来源：A multi-level antifungal mechanism of chlorine dioxide: Safeguarding Panax notoginseng during storage by suppressing Aspergillus niger growth and ochratoxin A production（Journal of Stored Products Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
三七作为名贵中药材，在储藏过程中易受黑曲霉侵染并产生致癌物赭曲霉毒素A（OTA）。本研究系统评估了二氧化氯（ClO₂）对黑曲霉的体外与体内抑制效果，发现90–360 mg/L ClO₂可显著抑制菌丝生长、孢子萌发及OTA合成，并通过生理生化与多组学分析揭示了其多层级抑菌机制。研究首次将ClO₂应用于三七采后病害防控，为替代传统硫磺熏蒸提供了绿色方案。
研究背景
三七为五加科植物三七的干燥根及根茎，是云南省最具代表性的道地中药材，具有活血化瘀、抗炎、抗肿瘤、降血脂及增强免疫等功效。然而，在种植、采收、加工和储藏过程中，三七在特定温湿度条件下易发生霉变，产生真菌毒素。其中，赭曲霉毒素A（OTA）污染尤为值得关注。Yang等（2010）对57份中药材样品的分析显示，OTA污染率达44%，污染水平为1.2–158.7 μg/kg；Wei等（2023）研究发现36.25%的中药材受OTA污染；Chen等（2010）在三七中检出OTA浓度为1.7 μg/kg。因此，有效防控储藏期三七的OTA污染极为重要。
二氧化氯作为一种高效、广谱消毒剂，其抗菌活性已在多种微生物中得到验证，但其对采后农产品中黑曲霉生长及OTA合成的抑制效果与机制尚不清楚。本研究通过体内外实验系统评估了ClO₂对黑曲霉的抑制效果，并从生理生化与组学层面初步探索了其作用机制。
研究方法
2.1 材料
三七（Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）购自中国云南省文山市。黑曲霉由云南省三七资源可持续利用重点实验室提供，分离自发霉三七，经单孢分离纯化获得。利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）通过PCR扩增rDNA ITS区域，PCR产物经纯化后测序。将所得ITS序列（见附录A）与NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示与黑曲霉参考菌株（GenBank登录号：MG659661.1、PV915582.1等）的序列相似性为100%。结合形态学特征（菌落形态和分生孢子梗结构），将该菌株鉴定为黑曲霉。
黑曲霉孢子悬浮液的制备：将黑曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，28°C培养5天。随后向培养基表面倒入2 mL无菌水，用接种环刮取培养基表面的菌丝。所得悬浮液经四层无菌纱布过滤以去除菌丝，然后以4000 rpm离心15 min，弃上清，沉淀用无菌水洗涤。此过程重复三次。最后向孢子沉淀中加入无菌水，用涡旋混合器使孢子悬浮液均质化，用血球计数板测定孢子悬浮液浓度，并调整至1 × 10⁶孢子/mL。
【数据】菌株：黑曲霉；培养温度：28°C；培养时间：5天；离心：4000 rpm×15 min；孢子浓度：1 × 10⁶孢子/mL；ITS序列相似性：100%
2.2 黑曲霉生长曲线的测定
将100 μL孢子悬浮液接种于7瓶50 mL PDB液体培养基中。培养瓶置于摇床培养箱中，28°C、180 rpm振荡培养。每24小时取样一次，菌体经无菌纱布过滤，80°C烘干至恒重，称重并计算生物量增长。该测定重复七次直至培养结束。以时间和干生物量为坐标绘制生长曲线，确定菌株的生长规律。
【数据】接种量：100 μL孢子悬液；培养基：PDB液体培养基（50 mL/瓶）；温度：28°C；转速：180 rpm；干燥温度：80°C；取样间隔：24 h；重复次数：7次
2.3 ClO₂对黑曲霉菌丝生长的影响及OTA的提取与定量
参照Liu等（2017）的方法并稍作修改，评估ClO₂对黑曲霉菌丝生长的抑制作用。将不同质量的ClO₂（0、0.1、0.2、0.4 g）加入灭菌的100 mL PDA培养基中，使终浓度分别为0、90、180、360 mg/L。不含ClO₂的PDA培养基作为空白对照（CK）。培养基完全凝固后，在每块平板中央接种5 μL黑曲霉孢子悬浮液。平板置于28°C恒温培养箱中培养7天。采用十字交叉法测量菌落直径，每隔一天测量一次。每个处理设三次重复，至培养结束共获得七次测量数据。第7天进行OTA的提取与分析。
