来源：Ultra-sensitive whole-cell biosensor equipped with reprogrammed and engineered two-component signal system Agr for detecting Staphylococcus aureus（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
金黄色葡萄球菌是感染全球约30%人口的常见机会性病原体，被WHO列入细菌优先病原体清单。本研究在枯草芽孢杆菌中重编程金黄色葡萄球菌的Agr群体感应系统，构建了能够通过感知自诱导肽（AIP）检测目标病原体的全细胞生物传感器。研究团队通过引入布尔AND逻辑门、系统优化AgrC表达水平及对功能域进行定向进化，最终获得纳米摩尔级检测灵敏度（较野生型提升3倍）、829倍动态范围且背景泄漏显著降低的进化型生物传感器，并成功将其模块化改造为肉眼可视的比色检测平台。
研究背景
金黄色葡萄球菌是一种普遍存在的机会性病原体，约30%的全球人口携带此菌，通过人类和动物感染造成重大公共卫生负担，因此分别于2017年和2024年被世界卫生组织列入细菌优先病原体清单（BPPL）。虽然该菌历史上与医院获得性感染相关，但毒力菌株如今日益导致社区获得性感染和畜牧业相关流行病。多重耐药菌株的出现进一步加剧了威胁，亟需创新诊断技术在多种环境中及时检测金黄色葡萄球菌。尽管已有免疫层析、电化学和电化学发光等多种检测方法，但仍需要精确、灵敏、快速检测该病原体的新型平台。合成生物学的发展为利用各种生物传感器诊断病原体、食品污染物和环境污染物提供了下一代工具，其中基因编码生物传感器利用工程化基因电路实现检测功能。
Agr系统是金黄色葡萄球菌中典型的自诱导肽（AIP）感应型双组分信号系统（TCS），AIP通过TCS介导细菌群体感应，驱动毒素产生并介导致病性。然而，使用天然Agr基因和蛋白组分的全细胞生物传感器存在灵敏度低、动态范围窄、背景泄漏高等问题。本研究旨在枯草芽孢杆菌中对Agr系统进行重编程和工程化改造，构建高性能全细胞生物传感器。
研究方法
2.1 菌株与细菌培养
野生型和重组细菌见补充表S1。采用Luria-Bertani（LB）液体培养基（pH 7.0），组成为10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl，用于培养枯草芽孢杆菌168、agrBA整合型枯草芽孢杆菌宿主BsBA以及携带质粒的重组枯草芽孢杆菌。所有宿主均在37°C、200 rpm振荡条件下培养适当时间（测试输出表达水平时培养12 h，测试动态表达谱时培养时间从6 h至12 h不等）。需要时，向培养基中添加100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL氯霉素和5 μg/mL红霉素用于筛选。
【数据】培养基：LB（pH 7.0，10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；温度：37°C；转速：200 rpm；时间：12 h（输出检测）/6–12 h（动态谱）；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素、10 μg/mL氯霉素、5 μg/mL红霉素
2.2 基因操作
本研究采用反向PCR和Gibson assembly两种克隆方法获取目标基因并在基因位点引入突变、缺失和插入。简要而言，在反向PCR中使用目标基因上下游15–25 bp的同源互补序列。PCR组分和用量如下：25 μL PrimeSTAR® MaxDNA聚合酶、正向引物和反向引物各2 μL、模板DNA浓度低于200 ng，用适量ddH₂O调整总体积至50 μL。
Gibson assembly包含三个主要步骤。首先，DNA在T5核酸外切酶作用下被切割成带缺口的开环DNA。其次，Phusion DNA聚合酶合成DNA修复缺口，形成环状切口DNA。最后，Taq DNA连接酶修复产物，形成完全双链DNA。
