来源：Multi-objective optimization of solid-state fermentation using agro-industrial by-products: Integrating multivariate analysis and desirability functions for enhanced feed value（Food and Bioproducts Processing）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
农产品加工副产物（麦麸、大豆皮、啤酒糟）富含木质纤维素，但直接作为反刍动物饲料的营养价值有限。本研究以黑曲霉和米曲霉共固态发酵为核心，整合分泌蛋白组学、主成分分析（PCA）与多目标期望函数，系统预测并优化发酵性能。结果显示，优化配比（56%麦粉副产物、18%大豆皮、26%啤酒糟）使粗蛋白从15%提升至22%，体外干物质消化率达75%，纤维组分显著降低，为低值副产物转化为高蛋白饲料添加剂提供了可预测的技术框架。
研究背景
反刍动物生产的提质增效越来越依赖功能性饲料创新。改善瘤胃微生物发酵是优化纤维降解和能量产出的核心。利用富含蛋白质、矿物质、维生素、益生元、益生菌和酶的饲料原料（包括谷物、牧草及农产品加工副产物）已被广泛认为是提升日粮品质的有效途径。其中，补充真菌生物质和发酵残渣可改善反刍动物的消化率、蛋白质可利用性和微量元素谱。将生物质作为资源加以利用，符合联合国可持续发展目标第12项（负责任的消费和生产）所倡导的原则，是减少废弃物产生、恢复自然资本、强化循环生物经济的重要策略。以丝状真菌发酵农产品加工副产物，可产生真菌代谢产物和多种水解酶，从而提升底物的营养价值和可消化性。
研究方法
化学试剂与底物
榉木木聚糖购自爱尔兰Megazyme公司。羧甲基纤维素、淀粉、对硝基苯丁酸酯（p-NPB）、3,5-二硝基水杨酸（DNS）、D-木糖、D-葡萄糖、二喹啉甲酸、偶氮酪蛋白和牛血清白蛋白均购自美国Sigma公司（St. Louis, MO, USA）。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、蛋白胨和葡萄糖购自阿根廷Biopack公司。啤酒糟（BSG）和大豆皮（SH）分别由Wallace Brewing S.A.和Molinos Río de la Plata S.A.惠赠（阿根廷罗萨里奥）。麦粉加工副产物（WF）由Moliser S.A.惠赠（阿根廷Venado Tuerto）。
【数据】试剂来源：Megazyme、Sigma、Biopack；底物来源：Wallace Brewing S.A.、Molinos Río de la Plata S.A.、Moliser S.A.；原文未详述具体批号
底物制备
所有木质纤维素底物均经实验室粉碎机（Mod. TDMC, TecnoDalvo, Argentina）粉碎，过40目筛，最后于−20°C储存。真菌发酵前，按不同比例均匀混合各组分（表1）。参考混合物（系统A）由SH和WF组合而成，该配比在本实验室前期工作中已优化（Morilla et al., 2023a）。系统B、C、D的底物组成中BSG比例逐步增加，SH和WF相应减少。
【数据】粉碎设备：TDMC粉碎机；筛网：40目；储存温度：−20°C；系统A含SH和WF；系统B/C/D中BSG递增
微生物与接种物制备
黑曲霉NRRL3菌株由美国农业部农业研究服务部菌种保藏中心提供。米曲霉NRRL695菌株由美国国家农业利用研究中心（ARS）提供。菌株保存于−20°C的10%（w/v）甘油中。分生孢子活化方式为：将各微生物接种于PDA培养基的锥形瓶中，30°C培养5天。无性繁殖体通过添加15 mL无菌蒸馏水收获。所得悬浮液稀释至目标浓度，作为母悬浮液保存。接种物浓度采用Neubauer计数板按Grigoryev所述方法测定（Taddia et al., 2019）。
【数据】菌株：A. niger NRRL3、A. oryzae NRRL695；保存条件：−20°C、10%甘油；活化温度：30°C；活化时间：5天；收获水量：15 mL
