来源：Transcriptomic profiling and functional validation of genomic traits in the food-grade bacterium Bacillus subtilis Tamang isolated from kinema（Gene Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
Kinema是东喜马拉雅地区传统发酵大豆食品，枯草芽孢杆菌是其核心发酵菌株。本研究以分离自kinema的新型菌株B. subtilis Tamang（BST）为对象，通过RNA-seq转录组分析揭示573个高表达基因，覆盖维生素合成、纤维蛋白溶解酶、GABA及L-天冬酰胺酶等功能通路，并通过体外实验和分子对接验证其治疗潜力。研究发现BST来源叶酸与癌症靶点BCL-2和KRAS G12C的结合能优于FDA批准药物obatoclax和sotorasib，提示该食品级菌株具有值得关注的健康应用前景。
研究背景
食品发酵在人类饮食文化中历史悠久。Kinema是一种粘性质地、具有鲜味的自然发酵大豆食品，流行于印度、尼泊尔和不丹的东喜马拉雅地区，传统上由Limboo社区制作。Kinema因发酵过程中微生物产生的丰富初级和次级代谢产物而具有抗肥胖、抗氧化、抗炎和抗糖尿病等潜在健康益处。在自发发酵过程中，多种微生物共存，但枯草芽孢杆菌是亚洲发酵大豆食品及kinema中最优势的细菌。BST菌株最初分离自自然发酵的kinema，全基因组分析显示其不含任何毒力基因和抗菌素耐药基因，同时含有与益生特性、维生素生物合成相关的基因。然而，基因组研究虽能提供全面的基因挖掘信息，却无法反映基因在特定条件下的实时表达情况。本研究通过整合计算机模拟与体外实验，验证BST的功能基因组潜力，阐明该分离株的代谢影响与治疗相关性。
研究方法
细菌培养准备
先前分离并鉴定的BST菌株取自印度锡金大学食品微生物学与组学实验室。将保存于甘油储备中的菌株复苏，并在营养肉汤培养基（Cat. No. LQ071, Himedia, Mumbai, India）中于37°C培养24小时，检查其生长情况（A600 = 0.08–0.1）和纯度。确认后，将BST进一步接种到营养肉汤中，于37°C培养24小时，制备用于总RNA分离的培养物。
【数据】培养基：营养肉汤（Himedia LQ071）；温度：37°C；时间：24h；OD600：0.08–0.1
总RNA分离
使用RNeasy Mini Kit（Cat. No. 74104, Qiagen, Hilden, Germany）按照制造商说明书从BST分离株中提取总RNA。简要步骤如下：将细菌培养物以10,000 ×g离心15分钟收集细胞团（沉淀）。沉淀用PBS（10 mM，pH 7.4）温和洗涤三次；随后，用RNA提取试剂盒提供的RLT、EW和RPE缓冲液处理沉淀。向RNeasy旋转柱膜上直接加入30–50 μL无RNase水洗脱RNA，并离心柱子。最后进行DNase I处理以去除残留基因组DNA。使用NanoDrop分光光度计（Eppendorf Bio-Spectrometer® basic, Eppendorf, Germany）评估提取总RNA的浓度和纯度，以A260/280比值约2.00作为质量阈值。技术上，总RNA以三重复分离，但以等摩尔浓度合并，取单一代表性样本进行后续文库构建和测序；合并样本的RNA测序也被证明能有效评估多个样本间的基因表达谱。
【数据】离心：10,000 ×g，15min；PBS：10mM，pH 7.4；洗脱体积：30–50 μL；A260/280：~2.00；重复：三重复合并
文库构建与RNA测序
使用QIAseq® FastSelect™ RNA Library Kit（QIAGEN）按照制造商说明书制备RNA-seq文库。采用FastSelect技术从提取的总RNA中去除rRNA。所得mRNA被逆转录为cDNA。获得的cDNA进一步转化为双链cDNA，并与含有独特双索引（UDIs）的Illumina兼容接头连接。随后，文库通过PCR扩增，并在Illumina NGS系统上使用NovaSeq™ 6000平台（Illumina, San Diego, California, USA）进行测序。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq 6000；文库构建试剂盒：QIAseq FastSelect RNA Library Kit
生物信息学分析