基因操作流程如下：使用PrimeSTAR® MaxDNA聚合酶高保真酶进行PCR，获得两端带有25–30 bp同源臂的目标基因片段PCR产物。使用限制性内切酶DpnI去除模板DNA。消化产物纯化后，按实际浓度比例混合，与2×Gibson Assembly Master Mix组装酶以1:1比例在PCR管中混合，于50°C孵育15–60 min。产物导入大肠杆菌JM109进行质粒扩增。质粒构建详细流程见补充材料（补充方法）。
【数据】PCR体系：25 μL PrimeSTAR® MaxDNA聚合酶、引物各2 μL、模板DNA <200 ng、总体积50 μL；同源臂：15–25 bp（反向PCR）/25–30 bp（Gibson）；Gibson组装：50°C、15–60 min；DpnI消化去除模板
2.3 荧光分光光度法测定
采用分光光度法测量sfGFP的荧光水平，作为表征传感器系统性能的基础。挑取单菌落用于培养种子液。将种子液以1:100比例接种至30 mL LB培养基中，在37°C、200 rpm振荡培养箱中培养适当时间。培养后，取200 µL发酵液，以12 000 rpm离心1 min收集细胞，然后用1×磷酸盐缓冲液（PBS，含10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl、2.7 mM KCl，pH 7.4）洗涤以去除培养基组分。随后将收集的细胞重悬于等体积PBS中。将样品溶液加入96孔透明底板微孔板中，使用Synergy™ H4多功能微孔板检测仪（美国BioTek Instruments公司）检测荧光强度。激发波长和发射波长分别设置为495 nm和525 nm。所有实验均独立进行三次重复，数据以平均值±标准差表示。
【数据】接种比：1:100；培养基体积：30 mL；温度：37°C；转速：200 rpm；离心：12 000 rpm、1 min；PBS：10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl、2.7 mM KCl，pH 7.4；激发/发射波长：495/525 nm；重复：3次独立实验
2.4 流式细胞术分析生物传感器输出谱
流式细胞术分析参照我们此前研究并略作修改。简言之，首先从琼脂平板上挑取重组枯草芽孢杆菌单菌落，接种至含LB的试管中。在37°C培养适当时间后，收集重组细胞并用1×PBS缓冲液洗涤。随后将细胞重悬并稀释至OD₆₀₀为0.05。之后将细胞样品装载至FACSAria™ III流式细胞仪（美国BD Bioscience公司）。FSC和SSC电压分别为150 V和330 V。使用FSC-A和SSC-A门控包含70–90%总细胞的活细胞。使用FlowJo X软件（美国Tree Star公司，Ashland, OR）分析数据并计算平均荧光值。
【数据】OD₆₀₀：0.05；FSC电压：150 V；SSC电压：330 V；活细胞门控：70–90%总细胞；仪器：FACSAria™ III流式细胞仪
2.5 GusA报告基因法用于金黄色葡萄球菌的可视化检测
GUS报告基因测定参照此前报道并作适当修改。将含有可视化生物传感系统的重组菌株BsBA/pHT-PxylA-agrC-P3-gusA接种至含LB培养基的试管中。培养12 h后，以初始OD₆₀₀为0.1转接至锥形瓶中进行扩大培养。随后加入0.1%木糖诱导AgrC表达水平，并加入不同浓度的AIP-I（2、10、50、200 nM）。经木糖和AIP（或培养上清液）诱导并充分相互作用后，分别加入不同浓度的6-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸环己铵盐底物（Rose-gluc，0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL）。生物传感系统中表达的GusA酶与底物反应产生红色沉淀。不同产物产量导致的颜色差异作为该传感系统可视化定性检测的基础。产物通过分光光度法定量检测（λmax = 540 nm）。
【数据】初始OD₆₀₀：0.1；木糖：0.1%；AIP-I浓度：2、10、50、200 nM；Rose-gluc浓度：0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL；检测波长：540 nm；预培养时间：12 h
