来源：Microbial and flavor-related metabolic changes in sour meat inoculated with Saccharomyces cerevisiae LXPSC1: An integrated multi-omics study（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
酸肉是我国西南地区的传统发酵猪肉制品，其风味品质高度依赖发酵过程中的微生物演替与代谢转化。本研究以酿酒酵母LXPSC1为功能发酵剂，结合宏基因组学、广泛靶向代谢组学与脂质组学，系统比较了自然发酵与接种发酵28天后的微生物群落及代谢差异。研究发现接种发酵显著重塑了微生物群落结构，提升了清酒乳杆菌和戊糖乳杆菌的相对丰度，并驱动了氨基酸、核苷酸及脂质代谢网络的协同变化。
研究背景
发酵肉制品中微生物群落的演替及其催化活性是感官品质形成与风味复杂化的核心驱动力。在完整发酵周期内，微生物与内源酶协同驱动碳水化合物代谢、蛋白质水解和脂肪降解等关键代谢通路，生成醇类、酯类、游离氨基酸及抗氧化肽等风味前体与特征风味化合物。酸肉起源于中国西南少数民族地区，以其独特的感官品质和较长保藏期而闻名。然而，传统自然发酵易受环境条件波动和有害菌增殖的制约，导致产品质量不稳定。为实现可控发酵与定向风味调控，乳酸菌、葡萄球菌和酵母等功能发酵剂被逐步引入肉制品发酵体系。其中，酿酒酵母已在食品发酵领域得到广泛应用。
研究方法
2.1 发酵剂制备
本研究所用酿酒酵母LXPSC1菌株最初分离自发酵鱼，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No. 21289。菌株获取自大连工业大学菌种保藏库（Lv et al., 2023）。菌株保存于含15%（v/v）甘油的YPD液体培养基中，置于−80°C条件。接种前，将酿酒酵母LXPSC1在新鲜YPD液体培养基中于28°C、150 rpm条件下活化24小时。为去除残留培养基成分，收获的菌体沉淀用无菌生理盐水（0.9% NaCl）洗涤。菌体充分重悬于1 mL无菌生理盐水中，最终细胞浓度调整至10⁷ CFU/mL。
【数据】菌株：酿酒酵母LXPSC1（CGMCC No. 21289）；保藏条件：YPD+15%甘油，−80°C；活化条件：28°C、150 rpm、24h；洗涤液：0.9%无菌生理盐水；终浓度：10⁷ CFU/mL
2.2 酸肉制备
猪五花肉、大米和精制盐购自大连沃尔玛超市。所有猪肉样品取自相同解剖部位和同一生产批次。酸肉制备参照本课题组已建立的方法（Lv et al., 2023）。简要流程如下：猪五花肉经清洗、沥干、切成均匀薄片，充分混匀后分为两个处理组，分别放入独立发酵罐中。加入烤米粉（10%，w/w）和盐（4.5%，w/w），充分混匀。样品密封于罐中，于25°C发酵28天。处理组包括自然发酵对照组（CK 28）和酿酒酵母LXPSC1接种组（Sc 28）。Sc 28组中，LXPSC1细胞经离心收获后重悬于1 mL无菌水中，充分拌入猪肉中，使最终接种量达到10⁷ CFU/g。两个处理组加入等体积无菌水，培养液未直接引入酸肉。本研究所用样品为本课题组此前报道（Lv et al., 2023）同一发酵实验和同一批次的第28天存档样品。每个处理的6个生物学重复样品分别单独进行广泛靶向代谢组学和脂质组学分析，未进行混合。对于宏基因组测序，每个处理内的6个样品各取等量等分混合，每个处理生成一个混合样本。所有等分样品转移至无菌离心管中，于−80°C保存待分析。
【数据】猪肉部位：五花肉；辅料：烤米粉10%（w/w）、盐4.5%（w/w）；发酵条件：25°C、28天；接种量：10⁷ CFU/g；生物学重复：6个/组
2.3 代谢组学与脂质组学分析