#### 转录组分析
首先，使用FastQC v.0.12.1检查原始转录组数据的质量，并以BST的转录组与同物种参考转录组——枯草芽孢杆菌亚种subtilis str. 168（Accession: SRX29725277）创建比较样本集。使用Trimmomatic v.0.36修剪转录组读段中的低质量读段和接头序列。修剪后，使用Bowtie2 v.2.3.2将样本集中高质量过滤的转录组读段比对到BST基因组（Accession: PRJNA1074556）。使用Cufflinks v.2.2.1组装比对后的转录本。使用Cuffdiff v.2.2.1以默认参数（|log2(Fold Change)| > 1，p值<0.05）对组装的转录本进行差异基因表达分析。使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库映射高表达基因涉及的代谢通路。
【数据】比对工具：Bowtie2 v.2.3.2；差异分析：Cuffdiff v.2.2.1；阈值：|log2FC|>1，p<0.05
#### BST转录组与BST基因组比较
本研究聚焦于利用转录组分析验证BST菌株的基因组背景。取先前发表的同一分离株的全基因组数据（NCBI Accession号：PRJNA1074556）与其转录组对应数据进行比较，研究Tamang等人先前报道的多个基因的实时表达谱。转录组分析揭示了整个基因组谱中实际发现高表达、支撑多种细胞和功能属性的基因数量。此外，在基因组分析中最初被认为活跃但实际表达较低的基因，也通过转录组分析得以揭示和重新确认。
【数据】参考基因组：PRJNA1074556；参考转录组：SRX29725277
#### 统计分析
所有统计分析使用古生物学统计软件包PAST 4.11.0版本进行。GraphPad Prism v8.0.2用于通过散点图可视化差异基因表达。
【数据】统计软件：PAST 4.11.0；可视化：GraphPad Prism v8.0.2
BST治疗潜力评估（体外）
#### 纤维蛋白溶解活性
采用Kharnaior等人描述的血纤维蛋白平板法检测BST的纤维蛋白溶解活性，孔周围透明圈的形成指示阳性结果。
【数据】方法：纤维蛋白平板法；阳性指标：透明圈形成
#### γ-氨基丁酸（GABA）筛选
采用Villegas等人描述的方法测定BST的GABA产生能力。简要步骤为：将2 μL无细胞上清液（CFS）点样于用硅胶60 F254（Merck Millipore, Germany）制备的薄层色谱（TLC）板上，TLC板上的斑点指示阳性结果。
【数据】CFS用量：2 μL；TLC板：硅胶60 F254
#### 胆固醇去除
按照Ragul等人的方法评估BST的胆固醇去除能力：将新鲜培养物接种于添加0.3%牛胆盐和胆固醇（10 mg/mL）的营养肉汤中，于37°C培养24小时，随后使用邻苯二甲醛法在550 nm处定量。
【数据】牛胆盐：0.3%；胆固醇：10 mg/mL；温度：37°C；时间：24h；检测波长：550nm
#### 抗氧化活性
采用El Euch等人描述的DPPH自由基清除法测定抗氧化活性。简要步骤为：将CFS加入DPPH溶液（0.2 mM），于37°C孵育24小时，在524 nm处测量清除活性。清除活性计算公式如下：
DPPH清除活性% =（A空白 − A样品）/ A空白 × 100
其中，A空白 = 对照（阴性反应）的吸光度；A样品 = 测试样品的吸光度。在进行体外实验时，以B. subtilis Ki52作为比较菌株评估BST菌株的治疗潜力。
【数据】DPPH浓度：0.2 mM；温度：37°C；时间：24h；检测波长：524nm；计算公式：清除率% = (A空白−A样品)/A空白×100
分子对接
BST的转录组分析揭示了主要参与初级代谢物生物合成基因的高表达。转录组学研究不能直接检测次级代谢物，因为次级代谢物不参与核心代谢途径。在初级代谢物中，维生素在多种细胞过程中发挥重要作用。因此，选择维生素作为后续研究目标。选择维生素作为测试配体，探索其与致癌蛋白的可能相互作用，并了解营养来源化合物如何在生物信息学框架内与致癌蛋白的活性位点结合。
#### 对接靶点选择
选择两种致癌蛋白BCL-2和KRAS G12C进行分析。从RCSB PDB数据库检索BCL-2（PDB ID: 4MAN）和KRAS G12C（PDB ID: 6OIM）的晶体学3D结构。BCL-2蛋白全长包含161个氨基酸残基，KRAS G12C包含166个氨基酸残基。
【数据】BCL-2：PDB 4MAN，161个氨基酸残基；KRAS G12C：PDB 6OIM，166个氨基酸残基
#### 配体3D结构制备
从PubChem数据库以SDF格式下载配体的3D结构。随后，向配体结构添加氢原子，并使用Avogadro软件对结构进行几何优化。
【数据】配体来源：PubChem数据库；结构优化：Avogadro软件
研究结果
RNA序列统计