2.6 使用可视化生物传感器检测不同来源的金黄色葡萄球菌
GusA报告基因检测方法与上述流程一致。收集不同来源金黄色葡萄球菌检测样品的流程如下：来自鸡、鸭和猪的野生型金黄色葡萄球菌菌株（由华南农业大学张建民教授惠赠）在非选择性平板上划线，于37°C、200 rpm振荡培养过夜。随后从每个平板挑取单菌落，接种至含5 mL LB培养基的试管中。培养12 h后，以6 000 rpm离心10 min去除活细胞。随后将不同体积的上清液加入AIPBS-XI-Color中，孵育6 h。之后加入不同浓度的Rose-gluc启动显色反应。
【数据】来源：鸡、鸭、猪源性金黄色葡萄球菌；培养基：5 mL LB；培养时间：12 h；离心：6 000 rpm、10 min；孵育：6 h；显色底物：Rose-gluc
2.7 数据处理与统计分析
EC₅₀用于评估生物传感器AIPBS-XI的灵敏度，其含义为输出荧光强度达到最大水平一半时的AIP-I浓度。使用GraphPad Prism 10软件（美国GraphPad Software公司，Boston, MA）的log（agonist）vs. response-variable slope（四参数）函数计算。动态范围通过计算AIP-I激活的最大荧光强度与未激活时基础泄漏的比值表示。此外，响应曲线中的线性范围通过95%置信区间的线性拟合分析。采用t检验和单因素方差分析评估不同构型生物传感器输出表达水平的显著性。P < 0.01定义为显著（P < 0.01，*P < 0.001）。
【数据】EC₅₀计算：四参数log(agonist) vs. response函数；动态范围：最大激活荧光/基础泄漏；线性范围：95%置信区间线性拟合；显著性阈值：P < 0.01
研究结果
3.1 通过重编程金黄色葡萄球菌Agr双组分信号系统构建基因编码全细胞生物传感器
AIP是经由TCS系统介导细菌群体感应的肽信号。来自金黄色葡萄球菌菌株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）的AIP通过TCS Agr驱动毒素产生并介导致病性。这些肽在金黄色葡萄球菌中广泛分布且序列高度保守，是检测金黄色葡萄球菌的理想生物标志物。因此，本研究旨在常见革兰氏阳性细菌底盘枯草芽孢杆菌中设计并构建超灵敏基因编码生物传感器用于检测金黄色葡萄球菌。
在Agr系统中，AIP作为输入信号被AgrC感知，随后通过磷酸化级联经AgrA传导至效应启动子P3。激活的P3触发下游Agr控制基因的表达。此前研究已利用重编程Agr在益生菌中构建了感知和杀伤金黄色葡萄球菌的基因电路，但灵敏度较低，且动态范围在不同底盘中有差异。
为提高基于Agr的生物传感器的灵敏度和动态范围，研究首先在枯草芽孢杆菌中重编程Agr系统，将agrBA整合至基因组lacA位点（BsBA菌株），并将agrC表达于高拷贝质粒（pB）和中等拷贝质粒（pHT）中，以比较拷贝数是否如既往报道影响背景噪声。输出模块包含P3启动子及其下游的超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP），同样部署在pB和pHT中。该设计产生了两个版本的生物传感器AIP-STD1和AIP-STD2（图1A）。
研究首先使用5–400 nM的AIP-I测试两种生物传感器的响应，发现它们能响应最低5 nM的AIP-I并产生明显荧光信号。为深入探究生物传感器对更低和更高浓度AIP-I的响应，使用0.2 nM至3 000 nM的更宽AIP-I范围激活AIP-STD2，发现其能响应低至0.4 nM的AIP-I。与AIP-STD2相比，AIP-STD1（agrC以高拷贝数表达）显示出更高的最大输出水平，但背景泄漏噪声也更高（图1D）。综上，这些结果表明通过在枯草芽孢杆菌中重编程Agr系统构建的基因编码生物传感器能有效感知和检测AIP-I。鉴于AIP-STD2具有高响应和低背景噪声，后续研究选择该版本。
【数据】AIP-I检测范围：0.2–3000 nM；最低检测浓度：0.4 nM（AIP-STD2）/5 nM（两种传感器）；AIP-STD1特征：高最大输出+高背景泄漏；AIP-STD2特征：高响应+低背景噪声
3.2 通过定制底盘细胞中AgrC的表达水平改善生物传感器性能