真菌兼容性与共培养评价
黑曲霉与米曲霉间的真菌互作在PDA及含底物培养基（WF、SH、BSG及系统A-D配方）上评估。各菌种的分生孢子悬浮液（5 µL，1×10⁶孢子/mL）以40 mm间距接种于琼脂平板，30°C培养10天。种间互作按Skidmore和Dickinson（1976）及Stahl和Christensen（1992）的标准评价。黑曲霉与米曲霉间的拮抗活性采用微量肉汤稀释法评估，该方法改编自CLSI丝状真菌药敏试验指南，此前已应用于Giacone等人（2020）的相关抗真菌活性测定。单培养发酵的无细胞上清液经收集、离心（8000 rpm，20 min，4°C）、补充葡萄糖（2% w/v）和蛋白胨（1% w/v）、过滤除菌（0.22 µm）后，在96孔微量培养板中进行系列稀释，以测定对另一真菌菌种的最低抑菌浓度（MIC）。平板于30°C培养4天，MIC定义为抑制可见生长的最低提取物浓度（Morilla et al., 2023b）。真菌生物量通过蛋白质提取和分光光度法测定定量，使用真菌蛋白提取物系列稀释生成的标准曲线。
【数据】接种量：5 µL，1×10⁶孢子/mL；间距：40 mm；培养温度：30°C；培养时间：10天；离心条件：8000 rpm、20 min、4°C；葡萄糖：2% w/v；蛋白胨：1% w/v；滤膜：0.22 µm；MIC测定培养：30°C、4天
真菌毒素测定
发酵生物质采用酶免疫分析法（RIDASCREEN® FAST试剂盒，R-Biopharm，德国）按制造商说明筛选四种主要真菌毒素，包括黄曲霉毒素（检出限：1.7 µg/kg）、伏马菌素（222 µg/kg）、玉米赤霉烯酮（50 µg/kg）和赭曲霉毒素A（2.5 µg/kg）。
【数据】黄曲霉毒素检出限：1.7 µg/kg；伏马菌素：222 µg/kg；玉米赤霉烯酮：50 µg/kg；赭曲霉毒素A：2.5 µg/kg
固态发酵
固态发酵在用作生物反应器的120 mL玻璃容器中进行。装有4 g均匀混合物（表1）的反应器经灭菌处理。可发酵底物用10 mL无菌水润湿，无菌条件下接种分生孢子悬浮液，浓度为1×10⁶孢子/mL。接种物为混合真菌孢子群体，含25%黑曲霉和75%米曲霉。菌株同时共接种入底物，30°C培养4天。无菌条件下每日监测真菌定殖和菌丝生长。培养结束后，向每个反应器加入30 mL蒸馏水提取固态发酵产物。固态发酵系统在轨道摇床上以140 rpm振荡30 min，3200 rpm离心5 min以去除真菌菌丝体，然后经0.45 µm膜过滤。上清液称为酶提取物，保存于−20°C备用。
【数据】反应器容积：120 mL；底物量：4 g；水量：10 mL；接种浓度：1×10⁶孢子/mL；菌种比例：25% A. niger + 75% A. oryzae；培养温度：30°C；培养时间：4天；提取水量：30 mL；振荡：140 rpm、30 min；离心：3200 rpm、5 min；滤膜：0.45 µm；储存：−20°C
酶活性测定
淀粉酶（AE）、纤维素酶（CE）、木聚糖酶（XE）和脂肪酶（LE）在上清液中定量测定，作为木质纤维素降解能力的指标。榉木木聚糖（1% w/v）、羧甲基纤维素（1% w/v）和淀粉（1% w/v）溶液分别与酶提取物在50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.30）中、50°C孵育10 min，以测定XE（Bailey et al., 1992）、CE（Ghose, 1987）和AE（Hernández et al., 2006）活性。孵育后释放的还原基团用DNS法测定（Solís-Pereira et al., 1993）。各样品吸光度在560 nm处测量（Miller, 1959）。一个酶活性单位定义为每分钟释放1 µmol还原糖当量所需的酶量（μmol sugar/min）。脂肪酶活性按Pliego等人（2015）的方法测定。使用底物pNPB（无色），被酶水解产生对硝基苯酚（黄色），其生成量通过415 nm处吸光度在30°C下随时间测量10 min。