代谢物提取参照Liu et al.（2025）的protocol，并根据酸肉基质做了小幅调整。简言之，采用甲醇/氯仿/水（1:2:1，v/v/v）双相提取体系同时提取极性代谢物和脂质（Lv et al., 2020）。该双相体系有助于蛋白质沉淀和相分离，已在复杂组织和肉类基质中得到评估和应用（Bischof et al., 2023; Lin et al., 2007; Zhou et al., 2021）。具体步骤：准确称取0.05 g酸肉样品，与500 mg玻璃珠混合于离心管中。加入200 μL预冷甲醇（−80°C放置3小时），于4°C涡旋10分钟。随后依次加入400 μL氯仿和200 μL超纯水，充分涡旋10分钟。混合物于4°C、10,000 × g离心10分钟，收集双相提取液。收集的代谢物样品经0.22 μm有机相滤膜过滤。极性代谢物经冷冻干燥，脂质代谢物经氮气吹干。两种代谢物样品保存于−80°C，用于后续检测分析。
广泛靶向代谢组学在API 5500 Qtrap质谱仪（AB SCIEX，Framingham，美国）上进行，配备Amide XBridge HPLC色谱柱（4.6 × 100 mm，3.5 μm）（Waters，Milford，美国），色谱和质谱条件参照Yuan et al.（2012）。脂质组学检测参照Xuan et al.（2018）的方法，使用同一台仪器，配备Acquity UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm；Waters，Milford，美国）。代谢物的变化趋势以峰强度表示。
【数据】样品量：0.05 g；玻璃珠：500 mg；甲醇：200 μL（−80°C预冷3h）；涡旋：4°C、10min；氯仿：400 μL；超纯水：200 μL；离心：4°C、10,000 × g、10min；滤膜：0.22 μm有机相
2.4 DNA提取与Illumina测序
待分析样品低温提交至北京百迈客生物科技有限公司进行DNA提取和Illumina测序。使用Power Soil® DNA提取试剂盒（MO BIO Laboratories，San Diego，CA，美国）按照制造商说明书提取总基因组DNA。DNA浓度和纯度使用NanoDrop 2000分光光度计（NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，美国）评估，DNA完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳验证。对于高质量DNA样品，使用Covaris M220超声破碎仪（Covaris，美国）进行片段化。随后使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq建库试剂盒（Bio Scientific，Austin，TX，美国）构建测序文库，包括末端修复、接头连接、文库纯化和质量检测，最后在Illumina NovaSeq平台（Illumina，San Diego，CA，美国）上完成测序。
【数据】DNA提取试剂盒：Power Soil® DNA kit；质量检测：NanoDrop 2000 + 1%琼脂糖凝胶电泳；片段化：Covaris M220；建库试剂盒：NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq kit；测序平台：Illumina NovaSeq
2.5 基因预测与功能注释
首先，使用Trimmomatic v0.33对原始读段进行质量修剪以生成高质量clean tags，随后使用Bowtie 2 v2.2.4比对至宿主基因组以去除宿主来源序列。每个混合宏基因组样本的宿主过滤读段分别使用MEGAHIT v1.1.2的迭代多k-mer策略进行组装（--k-min 47，--k-max 97，--k-step 10；k = 47、57、67、77、87和97）。该迭代k-mer范围用于在较小k-mer下恢复低覆盖度序列与较大k-mer下获得更高组装特异性之间取得平衡，并一致应用于两个混合样本。组装结果使用QUAST v2.3评估，编码区使用MetaGeneMark v3.26（http://exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi）在默认设置下预测。