来源：Multi-dimensional metabolic engineering and enzyme engineering in Escherichia coli for highly efficient biosynthesis of 2,5-furandicarboxylic acid（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
2,5-呋喃二甲酸（FDCA）是生物基塑料等重要工业品的核心单体，但其微生物合成长期受限于底物5-羟甲基糠醛（HMF）的细胞毒性。本研究以大肠杆菌为宿主，通过代谢工程与蛋白质工程的多维度组合策略——包括基因组合优化、拷贝数调控、RBS工程、辅因子再生以及转运蛋白改造——成功构建了高效FDCA合成菌株。最终在5-L发酵罐中实现170.72 mM（26.65 g/L）FDCA产量，摩尔得率高达94.8%。该研究为FDCA的工业化生物制造提供了可行平台。
研究背景
FDCA是生物质衍生化学品中附加值最高的品种之一，被视为精对苯二甲酸的重要生物基替代品。作为平台化合物，FDCA主要用于生产聚呋喃二甲酸乙二醇酯（PEF），该材料碳足迹更低且可回收性更强。传统FDCA生产依赖HMF的化学氧化，通常涉及有机溶剂和贵金属催化剂，反应条件苛刻、成本高昂，无金属催化工艺的开发仍具挑战。相比之下，生物催化虽然存在产率低、反应时间长等不足，但条件温和、选择性高、环境友好、成本较低，是一条绿色可持续的替代路线。现有FDCA生物合成研究多集中于全细胞或酶催化级联反应，酶催化虽具有稳健性强、产物特异性高、生产效率高等优势，但仍面临底物毒性、中间产物积累等瓶颈。
研究方法
2.1 化学试剂、菌株与质粒
HMF、2,5-二甲酰呋喃（DFF）、HMFCA、FFCA、FDCA、NAD⁺和FAD均购自上海麦克林生化科技有限公司。除另有说明外，所用其他试剂均为分析纯。本研究所用菌株、质粒及引物详见补充材料。E. coli DH5α用于质粒构建与保藏。
【数据】试剂来源：Macklin Biochemical Co., Ltd.（上海）；菌株：E. coli DH5α
2.2 培养基
Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）用于质粒扩增。Terrific Broth（TB）培养基（4 mL/L甘油、12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、72 mM K₂HPO₄、17 mM KH₂PO₄，pH 7.0）用于种子培养。摇瓶发酵培养基含48 g/L酵母提取物、12 g/L胰蛋白胨、10 g/L甘油、1.4 g/L MgSO₄·7H₂O、12 g/L CaCO₃及1 mL/L微量元素溶液。CaCO₃作为缓释中和剂，中和发酵过程中产生的有机酸，将pH维持在近中性范围，从而缓解酸胁迫对细胞生长和关键酶活性的抑制作用。5-L发酵罐用发酵培养基含48 g/L酵母提取物、12 g/L胰蛋白胨、10 g/L甘油、72 mM K₂HPO₄、17 mM KH₂PO₄、1.4 g/L MgSO₄·7H₂O及1 mL/L微量元素溶液。微量元素详细配方见前期研究。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；TB培养基：4 mL/L甘油、12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、72 mM K₂HPO₄、17 mM KH₂PO₄，pH 7.0；摇瓶发酵培养基：48 g/L酵母提取物、12 g/L胰蛋白胨、10 g/L甘油、1.4 g/L MgSO₄·7H₂O、12 g/L CaCO₃；5-L发酵罐培养基：48 g/L酵母提取物、12 g/L胰蛋白胨、10 g/L甘油、72 mM K₂HPO₄、17 mM KH₂PO₄、1.4 g/L MgSO₄·7H₂O
2.3 基因组改造
本研究利用CRISPR-Cas9系统敲除了编码以下蛋白的基因：核苷三磷酸焦磷酸酶（mazG）、长链脂肪酸转运蛋白（fadL）、DedA家族内膜蛋白（yqjA）、内膜整合蛋白（ybjJ）、氨基糖苷/多药外排系统（acrD）、乙醇酸转运蛋白（glcA）、半乳呋喃糖ABC转运蛋白（ytfQ）、C4-二羧酸转运蛋白（dctA）、MFS型多药外排泵（mdtG）以及芳香族氨基酸转运蛋白（aroP）。靶基因的single-guide RNAs（sgRNAs）使用CRISPR RGEN在线工具设计。各靶基因的上、下游同源臂经PCR扩增并融合，生成用于同源定向修复的供体DNA。
【数据】敲除基因：mazG、fadL、yqjA、ybjJ、acrD、glcA、ytfQ、dctA、mdtG、aroP；工具：CRISPR RGEN在线设计平台；供体DNA：上下游同源臂PCR扩增融合