一个酶活性单位定义为在测试条件下每分钟释放1 µmol pNPB所需的酶量（μmol pNPB/min）。蛋白酶活性采用De Castro和Sato（2013）所述基于偶氮酪蛋白的方法测定并加以修改。反应混合物含偶氮酪蛋白（1% w/v）、20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.00）和酶提取物，于37°C孵育30 min，加入TCA（10% w/v）终止反应，5500 rpm离心15 min。上清液用1.8 N NaOH中和，在420 nm处测量吸光度。一个蛋白水解活性单位定义为在所选实验条件下每秒产生一个吸光度单位增加所需的酶量。分泌的总胞外蛋白采用Smith等人（1985）描述的二喹啉甲酸法测定，以牛血清白蛋白为标准蛋白。上述所有测定均设三次重复。酶活性以每克可发酵底物的单位数（U/g）表示。
【数据】底物浓度：1% w/v（木聚糖/CMC/淀粉）；缓冲液：50 mM柠檬酸盐，pH 5.30；反应温度：50°C；反应时间：10 min；检测波长：560 nm；脂肪酶底物：pNPB；检测波长：415 nm；反应温度：30°C；时间：10 min；蛋白酶底物：偶氮酪蛋白1% w/v；缓冲液：20 mM Tris-HCl pH 8.00；温度：37°C；时间：30 min；终止剂：TCA 10% w/v；离心：5500 rpm、15 min；中和：1.8 N NaOH；波长：420 nm；重复：三次
葡萄糖和还原糖测定
葡萄糖浓度使用商业酶法测定试剂盒（Enzymatic Glycemia AA, Liquid Line, Wiener Lab）测定。还原糖采用DNS法定量（Solís-Pereira et al., 1993）。
【数据】葡萄糖试剂盒：Enzymatic Glycemia AA；还原糖法：DNS法
Nano LC-MS/MS分析
酶提取物采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）表征。为将蛋白质浓缩为单一电泳条带，样品经SDS-PAGE（12.5% w/v聚丙烯酰胺）电泳，进入分离胶约1 cm。后续蛋白质组学分析流程详见原文补充材料。
【数据】SDS-PAGE：12.5% w/v聚丙烯酰胺；电泳距离：约1 cm
研究结果
主成分分析：变量关系与空间分布
对44个测量变量进行主成分分析，四个发酵系统间呈现清晰分化。前两个主成分解释了总方差的91.8%（PC1：63.0%，PC2：28.8%）。图1a展示了对方差贡献最大的25个变量的双标图，呈现PC1-PC2空间中的主要功能关系。
PC1主要依据发酵效率和酶输出区分系统。系统B的PC1得分最高，表现为高酶活性（纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶）、最大真菌丰度（黑曲霉、米曲霉）和高分泌蛋白产量。相比之下，系统D的PC1得分为负，对应较低的酶性能和较高的残余纤维含量（发酵后纤维素、半纤维素、木质素）。PC2反映底物组成差异。系统A的PC2正值高，对应发酵前纤维含量（NDF、ADF、纤维素、半纤维素、木质素）和矿物质/氮组分（Ca、总蛋白、非蛋白氮）较高。系统B、C、D聚集在PC2负值区域，表明其初始底物组成更有利于酶活性和产物形成。
变量向量间的角度相关分析识别出570个显著关系：184个强正相关（30–45°角）、150个中等正相关（45–60°）、118个强负相关（135–150°）和118个中等负相关（120–135°）。这些相关揭示了发酵过程与底物结构组成之间的功能拮抗。最强的正相关出现在半纤维素酶分泌组与米曲霉基因组覆盖率之间（30°），确认了真菌对纤维降解酶产生的直接贡献。其他显著强正相关包括：蛋白酶与植酸酶分泌组（30.7°），表明这两种酶的共调控分泌；发酵后钙与植酸酶分泌组（30.9°），将矿物质可利用性与植酸酶活性联系起来；发酵前纤维素与黑曲霉覆盖率（31°），确认底物驱动真菌定殖；发酵前总蛋白与钙（32.2°），反映初始底物组成关联。中等正相关包括米曲霉覆盖率与纤维素酶活性（45.4°）、发酵后IVDMD与其他分泌组蛋白（45.4°），提示最终消化率与分泌组蛋白组成相关，而不仅限于直接酶活性。