OTA提取方法参照Jiang等（2022）并稍作修改。用无菌手术刀沿菌落边缘将菌丝连同培养基一起切下，放入50 mL离心管中。加入10 mL乙腈，室温下180 rpm振荡30 min，然后室温静置1 h。混合物以10,000 rpm离心5 min。上清液经0.22 μm滤膜过滤，采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析。实验重复三次，每组设三个重复。OTA标准液数据及标准曲线见附录A表S1和图S1。
【数据】ClO₂浓度：0、90、180、360 mg/L；接种量：5 μL孢子悬液/平板；培养温度：28°C；培养时间：7天；提取溶剂：10 mL乙腈；振荡：180 rpm×30 min；静置：1 h；离心：10,000 rpm×5 min；滤膜：0.22 μm
2.4 ClO₂对OTA降解产物及降解途径的预测
为研究ClO₂对OTA的直接降解作用，进行了体外降解实验。取500 μL OTA标准溶液（浓度100 μg/mL）置于棕色玻璃瓶中，加入1 mL ClO₂溶液（浓度360 mg/L）。混合物在室温下磁力搅拌10 min。反应完成后，将溶液旋转蒸发除水，用2 mL乙腈复溶，经0.22 μm滤膜过滤后转移至进样瓶进行分析。
降解产物采用UHPLC-MS/MS系统（Shimadzu，日本）分析。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm；Waters，美国）。柱温维持在40°C，进样量10 μL。流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速0.5 mL/min，梯度洗脱。质谱仪在正离子模式（[M+H]+）下运行，扫描质荷比（m/z）范围为20至600。通过将保留时间和质谱数据与OTA标准品及文献数据进行比较，鉴定降解产物。
【数据】OTA标准液：100 μg/mL×500 μL；ClO₂溶液：360 mg/L×1 mL；反应：室温磁力搅拌10 min；复溶：2 mL乙腈；柱温：40°C；进样量：10 μL；流速：0.5 mL/min；质谱模式：正离子[M+H]+；m/z扫描范围：20–600
2.5 ClO₂对黑曲霉孢子生长的抑制作用
#### 2.5.1 孢子萌发率
参照Zhang等（2025）的方法并稍作修改，评估ClO₂对黑曲霉孢子萌发的抑制作用。用无菌水将孢子悬浮液稀释至1 × 10⁶孢子/mL。按照2.3节中PDA培养基的制备方法，配制50 mL含不同浓度ClO₂（0、90、180、360 mg/L）的PDB液体培养基。将100 μL孢子悬浮液接种至上述液体培养基中。接种后的培养基在28°C摇床（180 rpm）上培养24 h。取少量培养液转移至血球计数板，在光学显微镜下计数。随机计数至少200个孢子，计算黑曲霉孢子萌发率。
【数据】孢子浓度：1 × 10⁶孢子/mL；ClO₂浓度：0、90、180、360 mg/L；培养基：PDB（50 mL）；温度：28°C；转速：180 rpm；时间：24 h；计数孢子数：≥200个
#### 2.5.2 细胞水平生理响应
为阐明ClO₂处理对黑曲霉细胞水平生理状态的影响，测定了关键生理指标，包括活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及抗氧化酶系统活性（超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT及丙二醛MDA）。本实验所用孢子浓度为1 × 10⁶孢子/mL。
ROS、线粒体膜电位及细胞凋亡的检测参照Fu等（2019）的方法并稍作修改。样品制备如下：准备两瓶100 mL PDB培养基，灭菌冷却后，向每个锥形瓶中加入1 mL黑曲霉孢子悬浮液，然后添加ClO₂至终浓度90 mg/L，不含ClO₂的PDB培养基作为空白对照（CK）。处理6 h后，洗涤并重悬孢子。ROS、MMP和凋亡的检测严格遵循Solarbio检测试剂盒提供的标准操作规程。
黑曲霉抗氧化系统活性的检测方法如下：配制孢子悬浮液和无菌PDB培养基（100 mL/瓶），向各个锥形瓶中加入20 μL 1 × 10⁶孢子/mL悬浮液，用封口膜密封锥形瓶，在100 rpm、28°C条件下培养。3天后，当瓶中出现大量菌丝时，用无菌纱布过滤收集菌丝。将等量新鲜菌丝（3 g湿重）加入50 mL无菌水中，添加ClO₂至终浓度0、90、180、360 mg/L。继续培养12 h后，再次收集菌丝用于抗氧化系统活性测定。SOD、POD、CAT活性和MDA含量均按照Solarbio检测试剂盒的标准流程测定。