在确认AIP-STD2的基本性能后，研究尝试通过配置传感器蛋白的最佳表达水平来调节生物传感器灵敏度——此策略在其它基于TCS的生物传感器中已被报道可影响灵敏度。为此，使用木糖诱导型PxylA启动子调控AgrC表达，构建了含布尔AND门电路的生物传感器AIPBS-XI，该电路需同时被木糖和外源AIP-I激活（图2A）。
分别用0.1%和0.5%木糖诱导BsBA宿主中的AgrC，产生两个表达水平。随后用2至2 000 nM的AIP-I激活AIPBS-XI。数据显示，高水平AgrC在所有AIP-I浓度下均意外显示出比低水平AgrC更低的输出水平，两种水平均在50 nM AIP-I处产生可检测响应。EC₅₀测量（sfGFP输出达到最大50%时的AIP-I浓度）显示，低水平AgrC的AIPBS-XI的EC₅₀为24.6 nM，低于高水平AgrC的47.3 nM，表明低水平AgrC使AIPBS-XI具有更高的灵敏度和输出水平（图2C、补充表S4），尽管两者在5至200 nM AIP-I范围内表现出相似的线性范围（图2D）。
动态范围是生物传感器的另一关键性能参数。在AIPBS-XI中，低水平AgrC表现出比高水平AgrC更高的动态范围（90倍对32.29倍，图2E）。这些结果表明AIPBS-XI中低水平AgrC表达显示高灵敏度和更宽动态范围。因此，后续实验使用0.1%木糖诱导AIPBS-XI。
【数据】木糖浓度：0.1%/0.5%；AIP-I激活范围：2–2000 nM；可检测响应阈值：50 nM AIP-I；EC₅₀：24.6 nM（低AgrC）vs 47.3 nM（高AgrC）；线性范围：5–200 nM；动态范围：90倍（低AgrC）vs 32.29倍（高AgrC）
3.3 通过结构引导的AgrC进化提升生物传感器灵敏度
调节底盘细胞中AgrC丰度仅能获得有限的灵敏度和动态范围提升，这受限于AgrC的固有局限。为突破遗传限制，研究旨在通过进化AgrC来提升AIPBS-XI的灵敏度和动态范围。
为引导AgrC进化，首先分析AgrC-AIP-I相互作用的结构基础。由于尚无全长AgrC晶体结构报道，使用AlphaFold3生成全长AgrC结合AIP-I的复合物模型（详细建模方法见补充方法，建模质量评估见补充图S1）。结构复合物显示AgrC形成二聚体（链A和链B），每条链结合一个AIP-I。每条链的AIP-I结合位点跨越跨膜螺旋2和螺旋2–3环，位于膜-胞外界面（图3A）。二聚体的催化结构域（CA）与嵌合蛋白中部分AgrC的晶体结构高度吻合。值得注意的是，连接传感器和CA结构域的长螺旋彼此交叉（图3A右侧俯视图），提示与先前研究一致的转激活机制。这些见解证实了模型的准确性，并为结构引导的AgrC进化奠定了基础。
结构分析揭示AgrC内存在一个高度疏水的AIP-I结合口袋（图3B）。该口袋后部空间聚集的疏水氨基酸形成"疏水墙"，可能稳定AgrC-AIP-I相互作用。基于其强疏水性和庞大侧链，Y102、V112、I113、P115、F184被鉴定为潜在识别热点（图3C）。丙氨酸突变扫描表明，Y102A和I113A突变体的EC₅₀分别比野生型AgrC（WT）低约1.4倍和2.1倍，表明这两个残基增强信号灵敏度（图3D、表1和补充表S5）。相比之下，其他位点的突变在灵敏度上无显著变化（补充图S2A和表1、补充表S6）。
对这两个位点进行更多突变后发现，Y102H和I113V进一步将EC₅₀分别降低至40.2和25 nM，与WT相比灵敏度分别提高2.1倍和3.6倍（图3E、表1、补充表S7）。由于这些位点的其他突变未显著改变灵敏度（补充图S2B和S2C、表1、补充图S8和图S9），选择I113V和Y102H进行后续组合突变。
为鉴定可能影响灵敏度和动态范围的其他关键残基，筛选了AgrC的催化结构域（CA）。选择该区域是因为基于TCS的全细胞生物传感器的检测阈值取决于组氨酸激酶活性，而该活性位于CA结构域。GXGX基序存在于约64%的细菌传感器激酶中。对来自10个不同来源的AgrC进行序列比对发现，该区域的保守基序为GXGL（图3F）。在该基序内，两个甘氨酸残基（G394、G396）是与自磷酸化相关的ATP结合G盒的必需组分，因此予以保留。据此推测，相邻的非保守残基L395和L397可能调节灵敏度和动态范围。为验证这一假设，首先将L395和L397替换为丙氨酸及其他代表性氨基酸，发现L395F、L395Q和L397A表现出显著更低的EC₅₀值。
