMSF）进行进一步表征分析。本研究的主要目标是优化辣木籽中硫代葡萄糖苷含量的降低和黑芥子酶活性的增强，因为这两者都是影响种子苦味的关键参数。众所周知，萌发和发酵工艺各自均可促进辣木籽苦味的降低。本节讨论的萌发和SSF过程的视觉结果分别如图1和图S1所示。将这两种生物工艺整合可进一步增强由硫代葡萄糖苷化合物降解驱动的苦味降低效果。本研究深入探究了萌发时长、发酵时长和真菌菌株比例这三个关键因素，以确定实现预期目标的最优条件。
3.1 RSM模型建立
RSM用于建立精确描述自变量与对应响应之间关系并将其可视化的数学模型。通过深入理解响应曲面拓扑结构，可确定实现最佳响应的最优条件。本研究采用Box-Behnken设计为萌发和发酵过程建立优化模型，涉及三个自变量：萌发时间（X1）、发酵时间（X2）和共培养比例（X3）。选定的响应变量为总硫代葡萄糖苷含量和黑芥子酶活性。Box-Behnken设计获得的实验响应如表2所示。在不同的萌发时间、发酵时间和共培养比例组合下，总硫代葡萄糖苷含量范围为33.209 ± 0.113至57.147 ± 0.726 μmol/g，黑芥子酶活性范围为13.16 ± 0.14至16.67 ± 0.36 nkat/g。值得注意的是，最低硫代葡萄糖苷含量和最高黑芥子酶活性在同一种实验条件下获得，表明该加工变量组合在所测试条件中与最有利的响应相关。这些变异支持应用RSM建立描述加工变量与所选响应之间关系的预测数学模型，并确定最优加工条件。实验数据由包含自变量线性项、二次项和交互项的二阶多项式模型充分拟合。预测方程展示了观测响应值与自变量之间的关系，详见表S2。采用方差分析（ANOVA）在95%置信水平下识别对目标响应具有统计学显著影响的因素（表S3）。两个响应均观察到显著的失拟（p ≤ 0.05），表明二次模型在完全捕捉数据变异性方面存在一定局限性。尽管如此，该模型对两个响应均显示出超过98.62%的高R²值和大于96.12%的调整后R²值。R²与调整后R²的接近表明该模型在统计学上稳健，能够充分代表不同条件下总硫代葡萄糖苷和黑芥子酶活性的变异。因此，尽管失拟值得关注，但该模型仍被认为可适用于实际目的，因为它解释了超过90%的数据变异性。此外，表S3中呈现的平均绝对偏差分析（AADM）和偏差因子（Bf）值进一步支持了所开发模型的预测性能。总硫代葡萄糖苷和黑芥子酶活性获得的AADM值均为0.00，相应的Bf值均为1.00，表明预测响应与实验响应之间具有极好的一致性，预测误差可忽略不计。这些发现进一步证实了所开发模型在选定加工条件下预测目标响应的准确性、稳健性和可靠性（Saah等，2020）。
【数据】总硫代葡萄糖苷范围：33.209 ± 0.113 ~ 57.147 ± 0.726 μmol/g；黑芥子酶活性范围：13.16 ± 0.14 ~ 16.67 ± 0.36 nkat/g；R²：>98.62%；调整R²：>96.12%；AADM：0.00；Bf：1.00
3.2 萌发-发酵联合工艺对辣木籽粉总硫代葡萄糖苷的影响
图S2展示了萌发时间（X1）、发酵时间（X2）和共培养比例（X3）对总硫代葡萄糖苷含量的单独及联合效应的响应曲面图。尽管RSM分析未显示自变量间双向交互作用的统计学显著性（p > 0.05），但曲面图仍为所研究加工条件下的响应趋势提供了有价值的信息。首先评估各加工变量对总硫代葡萄糖苷含量的单独效应，以确定各因素对观测响应的相对贡献。在所考察的变量中，发酵时间（X2）对总硫代葡萄糖苷降解的影响最大。将发酵时间从2天延长至4天，总硫代葡萄糖苷含量从57.0–59.4 μmol/g逐步降至33.0–35.4 μmol/g（图S2A）。相比之下，萌发时间（X1）对硫代葡萄糖苷降解的影响相对较小，反映在沿X1轴近乎平坦的曲面上（图S2A和S2B）。同样，共培养比例（X3）在所研究范围内对硫代葡萄糖苷含量仅表现出适度的单独效应（图S2B），表明单独改变接种比例对硫代葡萄糖苷降解的影响相对有限。响应曲面图进一步揭示了因子交互作用对总硫代葡萄糖苷含量的影响。尽管在拟合的二次模型中没有任何交互项达到统计学显著性（p > 0.05），但响应曲面仍有助于可视化响应趋势并识别与相对较高或较低硫代葡萄糖苷含量相关的加工变量组合。萌发时间（X1）与发酵时间（X2）之间的交互作用（图S2A）证实硫代葡萄糖苷降解主要由发酵时间（X2）控制，而延长萌发时间仅导致响应的微小变化。