2.4 EcALDH的结构预测与定向进化
EcALDH的结构预测使用AlphaFold2在线工具完成。EcALDH的突变预测通过VenusFactory蛋白质工程AI设计平台进行。将EcALDH的氨基酸序列和结构上传后，设定突变参数，预测并筛选潜在有益突变体以供后续功能验证。酶克隆、表达、纯化、活性测定、动力学测量及酶学表征均按照标准方案执行。分子对接使用AutoDock Vina 1.1.2完成。分子动力学（MD）模拟使用GROMACS（2023.5），力场为AMBER99SB-ILDN，水模型为TIP3P。
【数据】结构预测工具：AlphaFold2；突变设计平台：VenusFactory；对接软件：AutoDock Vina 1.1.2；MD模拟：GROMACS 2023.5 + AMBER99SB-ILDN + TIP3P
2.5 转录组数据分析
从琼脂板上挑取生长良好的野生型E. coli BL21(DE3)和工程菌株MU22，分别接种至TB培养基中。培养12 h后，将种子培养液以1%（v/v）接种量转接至发酵培养基。当OD600达到对数中期时，加入0.2 mM IPTG和150 mM HMF。每8 h取样一次，测定HMF、HMFCA、FFCA和FDCA浓度。随后，将细胞悬液样品在4,000 × g、4 °C条件下离心10 min，液氮速冻后用于后续转录组分析。RNA-Seq实验由GENEWIZ（苏州）完成。
【数据】接种量：1%（v/v）；诱导剂：0.2 mM IPTG；底物：150 mM HMF；取样间隔：8 h；离心条件：4,000 × g、4 °C、10 min
2.6 培养条件
摇瓶培养时，菌株在TB培养基中于30 °C过夜培养。随后取1 mL菌悬液加入含50 mL发酵培养基的摇瓶中继续发酵（30 °C，220 rpm）。当OD600达到对数中期时，加入0.2 mM IPTG和指定浓度的HMF。诱导后每24 h取样进行代谢物分析。补料分批发酵在含1.8 L培养基的5-L发酵罐中进行。FDCA生产菌株接种至TB试管中，过夜培养后以1%（v/v）接种量转接至含200 mL TB培养基的摇瓶中发酵（30 °C，220 rpm，12 h）。发酵罐中种子培养液接种比例为10%（v/v）。接种后用氨水将pH调至7.0，温度维持在30 °C。初始碳源耗尽后，向发酵罐补加500 g/L甘油浓缩液。通过调节搅拌转速（200–800 rpm）和通气速率（1 L/min–4 L/min）将溶氧维持在30%。OD600约为40时，加入0.2 mM IPTG诱导酶表达。稳定0.5 h后，首次加入60 mM HMF。补料分批发酵过程中，发酵罐内甘油浓度维持在较低水平，分别在24、36、48和60 h补加40、40、20和20 mM HMF以维持底物供给。
【数据】摇瓶培养：30 °C、220 rpm、50 mL发酵培养基；IPTG浓度：0.2 mM；发酵罐装液量：1.8 L；接种比例：10%（v/v）；pH：7.0（氨水调节）；温度：30 °C；甘油补料：500 g/L浓缩液；溶氧：30%（转速200–800 rpm、通气1–4 L/min）；诱导OD600：约40；HMF补加方案：初始60 mM，24 h补40 mM、36 h补40 mM、48 h补20 mM、60 h补20 mM
2.7 分析方法
统计分析使用GraphPad Prism 9.0软件进行。动力学参数通过非线性回归拟合米氏方程计算。所有实验均设三次独立重复，结果以平均值±标准差（SD）表示。摇瓶发酵样品在24 h、48 h和72 h采集。FDCA通过酸沉淀结合四氢呋喃萃取从发酵液中分离纯化。HMF、HMFCA、FFCA、DFF和FDCA使用Waters e2695高效液相色谱仪定量，配备Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱（300 × 7.8 mm，9 μm）。柱温、流动相、流速和检测波长分别为45 °C、5 mM H₂SO₄、0.5 mL/min和265 nm。HMF、HMFCA、FFCA、DFF和FDCA的保留时间分别为37.418、23.845、25.008、46.416和18.061 min。
【数据】统计软件：GraphPad Prism 9.0；HPLC：Waters e2695 + Bio-Rad Aminex HPX-87H柱（300 × 7.8 mm，9 μm）；柱温：45 °C；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.5 mL/min；检测波长：265 nm；保留时间：HMF 37.418 min、HMFCA 23.845 min、FFCA 25.008 min、DFF 46.416 min、FDCA 18.061 min
研究结果
3.1 2,5-呋喃二甲酸生物合成途径的构建