【数据】Y102A EC₅₀：较WT低约1.4倍；I113A EC₅₀：较WT低约2.1倍；Y102H EC₅₀：40.2 nM（较WT灵敏度提高2.1倍）；I113V EC₅₀：25 nM（较WT灵敏度提高3.6倍）；GXGX基序：约64%细菌传感器激酶中存在；保守基序：GXGL；保守残基：G394、G396
3.4 通过AgrC组合工程进一步提升灵敏度和动态范围
将I113A突变与L395F或L395Q组合后，生物传感器AIPBS-XI对AIP-I的灵敏度显著提升，动态范围也得到拓宽（图4A）。图4B比较了不同突变体组合的动态范围。
【数据】组合突变：I113A/L395F、I113A/L395Q；效果：灵敏度提升+动态范围拓宽（原文未详述具体数值）
3.5 I113A/L395F突变体灵敏度增强的机制分析
对野生型AgrC（WT，黑色曲线）和I113A/L395F突变体（红色曲线）进行了100 ns分子动力学模拟。RMSD分析（图5A）和RMSF分析（图5B）揭示了突变体结构波动与灵敏度提升之间的关联。
【数据】分子动力学模拟时间：100 ns；分析内容：RMSD、RMSF（具体数值原文未详述）
3.6 进化型AIPBS-XI生物传感器检测金黄色葡萄球菌的验证
使用携带野生型（WT）AgrC、I113A/L395F和I113A/L395Q突变体的AIPBS-XI生物传感器检测参考菌株金黄色葡萄球菌CCTCC AB 2013089的培养上清液（图6A）。这些生物传感器的线性范围如图6B所示。
【数据】检测菌株：金黄色葡萄球菌CCTCC AB 2013089；突变体：I113A/L395F、I113A/L395Q（线性范围具体数值原文未详述）
3.7 将荧光生物传感器重编程为比色平台实现裸眼可视化检测
将AIPBS-XI中的sfGFP替换为gusA，在agrBA整合型底盘（BsBA）中构建了AIPBS-XI-Color（图7A）。利用Rose-gluc底物进行比色反应，实现了无需仪器的裸眼可视化检测。
【数据】报告基因替换：sfGFP→gusA；底盘：BsBA；底物：Rose-gluc（具体浓度和检测限原文未详述）
讨论与解读
本研究成功利用基因编码全细胞生物传感器检测金黄色葡萄球菌，该传感器通过在枯草芽孢杆菌底盘内重编程Agr群体感应系统开发。关键在于通过传感器激酶AgrC的组合工程提升了传感器性能。本研究首次通过进化传感器蛋白AgrC实现全细胞生物传感器的超高灵敏度、拓宽的动态范围和最小基础泄漏。另一个亮点是在基因电路中引入新型布尔AND逻辑门，使生物传感器相比此前报道的系统具有更低的背景泄漏。此外，基于荧光的生物传感器被模块化转换为显色系统，使信号输出可直接通过肉眼观察。总体而言，本研究建立了一种新型高性能活细胞诊断平台，用于金黄色葡萄球菌的精确检测，在微生物监测、临床诊断和生态研究中具有巨大应用潜力。
编译者解读：该研究展示了合成生物学中"传感器蛋白工程化"的经典范式——从结构预测到理性设计再到组合突变的完整闭环。将布尔AND逻辑门引入基因电路以压低背景泄漏，这一策略对提高全细胞生物传感器信噪比具有普适参考价值。将荧光输出模块化替换为GusA比色系统，显著降低了设备依赖，为资源有限场景下的现场检测提供了可行方案。值得注意的是，研究从猪、鸡、鸭等农业动物源样本中验证了实用性，契合畜牧养殖中病原监测的实际需求。局限在于目前仍以实验室培养上清液为检测对象，向临床或环境复杂基质直接检测的转化尚需更多工作。此外，AlphaFold3预测结构指导的突变设计虽高效，但分子动力学模拟仅100 ns，对构象变化的解释深度有限。总体而言，该工作为TCS类生物传感器的性能定制提供了可推广的方法学框架。
参考来源
期刊：Sensors and Actuators B: Chemical, 2026
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140410
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140410