类似地，萌发时间（X1）与共培养比例（X3）之间的交互作用（图S2B）仅引起硫代葡萄糖苷含量的轻微变化，表明这些变量在所研究的加工条件下产生的联合效应有限。相比之下，发酵时间（X2）与共培养比例（X3）之间的交互作用（图S2C）表现出更明显的响应趋势。尽管相应的交互项在拟合的二次模型中未达到统计学显著性，但响应曲面表明，较低的硫代葡萄糖苷含量始终与较长的发酵时间和较高的共培养比例相关。具体而言，当发酵时间（X2）为2天且共培养比例（X3）为1.0时，硫代葡萄糖苷含量保持在相对较高水平（57.0–59.4 μmol/g）；而当发酵时间（X2）延长至4天且共培养比例（X3）提高至2.0时，硫代葡萄糖苷含量降至33.0–35.4 μmol/g。发酵时间的主导影响可能归因于米曲霉和黑曲霉的持续生长和代谢活动，这为酶促降解硫代葡萄糖苷提供了充足的时间窗口。
【数据】发酵2天硫代葡萄糖苷：57.0–59.4 μmol/g；发酵4天硫代葡萄糖苷：33.0–35.4 μmol/g；交互作用：p > 0.05（不显著）
3.3 最优条件验证与代谢组学分析
基于RSM模型预测，最优工艺条件为：萌发时间8天、发酵时间4天、AO:AN共培养比例2:1，整体期望值（desirability）为1。在此条件下进行验证实验，硫代葡萄糖苷含量较未处理原料降低约62.9%，黑芥子酶活性提升5.53倍。对最优条件下制备的GFMSF样品进行非靶向LC-MS代谢组学分析，经数据过滤后共鉴定出67种代谢物。图2展示了LC-MS检测代谢物的组合热图与层次聚类分析结果，比较了萌发辣木籽粉（GMSF）、发酵辣木籽粉（FMSF）和萌发-发酵辣木籽粉（GFMSF）三组样品的代谢物谱差异。
图3展示了样品间差异代谢物的火山图与模式分析结果。火山图分别比较了（A）FMSF与GMSF、（B）GMSF与GFMSF以及（C）FMSF与GFMSF之间的差异代谢物。模式分析（D）显示了GMSF与GFMSF之间代谢物丰度的方向性变化。萌发处理主要促进了氨基酸的积累，而发酵处理则诱导了脂质和次生代谢途径的显著变化，产生了独特的代谢组学特征。
图4展示了使用单因素方差分析（ANOVA）结合错误发现率（FDR）校正鉴定显著变化代谢物的结果。
图5展示了基于HMDB注释的25种显著代谢物的代谢通路富集分析概览。
【数据】最优条件：萌发8天、发酵4天、AO:AN=2:1；期望值：1；硫代葡萄糖苷降低：约62.9%；黑芥子酶活性提升：5.53倍；代谢物鉴定：67种；显著代谢物：25种（用于通路富集分析）
讨论与解读
本研究证明，将萌发与共培养固态发酵相结合是改善辣木籽粉生化品质的有效生物加工策略。结果表明，序贯式生物处理可协同调节酶活性和微生物代谢，从而实现对关键生物活性成分和抗营养成分更有利的转化。除统计优化外，研究结果还强调了整合生物过程以实现食品功能定向改善的重要性，特别是在降低苦味化合物的同时增强代谢物多样性。总体而言，该研究为如何利用受控生物加工增强植物基材料在食品应用中的功能特性提供了见解。本研究的主要局限性在于其实验室受控条件下开展，未来需进一步评估工业化条件下的可放大性、工艺稳定性以及实际食品体系中的感官接受度。
【编译者解读】该研究将萌发与双菌共培养固态发酵串联，以黑芥子酶活性为桥梁指标，巧妙地将"酶促降解硫代葡萄糖苷"这一核心机制贯穿于工艺优化全过程。62.9%的降解率与5.53倍的酶活提升表明生物加工协同策略在脱苦方面具有显著潜力。代谢组学数据进一步揭示萌发与发酵分别作用于氨基酸代谢和脂质/次生代谢，为理解工艺-品质关联提供了分子层面的证据。然而，实验室规模到工业化放大的跨越仍需解决发酵均匀性、规模化灭菌能耗及终产品风味可接受性等工程与感官难题。后续研究可考虑将降解产物（如异硫氰酸酯）的功能活性纳入评价体系，以更全面地权衡脱苦处理对辣木籽营养价值的整体影响。
参考来源
Puspitasari, C. (2026). Optimization of combined germination and co-culture solid-state fermentation for glucosinolate reduction and metabolomic profiling of moringa seed flour. LWT, 2026. DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119846
DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119846