【数据】孢子浓度：1 × 10⁶孢子/mL；ClO₂处理浓度（细胞生理）：90 mg/L；处理时间：6 h；ClO₂处理浓度（抗氧化系统）：0、90、180、360 mg/L；菌丝用量：3 g湿重；处理时间：12 h；培养转速：100 rpm；培养温度：28°C
#### 2.5.3 ClO₂对黑曲霉代谢活性的影响
（方法部分原文截断，后续内容原文未详述）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 ClO₂对黑曲霉菌丝生长和OTA含量的影响
为确定黑曲霉的最佳实验时间点，分析了其生长曲线特征。图1A所示结果表明，黑曲霉生长可分为三个阶段：0–1天为延滞期，孢子萌发延迟，生物量无显著变化；1–5天为对数生长期，菌丝快速延伸，干生物量呈指数增长；5天后进入稳定期，营养耗尽，生物量达到峰值。选择该时间点用于后续实验。
为研究ClO₂对黑曲霉生长和毒素合成的抑制作用，施加了不同浓度的ClO₂处理。如图1C和D所示，与对照组相比，ClO₂显著抑制了菌丝生长和菌落形成。抑制效果随浓度升高而增强，呈显著正相关（p < 0.05）。培养第7天，90 mg/L ClO₂处理组的菌落直径较对照组显著缩小13.51%（p < 0.05）。此外，超过180 mg/L的浓度（180和360 mg/L）几乎完全抑制了菌丝生长，整个培养期间菌落直径无明显变化。
ClO₂不仅能显著抑制黑曲霉生长，还能抑制OTA合成。图1B显示了不同ClO₂浓度下黑曲霉OTA产量的抑制情况。图中显示，OTA浓度随ClO₂浓度升高而逐渐降低，呈显著负相关（p < 0.05）。ClO₂浓度为90 mg/L时，OTA抑制率为19.91%。当浓度升高至180 mg/L时，黑曲霉已无法正常生长，因此不产生OTA，抑制率达100%。
【数据】ClO₂浓度梯度：0、90、180、360 mg/L；90 mg/L处理菌落直径减少：13.51%（第7天，p < 0.05）；90 mg/L时OTA抑制率：19.91%；180 mg/L时OTA抑制率：100%；生长阶段划分：延滞期0–1天，对数期1–5天，稳定期5天后
3.2 OTA的降解产物及降解途径
经ClO₂处理后的OTA溶液经UHPLC-MS/MS分析，通过与标准品比对及质谱解析，鉴定该产物为苯丙氨酸。质谱图中，OTA的[M+H]+离子位于m/z 404.05（图2A），而苯丙氨酸的[M+H]+离子位于m/z 164.95（图2B）。这表明ClO₂处理导致OTA分子中的酰胺键断裂，生成OTα和苯丙氨酸。但OTα在质谱中未被观察到。
基于上述结果，提出ClO₂降解OTA的主要途径：ClO₂的强氧化能力攻击OTA的酰胺键，使其水解断裂为OTα和苯丙氨酸（图2C）。此外，可能存在苯环羟基化等次级降解途径。然而，本实验中未检测到其他显著产物，可能是因为酰胺键断裂是主要反应。该降解途径与先前报道的臭氧和过氧化氢等氧化剂降解OTA的途径相似，进一步证实了ClO₂降解真菌毒素的有效性。
【数据】OTA [M+H]+：m/z 404.05；苯丙氨酸 [M+H]+：m/z 164.95；降解方式：酰胺键断裂生成OTα和苯丙氨酸
3.3 ClO₂对黑曲霉孢子的抑制作用
#### 3.3.1 孢子萌发率
图3A显示了黑曲霉在含不同浓度ClO₂（0、90、180、360 mg/L）的PDB培养基中培养24 h后的孢子萌发率。孢子萌发率与ClO₂浓度之间呈显著负相关（p < 0.05）。在180 mg/L浓度下，0–24 h内孢子萌发被完全抑制。
【数据】ClO₂浓度：0、90、180、360 mg/L；培养时间：24 h；完全抑制萌发浓度：180 mg/L（0–24 h内）
#### 3.3.2 细胞生理响应和代谢水平的变化
为阐明ClO₂对黑曲霉细胞水平生理状态和代谢的影响，测定了关键生理指标，包括ROS水平、MMP、细胞凋亡和MDA含量。MDA是细胞膜脂质过氧化产物；MDA水平升高表明细胞膜系统损伤更为严重。
#### 3.3.2.1 活性氧水平和线粒体膜电位
ClO₂处理后黑曲霉ROS水平的变化如图3B和C所示。结果表明，ClO₂处理组细胞的ROS水平显著高于对照组。作为细胞的"动力工厂"，线粒体的功能状态直接影响细胞的存活和稳态。MMP的稳定维持对ATP高效合成、ROS平衡调节和凋亡信号传导等关键生理过程至关重要（Bagkos et al., 2014）。MMP降低导致线粒体ATP产生不足，对正常细胞生长和活性产生不利影响。图3D和E显示，ClO₂处理降低了JC-1聚集体的含量并增加了单体含量，表明线粒体膜电位下降。此外，早期凋亡细胞比例从2.67%增加至17.93%，晚期凋亡和死亡细胞比例从0.13%增加至1.03%。