HMF强烈抑制微生物生长并限制高密度发酵，但将其快速还原或氧化为醇或羧酸可缓解其细胞毒性。已有研究报道了一系列能高效催化高浓度HMF氧化为呋喃羧酸的新酶。为在大肠杆菌中实现FDCA生物合成，本研究选取了在HMF催化过程中执行不同功能的酶，包括香草醛脱氢酶（KvVDH^A50S/Y370W^和PpVDH）、醛脱氢酶（EcALDH、EcPuuC、EcAldB和PpXOD）、HMFO^Q319K^以及HMFH。构建了不同的单基因表达载体，获得菌株CN01–CN08。添加30 mM HMF发酵48 h后，菌株CN02和CN07分别产生3.20和3.15 mM FDCA（图1A）。
为提高可溶性表达，引入了小泛素样修饰蛋白（SUMO）标签，构建菌株CN09–CN16。融合蛋白SUMO-EcALDH和SUMO-HMFO^Q319K^显著增强了FDCA产量，菌株CN10和CN15的FDCA浓度分别达到7.26和7.98 mM，较对照菌株CN02和CN07分别提高了126.9%和153.3%。然而，FDCA摩尔得率仍然有限（24.2%和26.6%），并观察到中间产物HMFCA和FFCA的积累（图1B）。菌株CN11和CN12也分别产生了1.40和1.23 mM FDCA（图1B）。值得注意的是，表达KvVDH^A50S/Y370W^、PpVDH和SUMO-PpXOD的菌株（CN01、CN06和CN13）未能产生FDCA，但具有较强的HMF利用能力，其HMF转化率分别达到94.3%、54.2%和46.8%，同时伴随大量中间产物HMFCA和FFCA积累（图1A和B）。
工业生产中FDCA生产需要高底物浓度和高转化率。将HMF浓度提高至60 mM后，所有单基因表达菌株（CN01–CN16）均未观察到FDCA产生，表明单基因表达产生的催化能力有限。为探索提高FDCA生物合成的策略，将SUMO-EcALDH、SUMO-HMFO^Q319K^、SUMO-EcPuuC或SUMO-EcAldB分别与KvVDH^A50S/Y370W^、PpVDH或SUMO-PpXOD组合，导入E. coli BL21(DE3)，获得菌株FA01–FA24（图1C）。添加60 mM HMF后，所有菌株在此高浓度HMF下均表现出改善的生长，并能将部分HMF氧化为HMFCA、FFCA、FDCA和DFF。菌株FA07、FA08、FA10、FA11、FA12、FA19、FA22、FA23和FA24在48 h时可检测到明显的FDCA产生，其余菌株未见显著的FDCA积累（图1D）。SUMO-EcALDH与KvVDH^A50S/Y370W^共表达（菌株FA07）获得了最高的FDCA产量（12.72 mM），FDCA得率为21.2%，HMF转化率为65.0%。然而，有限的HMF氧化能力和主要中间产物HMFCA的积累阻碍了FDCA得率的进一步提高（图1D和E）。
随后，将SUMO-HMFO^Q319K^、SUMO-EcALDH、SUMO-EcAldB和SUMO-EcPuuC导入菌株FA07，获得菌株FA25–FA28（图1F）。菌株FA25产生16.80 mM FDCA，FDCA得率达到28.0%，HMF转化率超过99.5%（图1G）。第四个基因的加入可能因基因数量过多导致代谢负担过重，使细胞活力和途径酶活性急剧下降，最终导致FDCA得率显著降低（图1G）。
【数据】30 mM HMF条件下：CN02产3.20 mM FDCA、CN07产3.15 mM FDCA；SUMO融合后：CN10产7.26 mM（+126.9%）、CN15产7.98 mM（+153.3%）；摩尔得率：24.2%和26.6%；HMF转化率：CN01为94.3%、CN06为54.2%、CN13为46.8%；60 mM HMF条件下：FA07产12.72 mM FDCA（得率21.2%、转化率65.0%）、FA25产16.80 mM FDCA（得率28.0%、转化率>99.5%）
3.2 关键限速步骤的鉴定与优化
上述所有菌株的发酵产物分布结果显示，HMF、HMFCA、FFCA、DFF和FDCA主要存在于胞外，而胞内浓度极低可忽略不计。这表明该生物转化体系中的底物摄取、中间产物转运和终产物分泌均表现出快速的跨膜分布特征，无明显胞内代谢物滞留。菌株FA25几乎完全氧化了60 mM HMF，但中间产物HMFCA（28.66 mM）和FFCA（13.49 mM）大量积累，表明HMFCA→FFCA→FDCA途径是FDCA合成的限速步骤（图1G）。
因此，研究实施了精确调控酶表达以匹配代谢通量等策略，有效缓解了限速瓶颈并增强了FDCA合成。首先，通过优化基因组合和连接排列方式，菌株CA09能在48 h内将60 mM HMF氧化产生19.12 mM FDCA，较菌株FA25提高了13.8%（图2A和B）。为平衡代谢通量并增强FDCA合成，系统采用不同拷贝数的质粒（ColE1 ori、CloDF13 ori、p15A ori、RSF ori）调控FDCA合成模块的表达（图2B）。携带中拷贝数质粒（CloDF13 ori）的菌株CA12表现最佳，产生26.76 mM FDCA（图2A）。这些结果表明，适度提高拷贝数可有效提升FDCA产量，但过高的拷贝数会带来代谢负担，损害菌株生长和产物合成。