强负相关有效证实了纤维降解：发酵后ADF与总分生孢子丰度（149.6°）、发酵后半纤维素与蛋白酶活性（149°）、发酵后总蛋白与发酵前还原糖（148.9°）。淀粉酶分泌组与米曲霉覆盖率之间的负相关（149.9°）表明该酶相对于其他分泌组组分存在差异调控。发酵后NDF与纤维素酶分泌组（134.8°）及发酵前IVDMD与黑曲霉覆盖率（134.8°）之间的中等负相关进一步证实了初始消化率与真菌定殖需求之间的拮抗关系。
PC1-PC2空间中变量的空间分布形成四个不同的功能簇（图1a所示的主要贡献变量）。右上区域（PC1+，PC2+）聚集了15个与初始底物结构和早期真菌分泌组相关的变量，包括发酵前纤维组分（NDF、ADF、ADL、纤维素、半纤维素、木质素）、分泌的纤维降解酶（纤维素酶、半纤维素酶分泌组）、真菌基因组覆盖率（黑曲霉、米曲霉）以及矿物质/氮组分（Ca、总蛋白、非蛋白氮）。共定位表明富含纤维的底物促进真菌定殖和早期分泌组产生。左上区域（PC1−，PC2+）集中了8个代表发酵后残留组成的变量：未降解纤维（发酵后NDF、ADF、ADL、纤维素、半纤维素、木质素）、发酵前IVDMD和发酵后非蛋白氮。该簇表征低效发酵和顽固性结构组分的高保留。左下区域（PC1−，PC2−）聚集了7个与降解产物和蛋白质含量相关的变量：发酵前还原糖和葡萄糖、分泌组蛋白（淀粉酶、其他蛋白）、粗蛋白（发酵前和发酵后），以及关键的发酵后IVDMD。最终消化率与直接酶活性之间的负相关表明，预先存在的降解产物或微生物蛋白对营养价值的贡献大于酶活性本身。右下区域（PC1+，PC2−）汇集了14个与成功发酵响应相关的变量：所有测定的酶活性（淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶）、发酵后降解产物（还原糖、葡萄糖）、相对真菌丰度和分泌组蛋白（蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶、植酸酶）。酶活性、微生物丰度和糖产生之间的强关联确认该象限为固态发酵的效率轴。
表征质量分析确认44个变量中有35个在PC1-PC2空间中表征良好（平方余弦>0.9），验证了二维解释的稳健性。仅米曲霉覆盖率表现为中等表征（平方余弦=0.492），提示存在PC1-PC2未捕获的其他维度贡献。PC1-PC2空间中的欧氏距离分析量化了发酵系统间的总体相似性。两两距离范围为4.09至14.33个单位，呈现明显的聚类模式。系统C和D最为相似（距离=4.09），表明尽管底物配方不同，但发酵特征趋同。两系统均处于低效区域（PC1为负），特征为高残余纤维和低酶输出。相比之下，系统B与其他系统的差异最大，与系统D的距离最大（14.33），与系统A（12.14）和C（10.72）的距离也较大。系统A处于中间位置，与C（7.31）和D（10.44）的距离适中。系统B与D之间的大距离（14.33）确认了二者位于PC1所代表的发酵效率梯度的两个极端。
变量贡献分析识别了各主成分中方差的关键驱动因素（图1b、1c）。使用期望贡献阈值2.27%（44个变量的均匀分布），PC1有15个变量超过该阈值，PC2也有15个。PC1（63.0%方差）主要由发酵后酶和微生物变量驱动。前五名贡献者为淀粉酶分泌组（3.60%）、蛋白酶活性（3.60%）、黑曲霉丰度（3.58%）、发酵前IVDMD（3.54%）和总分生孢子丰度（3.50%）。其他主要贡献者包括其他分泌组蛋白（3.44%）、发酵后钙（3.42%）、纤维素酶活性（3.36%）、发酵后ADL（3.36%）、米曲霉丰度（3.34%）、过氧化氢酶分泌组（3.33%）、发酵前钙（3.28%）、木聚糖酶活性（3.18%）以及发酵后还原糖和葡萄糖（各3.16%）。这组酶活性、分泌组组成和真菌丰度确认PC1为发酵效率轴，依据微生物性能和降解能力区分系统。