【数据】早期凋亡细胞比例：2.67%→17.93%；晚期凋亡和死亡细胞比例：0.13%→1.03%
#### 3.3.2.2 细胞凋亡
在流式细胞术分析中，细胞被划分为四个象限：左上（Q1）为坏死细胞，左下（Q3）为活细胞，右上（Q2）为晚期凋亡细胞，右下（Q4）为早期凋亡细胞（Ke et al., 2018; Tao et al., 2014）。使用Agilent NovoCyte系统评估了ClO₂对黑曲霉孢子凋亡的影响。如图3F和G所示，ClO₂处理显著影响孢子凋亡：对照组早期和晚期凋亡比例分别为4.47%和1.10%；ClO₂处理后，早期凋亡增加至8.56%，晚期凋亡增加至10.45%。
激光共聚焦显微镜结果（图3H）显示，对照组仅少数孢子呈现红色荧光，多数孢子呈现绿色荧光。随着ClO₂浓度升高，红色荧光孢子数量显著增加，总荧光强度增强（图3I），完整细胞数量显著减少，进一步降低了黑曲霉孢子的完整性。
【数据】对照早期凋亡：4.47%；对照晚期凋亡：1.10%；处理后早期凋亡：8.56%；处理后晚期凋亡：10.45%
#### 3.3.2.3 抗氧化系统活性的变化
测定了黑曲霉抗氧化酶活性，结果如图4A–D所示。SOD、POD和CAT活性随ClO₂浓度升高而降低。MDA含量与ClO₂浓度呈显著正相关（p < 0.05）。
【数据】SOD/POD/CAT活性：随ClO₂浓度升高而降低；MDA含量：与ClO₂浓度呈显著正相关（p < 0.05）
#### 3.3.2.4 基于刚果红染色的代谢活性评估
刚果红作为pH指示剂（变色范围pH 3.0–5.2；碱性条件下呈红色，酸性条件下呈蓝紫色），可间接反映黑曲霉生长过程中的代谢产酸能力。如图4E所示，与对照组相比，ClO₂处理组菌落周围蓝色晕圈的直径显著减小，颜色强度明显变浅。
【数据】刚果红变色范围：pH 3.0–5.2；蓝色晕圈直径：ClO₂处理组显著小于对照组
3.4 ClO₂对黑曲霉细胞膜完整性的影响
#### 3.4.1 蛋白质和核酸的泄漏
细胞膜通透性的异常增加表明膜受损。当真菌细胞经抗真菌剂处理后，细胞膜损伤可导致胞内蛋白质和核酸泄漏。通过测定胞外溶液在260 nm和280 nm处的吸光度来确定黑曲霉核酸和蛋白质的泄漏程度。如图5A和B所示，胞内物质泄漏程度与ClO₂浓度呈显著正相关（p < 0.05）。ClO₂浓度为360 mg/L时，OD260和OD280值分别为对照组的1.90倍和2.33倍。
【数据】360 mg/L ClO₂时OD260：对照组的1.90倍；360 mg/L ClO₂时OD280：对照组的2.33倍
#### 3.4.2 麦角固醇含量
麦角固醇是真菌细胞膜的重要结构成分，有助于维持膜的完整性和流动性。麦角固醇含量通常反映真菌细胞膜的不可逆损伤程度。
【数据】原文未详述
讨论与解读
基于ClO₂已知的广谱抗真菌活性，本研究在三个层面做出了新贡献：应用层面，首次将ClO₂应用于名贵中药材三七的采后病害防控，为传统硫磺熏蒸提供了绿色替代方案；机制层面，首次系统阐明了ClO₂在黑曲霉中多层级抑制的分子机制；功能层面，首次证实ClO₂可直接氧化降解OTA，揭示了其在真菌毒素防控中"抑制合成+直接降解"的双重功能。这些发现不仅深化了对ClO₂作用机制的理解，也为中药材的可持续储藏提供了新技术思路。
【编译者解读】该研究的亮点在于将"抑菌"与"毒素降解"两条防线整合于同一策略中，且从表型到分子层面构建了完整的证据链——从孢子萌发抑制、膜损伤、氧化应激到转录组和代谢组的系统性变化，逻辑严密。ClO₂对OTA酰胺键的直接断裂机制提示其可能对含类似化学键的其他霉菌毒素也具有降解潜力。不过，实际储藏环境中ClO₂的释放速率、残留水平及对三七活性成分的长期影响仍需进一步验证，距产业化应用尚有距离。
参考来源
Guo Z. A multi-level antifungal mechanism of chlorine dioxide: Safeguarding Panax notoginseng during storage by suppressing Aspergillus niger growth and ochratoxin A production. Journal of Stored Products Research, 2026. DOI: 10.1016/j.jspr.2026.103184
DOI: 10.1016/j.jspr.2026.103184