针对菌株CA12中大量胞外HMFCA积累（23.74 mM）导致FDCA生物合成效率显著降低这一关键瓶颈，进一步优化了RBS序列。使用RBS Library Calculator预测SUMO-EcALDH和SUMO-HMFO^Q319K^翻译起始速率的关键区域，随后对这些关键区域进行饱和突变。采用基于间苯二酚的比色法筛选突变体文库并评估体系中HMF浓度，吸光度越低表示HMF转化率越高。第一轮中，建立了靶向SUMO-EcALDH的RBS饱和突变文库。经96孔板高通量发酵验证后，计算各突变菌株的残余HMF水平和转化率（图2C）。基于这些结果，选取8株菌（RA071、RA032、RA078、RA059、RA118、RA112、RA013和RA129）进行60 mM HMF的摇瓶发酵验证。HPLC结果与高通量筛选结果一致，上述8株菌的FDCA得率均较菌株CA12有所提高。其中，菌株RA071的FDCA得率达到40.16 mM，较对照菌株CA12提高了50.1%（图2D）。
在菌株RA071基础上进一步优化SUMO-HMFO^Q319K^的RBS序列后，96孔板高通量筛选中仅鉴定出8株HMF转化能力增强的阳性菌株（图2E）。将阳性增强菌株（RB076、RB079、RB133、RB039、RB066）进行摇瓶复筛。RB076在48 h时产生高达45.14 mM的FDCA，但仍观察到部分HMFCA积累（12.61 mM），以及痕量FFCA（1.85 mM）和DFF（0.40 mM）（图2F）。具体RBS序列见补充材料。
【数据】FA25中间产物积累：HMFCA 28.66 mM、FFCA 13.49 mM；CA09产19.12 mM FDCA（较FA25提高13.8%）；CA12产26.76 mM FDCA（CloDF13 ori中拷贝质粒）；CA12胞外HMFCA积累：23.74 mM；RA071产40.16 mM FDCA（较CA12提高50.1%）；RB076产45.14 mM FDCA，残余HMFCA 12.61 mM、FFCA 1.85 mM、DFF 0.40 mM
3.3 EcALDH蛋白质工程增强2,5-呋喃二甲酸产量
基于上述发酵产物分布特征，对已构建的FDCA生物合成途径进行了系统分析。结果表明，KvVDH^A50S/Y370W^对HMF具有更高的亲和力和更优的催化效率，能够实现HMF向HMFCA的高效转化。
（原文节选在此处截断）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过将代谢工程与蛋白质工程相结合，在大肠杆菌中建立了一条新型FDCA生物合成途径，有效缓解了限速步骤，实现了高浓度HMF向FDCA的高效合成。通过优化基因连接策略、拷贝数和RBS工程，精确调控了酶表达以匹配途径通量。NAD⁺和FAD辅因子的再生，以及HMFCA外排蛋白AroP的鉴定与敲除，减少了中间产物HMFCA的胞外泄漏，延长了其在胞内的停留时间，从而促进了FDCA合成。在5-L发酵罐中，工程菌株TP09产生了170.72 mM FDCA，摩尔得率达94.8%。未来研究可通过优化后期发酵性能、敲除内源还原酶以及升级发酵和下游纯化工艺，进一步提高FDCA的生物合成效率。
编译者解读
本研究展示了典型的"多维工程"策略在合成生物学中的系统应用——从途经构建、酶工程改造到辅因子再生和转运工程，每一步都有明确的瓶颈对应和数据支撑。尤其值得注意的是，研究者通过转录组学鉴定出芳香族氨基酸转运蛋白AroP参与HMFCA外排，这一发现将中间代谢物转运纳入工程改造靶点，拓展了传统产物合成优化的边界。VenusFactory平台驱动的深度突变筛选结合MD模拟阐明机制，体现了AI辅助酶工程与实验验证的有机结合。但需指出，原文节选在EcALDH突变机制和部分途径构建细节上截断，完整评估仍需查阅全文。该研究为FDCA乃至其他呋喃类化学品的微生物合成提供了可借鉴的系统改造范式。
参考来源
Cui, Y. Multi-dimensional metabolic engineering and enzyme engineering in Escherichia coli for highly efficient biosynthesis of 2,5-furandicarboxylic acid. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134989
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134989