PC2（28.8%方差）由底物组成变量主导，特别是纤维组分和蛋白质含量。前五名贡献者为发酵后粗蛋白（7.15%）、发酵前纤维素（6.95%）、发酵前NDF（6.46%）、发酵前ADF（6.45%）和发酵前葡萄糖（5.26%）。其他主要贡献者包括发酵后NDF（数据在原文后续部分详述）。
【数据】PC1解释方差：63.0%；PC2解释方差：28.8%；总解释方差：91.8%；显著相关总数：570个；强正相关：184个（30–45°）；中等正相关：150个（45–60°）；强负相关：118个（135–150°）；中等负相关：118个（120–135°）；最强正相关角度：30°（半纤维素酶分泌组与米曲霉覆盖率）；欧氏距离范围：4.09–14.33；系统C-D距离：4.09；系统B-D距离：14.33；PC1贡献阈值：2.27%；PC1前五贡献：3.60%、3.60%、3.58%、3.54%、3.50%；PC2前五贡献：7.15%、6.95%、6.46%、6.45%、5.26%
图3展示了黑曲霉（黑色真菌）与米曲霉（绿色真菌）在不同培养基上的互作测定平板正面视图，包括PDA、WF、SH、BSG以及对应系统A、B、C、D的发酵配方。
图4展示了参与生物质降解的酶相对丰度。经四天共培养后，系统A-D的分泌组蛋白按酶类别（淀粉、木质素、纤维素、半纤维素降解）分布，相对丰度由nano LC-MS/MS分析确定。
图5为发酵生物质微观结构的SEM图像。图A-B显示发酵前生物质在500倍放大下完整的木质纤维素结构；图C-D显示发酵后生物质在1500倍放大下的不规则表面形态和结构解体，表明多糖被有效降解。
讨论与解读
本研究表明，黑曲霉和米曲霉对农产品加工副产物的固态共发酵可通过整合多变量分析、分泌蛋白组学分析和多目标期望函数进行系统优化。对44个变量的主成分分析解释了系统总方差的91.8%，PC1与发酵效率相关，PC2与底物组成相关。多因子分析进一步确认了微生物活性与营养响应之间的强关联（RV = 0.953），支持将真菌丰度和分泌组组成作为发酵性能的预测指标。基于期望函数的优化确定了最优配方为56%麦粉副产物、18%大豆皮和26%啤酒糟，全局期望值为0.964。该预测最优值与实验表现最佳的系统B吻合，表明该配方在酶产量、纤维降解和营养改善之间达到了最佳平衡。在此条件下，共培养产生了高酶活性，包括淀粉酶（3971 U/gds）、纤维素酶（32.8 U/gds）、木聚糖酶（89.1 U/gds）和蛋白酶（27,936 U/gds），同时分泌组中含有纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶及参与生物质降解的辅助酶。发酵改善了饲料营养价值，粗蛋白从15%提升至22%，体外干物质消化率提高至75%，纤维组分显著降低（NDF从54%降至36%，ADF从26%降至13%，ADL从5.9%降至2.5%）。
【编译者解读】该研究的突出价值在于将"组学数据"转化为"可操作的配方设计工具"——以分泌蛋白组为预测性生物标志物，通过多目标优化在806种配方组合中锁定最优解，避免了传统试错法的高成本和低效率。真菌毒素检测阴性也为实际饲料应用扫清了安全障碍。值得关注的是，最优配方并非纤维含量最低或酶活最高的极端组合，而是三者平衡的中间配比，这提示固态发酵的"最优解"本质上是一个多指标权衡问题。未来若能将此框架推广至其他真菌组合和底物类型，或可构建通用的农产品副产物发酵增值预测平台。局限在于当前优化基于实验室规模，放大至工业级时的传热传质差异仍需验证。
参考来源
Stegmann, P. M. (2026). Multi-objective optimization of solid-state fermentation using agro-industrial by-products: Integrating multivariate analysis and desirability functions for enhanced feed value. Food and Bioproducts Processing. DOI: 10.1016/j.fbp.2026.07.002
DOI: 10.1016/j.fbp.2026.07.002