冗余序列通过CD-HIT v4.6.6软件（http://www.bioinformatics.org/cdhit/）以95%序列一致性和90%覆盖度阈值去除。最终的非冗余基因集用于后续物种组成和功能注释分析。非冗余基因使用Diamond（v0.9.24）通过BLASTP（v2.6.0）算法比对至非冗余蛋白（NR）数据库和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库。物种基于NR关联的分类信息进行分配，群落在门、属和种水平上进行汇总。基因功能注释、KEGG直系同源（KO）编号及涉及的生化代谢通路通过与KEGG数据库比对确定。
【数据】质控软件：Trimmomatic v0.33；宿主去除：Bowtie 2 v2.2.4；组装：MEGAHIT v1.1.2（k = 47–97，step 10）；评估：QUAST v2.3；基因预测：MetaGeneMark v3.26；去冗余：CD-HIT v4.6.6（95%一致性、90%覆盖度）；比对：Diamond v0.9.24 + BLASTP v2.6.0
2.6 统计分析
CK 28组与Sc 28组之间的比较采用双尾独立样本Student's t检验，在SPSS 26.0（IBM Corp.，Armonk，NY，美国）中完成，p < 0.05视为具有统计学显著性。多变量分析（包括主成分分析PCA、偏最小二乘判别分析PLS-DA和相关分析）使用MetaboAnalyst 6.0在线平台进行。PLS-DA模型采用分层五折交叉验证重复100次评估，模型复杂度基于Q2采用一倍标准误规则选择。精确置换检验采用留一交叉验证进行，预处理在每个训练折内完成。功能富集分析使用KEGG数据库进行。热图使用TBtools v2.056生成。GraphPad Prism 10.1.1和OriginPro 9.0（OriginLab Corp.，Northampton，MA，美国）用于数据可视化。差异代谢物和差异脂质基于t检验筛选。
【数据】统计方法：双尾独立样本t检验；软件：SPSS 26.0；显著性阈值：p < 0.05；多变量分析平台：MetaboAnalyst 6.0；交叉验证：五折×100次
研究结果
3.1 接种发酵对酸肉广泛靶向代谢组学的影响
为表征与发酵剂接种相关的小分子代谢物谱，对CK 28和Sc 28样品进行了广泛靶向代谢组学分析。该分析在酸肉基质中共鉴定和注释了238种小分子代谢物（图1A）。
PCA得分图显示，接种组（Sc 28）与对照组（CK 28）之间存在分离，且各组内部聚集良好（图1B）。这一模式提示LXPSC1接种与酸肉整体代谢谱的差异相关。为可视化两组发酵之间的判别并识别导致组间分离的变量，进行了PLS-DA分析。双组分代谢组学PLS-DA模型得出R²Y为0.990，平均交叉验证Q²为0.878。精确置换检验显示，观测到的Q²显著高于标签重排后所得值（p = 0.0022；图S1）。以VIP值>1为一般筛选标准，共筛选出70种差异代谢物（DMs），包括34种有机酸及其衍生物和14种核苷、核苷酸及其类似物（表S3）。有机酸及其衍生物是VIP筛选代谢物中注释类别最大的类群。
由于氨基酸相关代谢物可能是重要的风味前体，因此对其进行了更细致的分析。在70种DMs中，有8种满足VIP > 2的更严格标准，被归类为核心差异代谢物（core DMs），包括瓜氨酸、谷胱甘肽、腺苷、鸟苷、DL-哌啶酸、色氨酸、半胱氨酸和胞苷（图1C和D）。这些核心DMs与氨基酸、核苷酸及氧化还原相关代谢有关，因此被纳入后续通路解析。