BST和枯草芽孢杆菌亚种subtilis str. 168原始转录组序列的质量评估显示，分别共有41,407,491和17,728,480个读段，平均读长为126 bp，GC含量>60%。去除测序接头和低质量读段后，平均获得28,048,855个过滤读段，其中>96%的读段q值≥30，表明数据质量整体较高。转录本与参考基因组之间的比对效率为90.34%。使用选定阈值标准（p<0.05且|logFC|>1），相对于所选参考数据集（即枯草芽孢杆菌亚种subtilis str. 168），共有573个基因显示较高表达水平，52个基因显示较低表达水平，为整体转录模式和功能相关基因提供了初步见解。表达的功功能基因通过散点图进一步可视化（图1a）。
【数据】BST总读段数：41,407,491；参考菌株总读段数：17,728,480；平均读长：126bp；GC含量：>60%；过滤后平均读段：28,048,855；Q30比例：>96%；比对效率：90.34%；高表达基因：573个；低表达基因：52个
基因表达谱及BST基因组与BST转录组比较分析
#### 基因表达谱
BST转录组与参考转录组的差异表达分析揭示了涉及维生素合成、酶合成、益生活性等多种功能基因的表达（图1b）。这些基因在不同代谢途径中发挥重要作用，并与益生活性和应激耐受性相关。负责纤维蛋白溶解酶（aprX、htrA、htrB、isp）和γ-聚谷氨酸（gltB、gltX）合成的基因高表达，提示其在纤维蛋白降解和与γ-PGA生物合成相关的谷氨酸代谢中的作用。多个维生素生物合成基因显示较高表达水平，即bioI、accB、accC、bioY、bioB（生物素），ribBA、ribD、ribE、ribT、ribZ、ribH（核黄素），ykoF、thiN、thiT、thiL（硫胺素），coax、coaA（泛酸），btuF（维生素B12），folD、folE、folC（叶酸），以及menB、hepS、menA（维生素K2）；而ribF、panC、btuD、menG、hepT表达较低。产生γ-氨基丁酸（GABA）的gabP基因高表达，倍数变化为+5.89。负责L-天冬酰胺酶活性（ansA、ansZ、sacC）的基因高表达，倍数变化分别为+6.03、4.62、5.74。此外，负责酸耐受（atpC、atpB、atpD、clpE、groL、luxS）、胆盐耐受（fabI、fabF、nagB）、经口胃肠存活（hrcA、msrB、clpE）和应激耐受（cspB、cspC）的基因均高表达，表明BST具有显著的健康益处和治疗潜力。基于KEGG数据库的途径特异性表达谱分析揭示了与不同生物活性化合物生物合成相关的基因表达，如维生素（叶酸、生物素、维生素B12、核黄素）和L-天冬酰胺酶活性（图2）。
【数据】gabP基因倍数变化：+5.89；ansA倍数变化：+6.03；ansZ倍数变化：+4.62；sacC倍数变化：+5.74
#### 比较分析
BST菌株的全基因组分析一次性呈现了其完整基因组谱；然而，转录组分析揭示了同一基因组的实时表达谱。例如，全基因组分析中检测到共6个负责纤维蛋白溶解活性的基因，但转录组分析中仅发现其中4个（即aprX、htrA、htrB和isp）高表达。在全基因组检测到的所有γ-PGA合成基因中，仅gltB和gltX显示较高表达，而racE观察到较低表达谱。检测到的负责蛋白酶活性的基因为clpE、clpX、clpP、clpY、clpQ、ftsH、bepA、ctpA、ctpB、wprA、gpr、lon1、lom2、mroQ、epr、vpr、nprB、htpX、prsW、yraA、ydeA、albF、yabG；但转录组分析确认仅clpE、ftsH、ctpA、ctpB、wprA、vpr、nprB、htpX、prsW、yraA和yabG表达。基因组中检测到共13个负责酯酶活性的基因，但仅estB、besA、cheB、yxim、yhaO、yjcG高表达，未观察到低表达基因。在全基因组检测到的与淀粉酶、脂肪酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性相关的所有基因中，仅amyE（淀粉酶）、ytpA和lipC（脂肪酶）、ganA（β-半乳糖苷酶）以及gmuD和bglA（β-葡萄糖苷酶）高表达。负责不同维生素生物合成（包括生物素、核黄素、硫胺素、泛酸、叶酸和维生素K2合成）的基因在基因组中广泛分布。转录组学分析显示关键基因bioI、accB、accC、bioB、bioY、ribD、ribE、ribH、ribT、ribZ、ykoF、thiN、thiT、thiL、coaX、coaA、folD、folC、folE、menB、hepS、menA有表达，而ribF、panC、menG、hepT等基因表达较低。另一方面，基因组水平鉴定到多个与抗炎活性、抗糖尿病活性、烟酰胺合成、吡哆醇合成、脂肪酸生物合成相关的基因，但在实验条件下其表达未在转录组分析中出现。