与CK 28组相比，Sc 28组多种氨基酸及其衍生物以及若干核苷酸相关代谢物的相对丰度较低。这些变化可能反映了发酵过程中的代谢转化、前体可利用性改变和下游代谢利用。在受影响的氨基酸中，色氨酸及其他几种氨基酸相对丰度的降低可能反映了发酵过程中的多种代谢途径。支链氨基酸和芳香族氨基酸可进入Ehrlich途径——先经转氨作用转化为相应α-酮酸，再经脱羧生成醛，最后还原为高级醇（HazelwoodLucie, Daran, van Maris Antonius, PronkJack, & Dickinson, 2008）。此外，色氨酸在酿酒酵母中还可进入犬尿氨酸途径，生成犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸和3-羟基邻氨基苯甲酸等代谢物，参与喹啉酸形成和从头NAD⁺生物合成；犬尿氨酸也可作为犬尿喹啉酸的前体（Groth et al., 2022; Janevska et al., 2024）。本课题组此前利用同一发酵实验样品的研究显示，3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇仅在接种组中检出，且第28天总酯含量为对照组的4.36倍（Lv et al., 2023）。这些已发表观察结果与同一发酵体系中氨基酸来源高级醇和酯类的形成一致，为本研究观察到的代谢物差异提供了背景支持。
谷胱甘肽和半胱氨酸相对丰度的降低可能与谷胱甘肽和含硫氨基酸代谢的变化有关。已有研究表明，酿酒酵母可参与谷胱甘肽分解代谢和挥发性硫化合物前体的释放（Cordente et al., 2015; Svedlund et al., 2025）。腺苷、鸟苷和胞苷相对丰度的降低可能与发酵过程中核苷酸补救途径及其他核苷酸相关代谢过程的变化有关（Crowe et al., 2024）。瓜氨酸与精氨酸相关代谢有关，而DL-哌啶酸是一种与赖氨酸分解代谢和相互转化相关的环状非蛋白氨基酸。Fei et al.（2024）报道，在酿酒酵母发酵椰子水7天后，哌啶酸显著下降并变得不可检测。尽管样品基质与酸肉不同，但该发现提示哌啶酸可能对酿酒酵母相关食品发酵具有响应性。在本研究中，Sc 28组DL-哌啶酸相对丰度的降低可能反映了接种LXPSC1后赖氨酸周转的改变或微生物利用的增加。
总体而言，这些变化提示Sc 28组中氨基酸、核苷酸和氧化还原相关代谢物库发生了再分配。不同加工条件下酸肉发酵过程中的氨基酸、有机酸和其他非挥发性代谢物变化也已有报道。Wang et al.（2022）表明减盐改变了酸肉的微生物群落、代谢物组成和风味特征，而Yang et al.（2025）在传统耿马酸肉中鉴定了微生物群落与非挥发性代谢物之间依赖发酵阶段的关系。在本研究中，Sc 28组多种氨基酸和核苷含量较低，而Wang et al.（2022）报道低盐发酵条件下几种支链氨基酸水平升高。这一对比提示代谢物响应可能取决于发酵条件、发酵剂和发酵阶段。
【数据】检出代谢物总数：238种；VIP>1差异代谢物：70种（含34种有机酸及衍生物、14种核苷/核苷酸/类似物）；VIP>2核心差异代谢物：8种（瓜氨酸、谷胱甘肽、腺苷、鸟苷、DL-哌啶酸、色氨酸、半胱氨酸、胞苷）；PLS-DA模型：R²Y=0.990，Q²=0.878；置换检验：p=0.0022；总酯含量倍数：4.36倍（Sc 28 vs CK 28）
3.2 接种发酵对酸肉脂质组学的影响
脂质氧化和水解是发酵肉制品风味形成的核心通路。基于LC-MS脂质组学分析，在酸肉中共推定注释了535种脂质。酸肉中磷脂（主要为磷脂酰胆碱PC和磷脂酰乙醇胺PE）是主要组分，同时含有二酰甘油（DG）和神经酰胺（Cer）（图2A）。
大量研究表明，甘油磷脂和鞘脂代谢通路在肉制品加工过程中占主导地位（Fu et al., 2025; Guo et al., 2022）。PC和PE是猪肉中丰富的膜磷脂，在发酵过程中可能发生酶促重塑，产生溶血磷脂和游离脂肪酸（H. Liu, Liu, et al., 2023）。释放的不饱和脂肪酸可随后参与脂质氧化反应，产生醛类、酮类、醇类和有机酸等有助于发酵肉风味的化合物。同时，游离脂肪酸也可作为酯化反应的前体，促进挥发性酯类的形成。因此，PC、PE、DG和鞘脂谱中观察到的变化表明，LXPSC1相关的脂质重塑可能影响香气前体的生成，并促进酸肉风味的复杂性。
此外，在VIP > 2严格阈值的核心差异脂质中（图2H），鞘脂类（SP）如HexCer 32:2-4和Cer 36:3-3在Sc组中的含量显著高于CK组（P < 0.001）。PCA和PLS-DA分析均显示接种组（Sc 28）与对照组（CK 28）之间的脂质组成存在显著差异（图2B和C）。三组分脂质组学PLS-DA模型得出R²Y为0.999，平均交叉验证Q²为0.989，精确置换检验支持观察到的组间分离（p = 0.0022；图S2）。通过载荷图（图2D）检查了对样品差异贡献最大的脂质分子。如图2E所示，共有219种脂质分子满足VIP > 1的标准，是造成两组差异的主要因素。
【数据】推定注释脂质总数：535种；VIP>1差异脂质：219种；PLS-DA模型：R²Y=0.999，Q²=0.989；置换检验：p=0.0022；HexCer 32:2-4和Cer 36:3-3：Sc组显著高于CK组（P < 0.001）
（注：由于原文节选在3.2节后即截断，后续宏基因组结果和整合分析部分未在原文节选中完整呈现。以下内容基于原文摘要和结论中已明确提供的信息进行忠实翻译。）
3.3 接种发酵对酸肉宏基因组学特征的影响（基于摘要和结论信息）
基于宏基因组测序分析，Sc 28组中清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）和戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）的相对丰度较高，而热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）的相对丰度较低。功能注释表明，两组在碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂质代谢潜力方面存在差异。
【数据】Sc 28组：清酒乳杆菌↑、戊糖乳杆菌↑、热杀索丝菌↓（具体数值原文节选未详述）
讨论与解读
本研究整合shotgun宏基因组学、广泛靶向代谢组学和脂质组学，系统表征了酿酒酵母LXPSC1接种酸肉发酵28天后的微生物和代谢特征。代谢组学检出238种小分子代谢物，其中70种VIP > 1，8种核心代谢物（VIP > 2）在Sc 28组中大多丰度较低。脂质组学检出535种推定注释脂质，其中219种VIP > 1；值得注意的是，二酰甘油占Sc 28组总脂质丰度的28.02%。宏基因组分析显示清酒乳杆菌和戊糖乳杆菌相对丰度升高、热杀索丝菌相对丰度降低，且碳水化合物、氨基酸、核苷酸和脂质代谢相关基因的相对丰度存在差异。总体而言，LXPSC1接种与微生物组成、群落水平代谢功能潜力、小分子代谢物和脂质谱的协同变化相关。这些发现将此前观察到的表型差异与候选微生物和代谢通路联系起来。这些通路关系应视为基于终点多组学关联和宏基因组功能注释的假设，需要通过靶向定量和功能实验进一步验证。
编译者解读
该研究的多组学整合策略值得关注——同一套发酵样品同时走代谢组、脂质组和宏基因组三条分析线，避免批次差异干扰。DG占总脂质28.02%这一数字尤为亮眼，指向接种酵母可能通过调控脂质水解重塑风味前体库。不过，宏基因组每组仅一个混合样本的设计限制了群落差异的统计推断力；多组学关联也停留在相关性层面。后续若能对关键通路（如Ehrlich途径、脂肪酸β-氧化）做靶向代谢物定量和体外酶活验证，将大幅提升因果推断的可信度。
参考来源
Wang S. Microbial and flavor-related metabolic changes in sour meat inoculated with Saccharomyces cerevisiae LXPSC1: An integrated multi-omics study. Food Bioscience, 2026.
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109865
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109865