【数据】纤维蛋白溶解基因：基因组6个→转录组高表达4个（aprX、htrA、htrB、isp）；γ-PGA合成基因：仅gltB、gltX高表达，racE低表达；蛋白酶基因：23个检出→11个表达；酯酶基因：13个检出→6个高表达
#### 高表达基因的体外验证：治疗潜力洞察
对BST菌株进行体外评估以验证转录组分析检测到的基因表达谱。基于BST转录组的基因表达谱，选择了发酵大豆制品或其发酵微生物的四种广泛声称的治疗属性：纤维蛋白溶解活性、GABA生物合成、降胆固醇活性和抗氧化潜力。BST和B. subtilis Ki52均表现出相似的纤维蛋白溶解活性和GABA合成能力；然而，BST的胆固醇降低活性和抗氧化活性显著高于B. subtilis Ki52（p<0.05）（表1）。
【数据】纤维蛋白溶解活性：BST与Ki52相似；GABA合成：BST与Ki52相似；胆固醇降低活性：BST显著高于Ki52（p<0.05）；抗氧化活性：BST显著高于Ki52（p<0.05）
#### 分子对接分析
基于转录组分析选择维生素相关生物活性化合物作为分子对接的配体，该分析揭示了参与叶酸、核黄素、生物素、硫胺素和维生素K2生物合成基因的高表达。FDA批准的抑制剂obatoclax（针对BCL-2）和sotorasib（针对KRAS G12C）作为参考化合物进行比较。位于pocket 1和pocket 2的活性位点残基存在于靶蛋白的C末端。对于BCL-2蛋白，pocket 1包含总共12个氨基酸残基，而pocket 2包含总共8个氨基酸残基。相比之下，KRAS G12C蛋白的pocket 1包含37个氨基酸残基。在对接研究中，每种配体产生多个构象，结合能范围为−9.4至−5.1 kcal/mol。在测试化合物中，叶酸与BCL-2和KRAS G12C蛋白均显示出最强的结合亲和力和最稳定的相互作用。叶酸与BCL-2和KRAS G12C蛋白的结合能分别为−7.9 kcal/mol和−9.4 kcal/mol（图3a,c），高于相应的FDA批准参考药物obatoclax（−7.1 kcal/mol）和sotorasib（−7.0 kcal/mol）（图3b,d）。总之，这些观察到的相互作用由氢键和疏水相互作用稳定，表明叶酸具有进一步评估的能力。
【数据】结合能范围：−9.4至−5.1 kcal/mol；叶酸-BCL-2：−7.9 kcal/mol；叶酸-KRAS G12C：−9.4 kcal/mol；obatoclax-BCL-2：−7.1 kcal/mol；sotorasib-KRAS G12C：−7.0 kcal/mol；BCL-2 pocket 1：12个氨基酸残基；BCL-2 pocket 2：8个氨基酸残基；KRAS G12C pocket 1：37个氨基酸残基
#### 蛋白质-配体相互作用分析
配体与蛋白质之间的相互作用分析显示，对照药物obatoclax与BCL-2共形成5个疏水相互作用（PHE63、VAL92、LEU96、ALA108、PHE…），而叶酸与BCL-2之间的相互作用模式与之不同。分子动力学模拟进一步评估了蛋白质-配体复合物的稳定性。
【数据】obatoclax疏水相互作用：5个（PHE63、VAL92、LEU96、ALA108等）；分子动力学模拟时长：200 ns
讨论与解读
多项研究利用基于DNA的方法研究了芽孢杆菌属的基因组学，如全基因组测序。全基因组分析提供微生物基因组中全部基因的见解，而转录组学分析揭示特定条件下实时转录的基因。先前BST的全基因组分析揭示了多个功能基因的存在。本研究探讨了BST的基因表达谱，并预测了维生素与参与肿瘤发生的受体之间的结合构象，提供了分子相互作用和潜在生物学相关性的见解。此外，枯草芽孢杆菌亚种subtilis 168是枯草芽孢杆菌注释最完善的参考菌株，且具有公开可访问的数据集。泛基因组分析显示BST与枯草芽孢杆菌亚种subtilis 168之间的平均核苷酸一致性（ANI）为98.23%。因此，使用枯草芽孢杆菌亚种subtilis 168的转录组作为参考进行BST菌株的比较转录组分析。该参考转录组数据集是在对照实验条件下生成的，因此差异表达基因被视为初步发现。测序前的样本合并也降低了实验成本造成的阻碍，为额外实验提供了空间。
【编译者解读】本研究展示了食品微生物功能挖掘的完整闭环——从基因组预测到转录组验证再到体外功能确认，最后以分子对接探索健康应用边界。BST菌株作为GRAS级食品微生物，其叶酸合成能力与癌症靶点蛋白的强结合值得关注，但需清醒认识到，分子对接仅为计算预测，体内抗肿瘤活性仍需动物实验和临床研究证实。该技术路线为传统发酵食品中功能菌株的系统评估提供了可复用的方法论范本。
参考来源
期刊：Gene Reports, 2026
DOI: 10.1016/j.genrep.2026.102608
DOI: 10.1016/j.genrep.2026.102608